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2006巴斯德毕赤酵母发酵生产重组人溶菌酶

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毕赤酵母表达知识归纳

毕赤酵母表达知识归纳

毕赤酵母表达知识归纳1a.配制500×BIOTIN stock solution（0.02％）有这么3种方案：1、懒人是将Biotin直接溶在去离子水中，放过夜，基本就能溶；2、急性子是将溶液配成0.02N的NaOH，就很容易溶解了；3、水浴加热，温度不能高于50度。

D－生物素是具有生物活性的生物素，也就是vitaminH。

在毕赤酵母代谢过程中，作为多种酶的辅基起作用。

天然培养基中一般可以不单独添加，因为YNB中、酵母粉、蛋白胨中均含有一定量的生物素，但是做高密度发酵还是必须要添加的。

b.有几个比较迷惑的问题请教大家：(很典型的小问题）1、制感受态细胞，OD多少比较好？pyrimidine 战友的方法：取1mlGS115过夜培养物(OD约6-10) 分装到1.5ml EP管中。

说明书还有一些文献是说在1.3左右效率高，再高了效率会很低2、关于高效转化法，文献说用(LiAc)，而invitrogen的说明书说转化毕赤酵母用(LiAc)没用，要用LiCl。

Lithium acetate does not work with Pichia pastoris. Use only lithium chloride.3、YNB到底能高温灭么？有的说能有的说不能。

过滤灭菌的怎么操作？我是把滤器装好膜绑到瓶口用纱布盖上，报纸包上，瓶盖放烧杯里单灭。

然后把配好的溶液用注射器一点点推进去。

4、葡萄糖为什么在YPD里一起灭颜色很深，单灭则不会。

该115度还是121度灭？网上搜了下，都有人用！5、电转化参数用400欧还是200欧？有的用400，有的还专门说不是用400。

都是从园里看到的！电击参数：1.5KV，25uF，200欧姆（不是400）6、电转后，在MD平板上长的应该就是整合了目的基因的重组子了吧？如果不想筛高拷贝的，是否PCR验证一下即可？网友的回答：ynb最好不灭菌，我是0.22um过滤处理的。

invitrogen手册上可以灭菌的。

重组巴曲酶在毕赤酵母中的高效表达

重组巴曲酶在毕赤酵母中的高效表达

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使其失活，因此 =1 值成为影响蛋白表达的一个重 要因 素。实 验 中，分 别 选 取 不 同 的 =1 值：;X-， YX-，YX@ 进行了对比研究。 毕赤酵母可以在简单培 !"%"# 培养基成份的影响： 养基中生长良好和表达有生物活性的重组巴曲酶。 但在简单培养基中分泌的重组蛋白易发生降解，使 产物的得率降低。实验中，分别选取大豆蛋白胨和 山梨醇进行了对比研究。 随着发酵时间的延长，宿 !"%"$ 培养时间的影响： 主细胞的蛋白水解酶浓度也会随之增加，使分泌的 重组蛋白发生降解，使产物的得率降低。实验中， 用人标准血浆进行酶活性测定，记录自诱导起 - Z @-% 的实验结果，以选择收获发酵液的最佳时机。 将发酵上清液加入 ,B#"NL !"& 重组巴曲酶的纯化： 硫酸铵 等 预 处 理 后，先 经 过 预 先 用 9-BB#"NL >P< （=1 YX-）和 ,B#"NL 硫酸铵平衡过的疏水层析介质 （<GHKAWL?IKGW >%&*M"） ，用含 , Z -B#"NL 硫酸铵的 >P< 梯 度 洗 脱，收 集 活 性 峰；再 经 过 用 9-BB#"NL （ =1 YX- ） 平 衡 过 的 阳 离 子 交 换 介 质（ <> >P< ，用含 - Z -X;B#"NL 氯化钠的 >P< 梯 <&=%6C#$&GW [[） 度洗脱，收集活性峰；再经过用 9-BB#"NL GC)$E12" （=1 +X.）肝素亲和介质 （ 1&=6C)* <&=%6C#$& [[） ，用 含 - Z -X;B#"NL 氯化钠的 GC)$E12" 梯度洗脱，收集 活性 峰；最 后 再 进 行 一 步 用 含 -X9;B#"NL I62" 的 （ =1 +X. ）凝 胶 过 滤 层 析 （ <E9--! 9-BB#"NL GC)$E12" ，添加 ;-O 的甘油， \ ,-] 保存。 <&=%6SCM"） !"’ 巴曲酶的测活方法 参照从蛇毒中提取的巴曲酶的测活方法，用加 入了柠檬酸纳的人标准血浆可以对发酵上清液中表 达出的酶活性进行测定，这即可以对克隆进行筛 选，也可以对工程菌的产量高低进行测评。具体测 定活性的标准就是，以人凝血酶为标准品， F+] 下， 将 9-L 的样品加入到 F-L 含柠檬酸钠的人标准 # # 血浆中，混匀后，观察凝固所需的时间。 !"( 重组巴曲酶蛋白对小鼠出血时间的影响 试验鼠为 ,- Z ,;4 的雄性小鼠，分别尾静脉注 射重 组 巴 曲 酶 蛋 白 （ , I?1 3*)T$N74 ） 和 >P< 对 照， Y-B)* 后，距尾尖 ,BB 处横切，固定后浸入 F+] 生 理盐水中 9X;SB，记录出血时间。

毕赤酵母高密度发酵实验流程

毕赤酵母高密度发酵实验流程

毕赤酵母高密度发酵实验流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。

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人溶菌酶基因在毕赤酵母中的表达及其活性检测

人溶菌酶基因在毕赤酵母中的表达及其活性检测

ＴｈＹ 。方法 采用 Ｅ ｏ ／ ｏ Ｉ双酶切及 Ｐ Ｒ确认 正确后 ， －Ｌ Ｚ ｃＲ Ｉ Ｎ ｔ Ｃ 将人溶 菌酶基 因 ｃ Ｎ Ｄ Ａ目的片段 亚克隆到毕赤 酵母 表达载体 ｐＩ９ ， ＰＣ ｋ中 通过电穿孔法转化毕赤酵母菌 Ｇ ｌ５ 获得重组 质粒 ｐ Ｉ９ －Ｌ Ｚ 采用 Ｅｏ Ｎ ｔＩ双酶切 法 Ｓ１， ＰＣ ｋｈＹ ， ｃＲ Ｉ／ ｏ 及 Ｄ Ａ测序证 明 ｃ Ｎ Ｎ Ｄ Ａ序列完全正确 ， 在毕赤 酵母 菌中诱导表达产物经 Ｓ ＳＰ Ｇ Ｄ －Ａ Ｅ电泳 分析 ， 结果 表 明表达产物 与 预期大 小的 ｈＹ Ｌ Ｚ蛋 白分子量一致 ， 采用微球菌溶解法进行抑菌活性测定 。结论 关键词 ： 毕赤酵母 ； 人溶菌酶 ； 抑菌活性 ； 克隆与表达 中图分类号 ： ３ Ｒ４ 文献标识码 ： Ａ
Ａ ｓ ａｔＯ ｊｃｉ Ｌｓ ｙ ｅｃ Ｎ ｍ ｎｈ Ｙ ） ａ ｐｉ ｄｂ Ｃ ｎ ｏｅ ｔ ａｖｃ ｒ ＭＤ ８Ｔ Ｍｅ ｏ ｓ ｂｔ ｃ： ｂｅｔ ｅ ｙｏ ｍ Ｄ Ａ ｏｈ ａ （Ｌ Ｚ ｗ ｓ ｍ ｌ ｅ ｙ Ｒａｄｃ ｎｄｉｏ ｔ ｒ ｖ ｚ ｆｕ ａ ｆ ｉ Ｐ ｌ ｎ ｅ ｏ ｐ １一 ． ｔ ｄ ｈ
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