实验室实验步骤

一、 免疫共沉淀 COIP 1. 免疫沉淀 IP：概念：利用抗原与抗体特异性结合的特征，将抗原（靶蛋白）从混合体系中沉淀下来，初步分离靶蛋白的方法 2. 免疫共沉淀 COIP：概念：一种在体外检测蛋白和蛋白之间是否存在特异性相互作用的方法。如果两个蛋白在体外能发生特异性作用，那么当一种蛋白的抗体进行沉淀时，另一个蛋白也被同时沉淀下来 3. 应用：纯化蛋白、浓缩蛋白、蛋白质相互作用验证 4. 原理： ①󰀀. 靶蛋白A与蛋白B结合，但无法检测 ②󰀀. 加入靶蛋白A的特异性抗体，此时抗体Fab段与靶蛋白A结合，但仍无法检测 ③󰀀. 加入protein A/G+bead，proteinA/G可特异性结合抗体Fc段，bead是琼脂糖珠 ④󰀀. 复合物结合ProteinA/G+bead后，则可通过离心沉淀下来复合物 ⑤󰀀. 加热变性后，复合物分离，则可通过western blot观察是否有靶蛋白和蛋白B条带即可说明两者有特异性结合。 5. 局限性：倘若蛋白B与靶蛋白的结合是瞬间性即解离的，或两种蛋白中间有第三者起作用，则无法检测出来。 细胞实验： 1. 工作台准备：UV30min，开灯、通风 2. 提示系统安全后开始工作 3. 用酒精擦拭工作台桌面 4. 物品准备：移液枪、枪头、吸管、垃圾桶（固液分开）、培养基、血清（放架子上） 5. 水浴恒温箱打开 37℃ 6. 注意事项：盖子朝下、及时关盖、枪头不要碰触瓶壁、看细胞先用75%酒精擦拭显微镜台面，看完后关灯

二、 细胞传代技术 1. 吸光培养瓶中的培养液，PBS洗涤6ml 2. 加入1-2ml 0.25%的胰蛋白酶液，覆盖整个瓶底，静置2-10分钟 3. 吸去胰蛋白酶液，加入含FBS的DMEM 4. 用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液 5. 吸取1/10-1/40细胞悬液，接种于新的培养瓶，并加适量DMEM+FBS于新培养瓶 6. 放入培养箱培养

三、 细胞冻存技术 1. 冻存液内含10％甘油或二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide, DMSO），它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。 2. 冻存液配置：70%DMEM+20%FBS+10%DMSO,冻存前需换液一次 3. 待存培养皿吸光培养液，加入1-2ml 0.25%胰蛋白酶，静置2-10分钟 4. 吸去胰蛋白酶，加入培养基，离心（2000、3min），去上清，加冻存液，吹打 5. 标记后4℃放30分钟，再移入-80℃保存。

四、细胞换液技术： 1. 观察培养基颜色是否浑浊等，并观察细胞生长状况 2. 取下盖子，倒掉培养基 3. 拿出PBS瓶子，吸取3mlPBS，打入培养皿，晃动后倒掉，重复一次 4. 打入培养基10ml，盖上盖子，显微镜下观察，标记日期名称 五、细胞增殖试验 MTT 1.原理：细胞内线粒体脱氢酶可以还原MTT，MTT还原产物和细胞色素C反应生成结晶，结晶数量与细胞数成正比，且溶于二甲基亚砜DMSO. 2.将细胞消化吹散，96孔板每孔接种3000个细胞 3.细胞贴壁24h后加入MTT 20ul/孔，继续培养4h 4.吸尽液体，加入DMSO150ul/孔，摇床放置10min 5.酶标仪测定OD490nm读值，连续监测5天并绘制生长曲线 六、细胞质粒转染 1.将3.5×105细胞接种于六孔板，以无抗生素的培养基培养，待细胞融合度至90%进行转染 2.将1-2ug的质粒加入250ul的Opti-MEM，再取5ul Lipofectamine 2000加入250ul的Opti-MEM混匀，分别静置5min。 3.将上述两者混匀，室温放置20min 4.将500ul混合液加入细胞，4-6h更换培养基，继续培养48h后处理细胞 七、miRNA/siRNA转染 1.将2×105细胞接种于六孔板，以无抗生素的培养基培养，待细胞融合度到50%进行转染 2.将5ul20uM的miR或siRNA加入250ul Opti-MEM轻柔混匀，吸取5ul RNAi MAX加入250ul Opti-MEM轻柔混匀，分别静置5min 3.将上述两者混匀，室温静置20min 4.上述500ul混合液加入细胞，轻轻摇晃六孔板，培养24-48h后处理细胞 八、TransWell迁移和侵袭试验 1.细胞消化后用无FBS培养基洗涤3次并重悬吹散，配成2.5×105个/ml细胞悬液 2.细胞迁移：200ul细胞悬液加载TransWell小室中 3.细胞侵袭：50ul Matrigel铺平在TransWell小室中，培养箱中风干4-6h，再把200ul细胞悬液加载TransWell小室中 4.20%FBS培养基加至下室，继续培养24-48h 5.小室在甲醇中固定15min，以0.1%结晶紫染色20min，PBS反复洗涤并擦拭掉上室的细胞 6.随机挑5-8个高倍镜视野拍照，细胞计数 九、细胞计数 1.弃培养基 PBS冲洗 2.胰酶消化 3.加6mlDMEM重悬 4.取20ul于1.5mlEP管仲，加入20ul台盼蓝，混匀 5.取计数板，盖玻片10ul混匀液加入，静置2min待细胞固定后计数 6.读取十字架四周四个视野细胞数（记上不记下，记左不计右），即细胞个数/ml=（四个象限）*0.5*104个/ml 十、western blot 1.步骤：细胞培养/蛋白制备→SDS-PAGE电泳→转膜→封闭→加抗体免疫反应→洗膜→曝光 2.原理： ①SDS将蛋白质结构从四级展开成一级，并包绕蛋白带上负电荷 ②由于此时所有蛋白都有相同负电荷和结构，则电泳距离只与分子量大小有关 ③电场作用下，待SDS负电荷蛋白向正极运动，受PAGE网状结构阻碍，分子量小移动快 ④封闭：转膜后，膜上没有结合蛋白质的空白位置要用封闭液（脱脂奶粉）填满，否则背景信噪增高 3.试剂： ①TBST缓冲液：含Tris-Hcl，Nacl，Tween20 ②TBS：不含Tween的TBST ③PBST磷酸盐Tween缓冲液：含磷酸盐缓冲液+Tween20 ④Tween20：非离子型表面活性剂，具有乳化增容稳定作用 ⑤BSA：牛血清蛋白 ⑥Acrylamide/bias solution：聚丙烯酰胺，Tween催化APS（过硫酸铵）产生自由基，自由基引发丙烯酰胺聚合。 ⑦Tris-Hcl：缓冲液，广泛用于做蛋白质与核酸的溶剂，稳定电泳过程中PH值 ⑧封闭液：脱脂奶粉5%+TBST ⑨压胶：注入分离胶后需要加异丙醇压胶，因为空气中O2氧化APS减弱活性，且压胶使层面平整。 ⑩Loading buffer作用：指示剂，观察电泳进度，密度大，携带样本沉降到底部，含SDS，使蛋白变成一级结果并带负电荷 3.配胶： ①准备好玻璃板，用擦镜纸擦干净，底部放灰棉条夹好 ②先加resolving胶，至距离绿线0.6cm（因成胶会缩小），加异丙醇压胶30min ③看到一清楚分界线或剩余胶已凝，倒去水，滤纸吸干 ④加入Stack胶 30min ⑤stacking get：浓缩胶，孔径大，使所有蛋白进入分离胶处同一水平线 ⑥resorting get：分离胶，孔径小，小的蛋白移动快 ⑦胶配好村冰箱1周都可以用。将整块玻璃板用保鲜膜包好，密封袋装好 4.电泳： ①配电泳液，泡尽量少 ②放入电板中，红正黑负，电泳液过胶面，卡紧 ③拿下梳子，上样，marker 4ul，蛋白样品30ug/孔，上样插深一点，打慢一点 ④跑电泳，调电压，看时间 ⑤选择恒压，跑浓缩胶 60-100V 45min，跑分离胶120-200V 90min，电压高，跑得快，但是条形容易变形 5. 转膜： ① 找一块黑板、透亮孔板，2张滤纸，2个海绵 ② PVDF膜用甲醇泡2分钟，带正电，亲水性 ③ 配好转膜液，新的转膜液倒入电泳槽，回收可用于倒入水槽，做夹心三明治 ④ 夹心制作：泡在转膜液中，透明板上方，黑板下方 ⑤ 加一块海绵，滤纸、胶（Marker在右边，大分子在上边），PVDF膜、滤纸、海绵夹好，排干净气泡 ⑥ 黑板对黑色负极，透明板对红色正极 ⑦ 恒压100v，1h，20-80kd用，或400mA恒流 ⑧ 注：PVDF膜，0.28um用于10-20kd蛋白，0.45um用于20-80kd ⑨ 取膜夹取Marker那边，不要碰到蛋白样品 ⑩ 取出膜，泡洗TBST，剪膜，放在滤纸上剪，用剪角做标记 6. 封闭： ① 5%脱脂奶用TBST配，2.5g奶粉：50mlTBST ② 室温摇床1h ③ 也可4℃过夜摇 ④ 孵育：配一抗二抗，配成1:500/1000/2000……具体按经验 ⑤ 一抗4℃过夜，去冷房 ⑥ 二抗室温1h ⑦ 一抗而抗后用TBST洗10min×3次 7.曝光： 装备（暗盒、A液B液，1ml枪，枪头，胶片，计时器），带到9楼暗室 ① A/B液1:1，各1ml ② 第一张片子30s，放入机器中，大约45s出片，如果条带不深可以延长时间 ③ 如果发现抗体有问题，用TBST洗掉AB液，重新孵育1抗2抗 ④ 过胶片的机子：先经过第一缸洗去未结合的染料，再经过第二缸强化已结合的染料，最后水洗? 十一、qPCR 1. 备冰盒，配10ul体系 2. 10ul体系包括SYBR （+ROX）5ul，H2O 3.2ul，F引物/R引物 0.4ul*2，cDNA 1ul 3. 先配好要做的加样试剂，设有两组，每组10个样本要加样，则如下图所示： 组A：跑18s内参样品孔*10 组A：跑18s内参样品孔副孔*10 组A：跑目的基因样品孔*10 组A：跑目的基因样品孔副孔*10 组B：跑18s内参样品孔*10 组B：跑18s内参样品孔副孔*10 组B：跑目的基因样品孔*10 组B：跑目的基因样品孔副孔*10 4. 即若有X组，每组Y个，则需要4XY个9ul体系(无cDNA)，这总体系又分成两种，一种是检测18s内参的，一种是检测目的基因的。即每次跑PCR的时候，需要18xy ul的18s体系和18xy ul的目的基因体系 5. 18xy ul的体系中需要： 10XY ul的SYBR 6.4XY ul的H2O 0.8XY ul的F引物（18s/目的基因） 0.8XY ul的R引物（18s/目的基因） 6. 两组18xy ul的体系，每孔加9ul，加上原本cDNA 1ul，共10ul体系，cDNA先离心甩下 7. 配好后予贴膜封装后去719整板甩甩 8. 去PCR仪旁放进样本，设定参数，开始跑PCR