β-溶血性链球菌红霉素耐药特征与大环内酯类耐药基因的分析

６９０　中国抗生素杂志２０１５年９月第４０卷第９期　

文章编号：１００１—８６８９（２０１５）０９－０６９０．０５　

．溶血性链球菌红霉素耐药特征与大环内酯类耐药基因的分析　

黄青　殷俊－　陈曦　马雪娇　刘艳艳：　叶英　，　许夕海　，：，　李家斌　，ｚ　（１安徽医科大学第一附属医院感染病科，－ｆ）Ｅ　２３００２２；２安徽省细菌耐药监测中心，合肥２３００２２）　

摘要：目的　了解安徽地区ｐ－溶血性链球菌大环内酯类耐药基因的携带情况，并与红霉素药敏结果进行对比分析。方　法　对来源于安徽￣２００５－－２０１３年临床分离的６１株ｐ．溶血性链球菌采用琼脂稀释法测定红霉素的最小抑菌浓度（ＭＩＣ），同时　应用ＰＣＲ扩增大环内酯类相关耐药基因。结果　６１株ｐ　溶血性链球菌中Ａ群（Ｇｒｏｕｐ　Ａ　Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ，ＧＡＳ）占２１－３％，Ｂ群（Ｇｒｏｕｐ　Ｂ　Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ，ＧＢＳ）占６８．８％，Ｃ和Ｇ群（Ｇｒｏｕｐ　Ｃ　Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ，ＧＣＳ、Ｇｒｏｕｐ　Ｇ　Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ，ＧＧＳ）共占９．９％，Ａ群及Ｂ群对红霉素　的耐药率较高，分别为７６．９％和８５．７％，携带的耐药基因均以ｅｒｍＣ￣因（７６．９％￣Ｉ］６６．７％）占主导。１株ＧＣＳ对红霉素耐药且只携带　ｅｒｍＢ基因，ＧＧＳ对红霉素的耐药率为６０％，以ｅｒｍＢ￣ｅｒｒｎＣ基因的检出率最高，均为６０％。结论　安徽地区Ｄ一溶血性链球菌的红　霉素耐药率较高，且主要由ｅｒｍ基因介导的重度耐药常见。临床医生应加强耐药监测，依据药敏结果指导用药。　关键词：Ｂ．溶血性链球菌；红霉素；耐药性；耐药基因　中图分类号：Ｒ３７８．１２　文献标志码：Ａ　

Ｔｈｅ　ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｍａｃｒｏｌｉｄｅ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｇｅｎｅ　ａｎｄ　ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ　

ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ａｍｏｎｇ［Ｉ－ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ　ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ　

Ｈｕａｎｇ　Ｑｉｎｇ　，Ｙｉｎ　Ｊｕｎ　，Ｃｈｅｎ　Ｘｉ　，Ｍａ　Ｘｕｅｑｉａｏ　，Ｌｉｕ　Ｙａｎ—ｙａｎ　，Ｙｅ　Ｙｉｎｇ　，－，Ｘｕ　Ｘｉ－ｈａｉ　，　ａｎｄ　Ｌｉ　Ｊｉａ—ｂｉｎ　，　（１　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ，ｔｈｅ　Ｆｉｒｓｔ　Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆＡｎｈｕｉ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｅｆｅｉ　２３００２２；　２　Ａｎｈｕｉ　Ｃｅｎｔｅｒ　Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，Ｈｅｆｅｉ　２３００２２）　

Ａｂｓｔｒａｅｔ　０ｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ａｎｄ　ｍａｃｒｏｌｉｄｅ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｇｅｎｅ　ａｍｏｎｇ　６　ｌ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　３－ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ　ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ（ＢＨＳ）ｓｔｒａｉｎｓ　ｗｈｉｃｈ　ｗｅｒｅ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　Ａｎｈｕｉ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ　ｆｒｏｍ　２００５　ｔｏ　２０　１　３．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｇｅｎｅ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ１．Ｍｉｎｉｍａｌ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　（ＭＩＣｓ）ｏｆ　ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｂｙ　ａｇａｒ　ｄｉｌｕｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ａｍｏｎｇ　ｔｈｅ　３－ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ　Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｉｓｏｌａｔｅｓ，ｇｒｏｕｐ　Ａ　ｔｙｐｅ　ａｃｃｏｕｎｔｅｄ　ｆｏｒ　２１＿３％，ｇｒｏｕｐ　Ｂ　ａｃｃｏｕｎｔｅｄ　ｆｏｒ　６８．８％ａｎｄ　ｇｒｏｕｐ　Ｃ　ｐｌｕｓ　Ｇ　ａｃｃｏｕｎｔｅｄ　ｆｏｒ　９．９％　ｔｏｔａｌｌｙ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｒａｔｅｓ　ｏｆ　ｇｒｏｕｐ　Ａ　ａｎｄ　Ｂ　ｔｙｐｅｓ　ｔｏ　ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ　ｗｅｒｅ　７６．９％ａｎｄ　８５．７％ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ　ｍｏｓｔ　ｃｏｍｍｏｎ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｇｅｎｅ　ｆｏｒ　ｇｒｏｕｐ　Ａ　ａｎｄ　ｇｒｏｕｐ　Ｂ　ｗａｓ　ｅｌｍＣ（７６．９％ａｎｄ　６６．７％　．ＧＣＳ　ｗａｓ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｔｏ　ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ　ａｎｄ　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｂｙ　ｅｒｍＢ．Ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｗａｓ　６Ｏ％ｉｎ　ＧＧＳ．Ｔｈｅ　ｅｒｍＢ（６０％、ａｎｄ　ｅｒｍＣ（６０％）ｇｅｎｅｓ　ｗａｓ　ｔｈｅ　ｍｏｓｔ　ｐｒｅｙａｌｅｎｔ　ｍａｃｒｏｌｉｄｅ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ　ｉｎ　ＧＧＳ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｅ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ　ｏｆ　ＢＨＳ　ｗａｓ　ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ　ｈｉｇｈｅｒ　ｉｎ　Ａｎｈｕｉ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ．Ｔｈｅ　ｅｗｆ￣ｌ　ｏｆｔｅｎ　ｃｏｎｆｅｒｒｅｄ　ｓｅｒｉｏｕｓ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｔｏ　ｅ￣，ｈｒｏｍｙｃｉｎ　ａｎｄ　ｗａｓ　ｆｏｕｎｄ　ｔｏ　ｂｅ　ｔｈｅ　ｍｏｓｔ　ｗｉｄｅｌｙ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ　ｓｈｏｕｌｄ　ｅｎｈａｎｃｅ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ａｎｄ　ａ　ｒｅａｓｏｎａｂｌｅ　ｃｈｏｉｃｅｏｆａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓｎｅｅｄｔｏｂｅｍａｄｅｔｈａｔｂａｓｅｄｏｎ　ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙｔｅｓｔ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ　［３－ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ　ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ；Ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ：Ｄｒｕｇ．ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ；Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｇｅｎｅ　

收稿日期：２０１５－０３．１７　基金项目：安徽省自然科学基金（Ｎｏ．１４０８０８５ＱＨ１７６）　作者简介：黄青，女，生于１９８９年，在读硕士研究生，主要从事细菌耐药机制研究，Ｅ－ｍａｉｌ：１２０７２０８３８１＠ｑｑ．ｇｏｒｅ　通讯作者，Ｅ—ｍａｉｌ：２ｘｈａｉ＠１６３．

ｃｏｍ　Ｂ．溶血性链球菌红霉素耐药特征与大环内酯类耐药基因的分析黄青等　

ｐ一溶血性链球菌（ｐ—ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ　ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ，ＢＨＳ）　是引起咽峡炎、急性扁桃体炎等上呼吸道感染最常　

见的致病菌之一，也可引起其他感染性疾病如脓皮　病、坏死性筋膜炎、脓毒休克综合征等，少数患者　

在该菌感染后出现自身免疫性疾病如急性肾炎、风　

湿热或风湿性心脏病等［１］。依照兰氏分群法，溶血性　链球菌根据其表面Ｃ．多糖抗原的不同，分为Ａ、Ｂ、　

Ｃ、Ｄ、ＦＳ￣ＤＧ等不同亚型（群）［２】。青霉素是治疗１３一溶　血性链球菌感染的首选用药，但红霉素等大环内酯　

类药物也被广泛应用于治疗该菌感染。近几年该菌　

对大环内酯类药物的耐药问题也引起了国内外学者　的关注。２００８年，Ｊａｎａｐａｔｌａ等［３］报道台湾地区该菌对　红霉素耐药率为４４％；２０１４年，Ｚｈｏｕ等［４］报道成都　

地区该菌对红霉素的耐药率高达９８．４％。目前对Ｂ．溶　

血性链球菌的红霉素耐药特征及耐药基因尚缺乏较　系统深入的研究。为了解Ｂ一溶血性链球菌对大环内　

酯类药物的耐药机制及明确耐药表型与基因型的关　

系，指导临床合理使用抗菌药物，我们对从临床分　离的６ｌ株溶血性链球菌的耐药性进行了研究。　

１材料和方法　

１．１材料　１．１．１菌株来源　

６１株溶血性链球菌来自安徽省细菌耐药监控中心　２００５－－２０１３每年９月份收集的监测网所属３４所医院住　

院和门诊患者的各种临床标本。所有菌株采用细菌自　动鉴定系统（Ｍｉｃｒｏｓｃａｎ　Ｗａｌｋａｗａｙ一４０，德国西门子公　

司生产）及溶血性链球菌血清鉴定试剂盒（环凯公司生　

产）进行鉴定。质控菌为金黄色葡萄球菌ＡＴ２５９２３。　１．１．２试剂　ＰＣＲ引物由上海生工生物工程有限公司合成，　Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶、ｄＮＴＰ、Ｔａｑ　ｂｕｆｆｅｒ、ｌｏａｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ　

５￣ＤＮＡ　ｍａｒｋｅｒ均购于大连宝生物工程有限公司。ＭＨ　

琼脂购于英国Ｏｘｏｉｄ公司，琼脂糖购于美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　

公司。　１．１．３主要仪器　

多点接种仪（英国ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ公司１；电热恒温　培养箱（上海精宏实验设备公司）；ＤＮＡ扩增仪（德国　

Ｂｉｏｍｅｔｒａ公司）；电泳仪（北京六一仪器厂）；分析天　

平（上海名桥精密科学仪器公司）；凝胶成像分析系统　ｆ上海天能科技公司１。　１．２　方法　１．２．１细菌体外药敏试验　

参照２０１３年美国临床实验室标准委员会（ＣＬＳＩ）　

的指南，采用琼脂稀释法对６１株ＢＨＳ进行红霉素最　小抑菌浓度（ｍｉｎｉｍａｌ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ。ＭＩＣ）的　

测定。　

１．２．２聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增　使用Ｅｚｕｐ柱式细菌基因组ＤＮＡ提取试剂盒　

（１４０３３２２１Ｙ）提取细菌ＤＮＡ。委托上海生工生物工程　有限公司技术服务部合成引物。ＰＣＲ反应总体系为　

２５ｇＬ，包括１０×ＰＣＲｂｕｆｆｅｒ　２．５ｇＬ，ｄＮＴＰ　２ｇＬ，ＤＮＡ　

模板２ｇＬ，引物各ｌｇＬ，Ｔａｑ酶０．１２５ｇＬ，加无菌去离　子水至２５ｇＬ，３０个循环。用特异性引物扩增ｅｒｍＡ、　

ｅｒｍＢ、ｅｒｍＣ、ｅｒｍＴＲ、ｅｒｅＡ、ｅｒｅＢ、ｍｅｆＡ／Ｅ和ｍｐｈＡ　

等大环内酯类耐药基因，引物序列及ＰＣＲ反应条件，　见表１。ＰＣＲ扩增产物５　Ｌ加６×Ｌｏａｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ　１　ｇＬ，　

在１％的琼脂糖凝胶上（含１×ＴＡＥ和ＥＢ）１２０Ｖ／ｃｍ电泳　

３５ｍｉｎ，采用天能凝胶成像系统分析。　

表１　ＰＣＲ扩增引物序列及扩增条件　Ｔａｂ．１　Ｔｈｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ＰＣＲ　ｐｒｉｍｅｒ　ａｎｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｃｏｎｄｉ

ｔｉｏｎｓ　ｐ．溶血性链球菌红霉素耐药特征与大环内酯类耐药基因的分析黄青等．　！　

庆、广州收集的８９４株ＢＨＳ的药敏分析显示ＢＨＳ对红　霉素耐药率由２０００年的３６．５％上升￣１１２００６年的８５．７％；　张多等【７】报道２００８－－２０１２年武汉地区上呼吸道感染儿　

童ＧＡＳ分离株红霉素耐药率为８３．４８％。本研究中的　

１３株ＧＡＳ有７６．９％对红霉素耐药，低于张多￣ＩＺｈｅｎｇ　等ｔ１７］￣道，但远高于国外的耐药率（２．６％～５．２％）　］。　

红霉素、克林霉素被推荐为预防性治疗ＧＢＳ的二线　药物，但近年来ＧＢＳ对红霉素的耐药率越来越高。　

英国的研究数据表明，在１９９ｌ一２０１０年内ＧＢＳ对红　

霉素的耐药率由２．５％上升到ｌ５％［１０】。本研究表明安　徽省ＧＢＳ临床分离株对红霉素的耐药率为８５．７％，　

与杨玮报道相近【・　】，但明显高于国外的耐药水平【１０’　】。本研究中ＧＣＳ和ＧＧＳ对红霉素的耐药率分别为　

１００％￣１６０％，而Ｍａｔｈｕｒ等『１３】有关ＢＨＳ药敏分析显示　

ＧＧＳ的红霉素耐药率为５％，并未发现对红霉素耐药　的ＧＣＳ。本次研究表明安徽地区ＢＨＳ临床分离株的