毕赤酵母电转化方法及转化子的筛选

毕赤酵母表达知识归纳1a.配制500×BIOTIN stock solution（0.02％）有这么3种方案：1、懒人是将Biotin直接溶在去离子水中，放过夜，基本就能溶；2、急性子是将溶液配成0.02N的NaOH，就很容易溶解了；3、水浴加热，温度不能高于50度。

D－生物素是具有生物活性的生物素，也就是vitaminH。

在毕赤酵母代谢过程中，作为多种酶的辅基起作用。

天然培养基中一般可以不单独添加，因为YNB中、酵母粉、蛋白胨中均含有一定量的生物素，但是做高密度发酵还是必须要添加的。

b.有几个比较迷惑的问题请教大家：(很典型的小问题）1、制感受态细胞，OD多少比较好？pyrimidine 战友的方法：取1mlGS115过夜培养物(OD约6-10) 分装到1.5ml EP管中。

说明书还有一些文献是说在1.3左右效率高，再高了效率会很低2、关于高效转化法，文献说用(LiAc)，而invitrogen的说明书说转化毕赤酵母用(LiAc)没用，要用LiCl。

Lithium acetate does not work with Pichia pastoris. Use only lithium chloride.3、YNB到底能高温灭么？有的说能有的说不能。

过滤灭菌的怎么操作？我是把滤器装好膜绑到瓶口用纱布盖上，报纸包上，瓶盖放烧杯里单灭。

然后把配好的溶液用注射器一点点推进去。

4、葡萄糖为什么在YPD里一起灭颜色很深，单灭则不会。

该115度还是121度灭？网上搜了下，都有人用！5、电转化参数用400欧还是200欧？有的用400，有的还专门说不是用400。

都是从园里看到的！电击参数：1.5KV，25uF，200欧姆（不是400）6、电转后，在MD平板上长的应该就是整合了目的基因的重组子了吧？如果不想筛高拷贝的，是否PCR验证一下即可？网友的回答：ynb最好不灭菌，我是0.22um过滤处理的。

invitrogen手册上可以灭菌的。

毕赤酵母常用培养基与载体一、毕赤酵母表达常用载体：典型的巴斯德毕赤酵母表达载体载体包含醇氧化酶－1（AOX1）基因的启动子和转录终止子（5'AOX1和3'AOX1），它们被多克隆位点（MCS）分开，外源基因可以在此插入。

此载体还包含组氨醇脱氢酶基因（HIS4）选择标记及3'AOX1区。

当整合型载体转化受体时，它的5'AOX1和3'AOX1能与染色体上的同源基因重组，从而使整个载体连同外源基因插入到受体染色体上，外源基因在5'AOX1启动子控制下表达。

毕赤酵母本身不分泌内源蛋白，而外源蛋白的分泌需要具有引导分泌的信号序列。

而由89个氨基酸组成的酿酒酵母的分泌信号—α交配因子(α-factor)引导序列已经成功地引导了几种外源蛋白的分泌。

分泌表达载体主要有：pPIC9，pPIC9K，pHIL-S1，pPICZα A，pYAM75P等。

胞内表达载体主要有：pHIL-D2，pA0815，pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ，pGAPZa(Invitrogen)，pPIC3.5K等。

工程菌株Y11430，MG1003，GS115 （AOX1），KM71，SMD1168。

毕赤酵母宿主菌常用的有GS115和KM71两种，都具有HIS4营养缺陷标记。

其中，GS115茵株具有AOX1基因，是Mut＋，即甲醇利用正常型；而KM71菌株的AOX1位点彼ARG4基因插入，表型为Muts，即甲醇利用缓慢型，两种菌株都适用于一般的酵母转化方法。

多拷贝表达菌株的获得方式：与自主复制的质粒型表达载体不同，整合型表达载体的拷贝数可以有很大的变化。

含多拷贝外源基因的表达菌株合成蛋白的量也较多。

体内整合可通过高遗传霉素抗性，筛选可能的多拷贝插入；而体外整合可通过连接产生外源基因的串联插入。

多拷贝表达菌株的获得方式有两种：一种是利用SDS-PAGE电泳、免疫杂交或菌落点杂交方法在大量的转化子中进行自然筛选。

酵母菌表面展示的蛋白质工程操作步骤酵母菌表面展示的蛋白质工程是一种重要的技术手段，可以用于研究蛋白质的结构与功能，以及开发新型的药物和生物材料。

下面将介绍酵母菌表面展示的蛋白质工程的操作步骤。

1. 选择适当的酵母菌株选择适合表面展示蛋白质的酵母菌株，常用的有酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和毕赤酵母(Hansenula polymorpha)。

根据实验的需要，选择相应的酵母菌株。

2. 构建融合蛋白的表达载体将目标蛋白与酵母菌表面展示蛋白的结构域进行融合，并将融合蛋白的基因插入酵母菌表达载体中。

选择适当的启动子、选择子和标签，确保融合蛋白的高效表达和方便检测。

3. 转化酵母细胞将构建好的表达载体导入酵母菌细胞中，通常采用化学法或电转化法将外源DNA转化到酵母细胞内。

经过培养和筛选后，得到表达目标蛋白的转基因酵母菌株。

4. 表达目标蛋白将转基因酵母菌株进行培养，提供适当的培养基和条件，促使目标蛋白的高效表达。

可以通过检测培养基中目标蛋白的浓度和预测蛋白的位置来确定表达效果。

5. 表面展示目标蛋白利用酵母菌表面展示蛋白质的特性，通过分子生物学的手段，使得目标蛋白质能够在酵母菌表面展示出来。

常用的方法有融合目标蛋白与表面展示蛋白的结构域、或者通过添加信号肽等方式，在酵母菌细胞表面定向展示目标蛋白。

6. 鉴定和纯化目标蛋白使用合适的实验方法和技术手段，对表面展示的目标蛋白进行鉴定和纯化。

例如，可以利用抗体的特异性进行检测，或者利用亲和层析等技术进行纯化。

7. 评估目标蛋白的功能对纯化获得的目标蛋白进行功能评估，例如测试其在特定条件下的结构稳定性、酶活性、配体结合能力等。

同时，还可以对目标蛋白进行结构解析，揭示其功能机制。

总结：酵母菌表面展示的蛋白质工程操作步骤主要包括酵母菌株的选择、构建融合蛋白的表达载体、转化酵母细胞、表达目标蛋白、表面展示目标蛋白、鉴定和纯化目标蛋白以及评估目标蛋白的功能。

・研究报告・生物技术通报BIOTECHNOLOGY BULLETIN2013年第12期酿酒酵母是最简单的真核生物，同时又具有类似原核生物的生长特性，便于培养和进行遗传操作的优点，是一种模式真核生物和模式实验系统，被称为真核生物的“大肠杆菌”［1］。

它与人类的关系极为密切，是人类实践中应用较早的一类微生物［2］，同时它也被广泛用作基因克隆和表达的宿主菌。

为了鉴定克隆到酵母细胞内的外源基因，可以通过提取酵母基因组后通过PCR 扩增目的基因、与特异性底物形成水解圈、荧光基团、挑取单克隆进收稿日期： 2013-06-30基金项目：广东省科技计划（2012B020311005）作者简介：武可婧，女，硕士研究生，研究方向：微生物功能蛋白；E -mail ：wu.kejing@ 通讯作者：林蒋海，博士，副研究员，研究方向：基因工程，代谢工程；E -mail ：jianghai.lin@一种高效快速鉴定酵母转化子的酵母菌落PCR 方法武可婧 吕一鸣 李晶博 肖文娟 龚映雪 刘泽寰 林蒋海（暨南大学生命科学技术学院，广州 510632）摘 要： 酵母是一种重要的基因工程宿主菌，但是由于其细胞壁结构复杂牢固，普通的菌落PCR 方法的成功率较低。

为解决此问题，提供一种快速、简单、高效的酵母菌落PCR 方法。

该方法先利用溶壁酶溶解酵母细胞壁，然后利用热涨裂解细胞并进行PCR 反应。

此方法将酵母细胞裂解和PCR 在同一个PCR 管中完成。

试验结果显示此方法能成功扩增目的基因且成功率高。

将此方法应用于外源性内切葡聚糖酶（endoglucanase，EG）的酿酒酵母转化子筛选，经与基因组PCR 比较，菌落PCR 与基因组PCR 结果一致。

结果证明此方法具有良好的稳定性，适用于酿酒酵母转化子的快速筛选。

关键词： 酿酒酵母 菌落PCR 转化子 阳性克隆A Rapid and Efficient Yeast Colony PCR Method to Identify PositiveTransformantsWu Kejing L ü Yiming Li Jingbo Xiao Wenjuan Gong Yingxue Liu Zehuan Lin Jianghai（School of Life Science and Technology ，Jinan University ，Guangzhou 510632）Abstract: Yeast is an important host microorganism in genetic engineering and molecular cloning. However, because of the complex structure of their cell wall, ordinary colony PCR method has a low success rate. To address this problem, a fast, simple and efficient yeast colony PCR method was provided. In the novel method, a commercial available cell wall degradation enzyme, lyticase, was used to disrupt yeast cell wall and the resulted protoblast was then bursted by heating. Into the lysis mixture, other PCR components were added and PCR reactions were performed. In the current constructed method, the yeast cell lysis and PCR reaction were performed in one single PCR tube, which is convenient and easy to implement. The success rate of the novel method was relatively high compared to traditional ones. Using this method, the Saccharomyces cerevisiae transformants of exogenous endoglucanase（EG）were screened. Compared to PCR using genomic DNA, the results of colony PCR were consistent with those from genomic PCR. The results indicated that the novel method was of good stability, repeatability and suitable for the rapid screening of the S. cerevisiae transformants.Key words: Saccharomyces cerevisiae Colony PCR Transformant Positive clone行菌落PCR 等一系列方法来鉴定酵母转化后的阳性克隆。

由于甲醇营养型酵母菌体内无天然质粒，所以携带外源基因的重组体必须整合于染色体中才能实现外源基因的表达。

整合表达的优点在于保持外源基因稳定性并可产生多拷贝基因。

典型的毕赤氏酵母表达载体含有醇氧化酶基因的调控序列，主要的结构包括：5’AOX1启动子片段、多克隆位点(MCS)、转录终止和polyA形成基因序列(TT)、筛选标记(His4或Zeocin)、3’AOX1基因片段，作为一个能在大肠杆菌中繁殖扩增的穿梭质粒，它还有部分pBR322质粒或COLE1序列。

如果是分泌型表达载体，在多克隆位点的前面，外源基因的5’端和启动子的3’端之间插人了分泌作用的信号肽序列。

在这个分泌信号的引导下，外源蛋白在内质网和高尔基体中经修饰和加工后能够由胞内转移至胞外，将成熟的蛋白质分泌到细胞外。

为方便于操作，通常表达载体都是穿梭质粒。

表达载体与酵母染色体有单交换和双交换整合2种方式，单交换整合时，或插入A0X1位点，或插入his位点。

有文献报道，以his4作为整合位点时，染色体突变株与表达盒间存在基因转换，偶而可使Laz表达盒丢失，故AOX1位点更好。

一般认为，单交换转化效率比双交换效率高，且易得到多拷贝整合，其发生机制可能是重复单交换引起的。

携带外源基因的表达载体可通过电穿孔、原生质体生成法或全细胞法转化酵母细胞。

甲醇酵母转化和大肠埃希氏菌转化不同之处是前者较为复杂。

对于大肠埃希氏菌而言，只要把重组表达载体导入细胞体内即可。

因其载体上携带有自身复制原点，可随染色体复制而复制，重组表达载体能够稳定存在。

在甲醇酵母系统中，所有的表达载体均不含酵母复制原点。

这就是说，导入酵母体内的重组表达载体只有和酵母染色体上的同源区发生重组，整合到染色体上，外源基因才能够稳定存在，外源蛋白才能得到稳定表达，这种整合的转化子一旦形成就非常稳定。

如果转化后的重组表达载体未能整合到染色体上，而是以游离的附加体形式存在，这种转化子就不稳定，重组表达载体极易丢失。

毕赤酵母表达系统Mut+和Muts毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶——AOX1及AOX2，细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产品，甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。

AOX1基因调控分两步：抑制/去抑制机制加诱导机制。

简单来说，在含葡萄糖的培养基中，即使加入诱导物甲醇转录仍受抑制。

为此，用甲醇进行优化诱导时，推荐在甘油培养基中培养。

注意即使在甘油中生长(去抑制)时，仍缺乏以使AOX1基因达到最低水平的表达，诱导物甲醇是AOX1基因可辨表达水平所必须的。

AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。

AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2基因的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株。

在YPD(酵母膏、蛋白胨、葡萄糖)培养基中，不管是Mut+还是Muts其在对数期增殖一倍的时间大约为2h。

Mut+和Muts菌株在没有甲醇存在的情况下生长速率是一样的，存在甲醇的情况下，Mut+在对数期增殖一倍的时间大约为4至6个小时，Muts 在对数期增殖一倍的时间大约为18个小时。

菌株GS115、X-33、KM71和SMD1168的区别GS115、KM71和SMD1168等是用于表达外源蛋白的毕赤酵母受体菌，与酿酒酵母相比，毕赤酵母不会使蛋白过糖基化，糖基化后有利于蛋白的溶解或形成正确的折叠结构。

GS115、KM71、SMD1168在组氨酸脱氢酶位点(His4)有突变，是组氨酸缺陷型，如果表达载体上携带有组氨酸基因，可抵偿宿主菌的组氨酸缺陷，因此可以在不含组氨酸的培养基上筛选转化子。

这些受体菌自发突变成组氨酸野生型的概率一般低于10-8。

GS115表型为Mut+，重组表达载体转化GS115后，长出的转化子可能是Mut+，也可能是Muts(载体取代AXO1基因)，可以在MM和MD培养基上鉴定表型。

猫血清白蛋白重组蛋白及其在毕赤酵母中的表达方法
猫血清白蛋白重组蛋白是一种重要的生物活性蛋白，具有多种生物学功能，如维持血浆渗透压、运输物质、免疫防御等。

在毕赤酵母中表达猫血清白蛋白重组蛋白，有助于研究该蛋白的结构和功能，并为生物制药、生物材料等领域提供重要资源。

猫血清白蛋白重组蛋白在毕赤酵母中的表达方法如下：
1. 基因克隆：首先从猫基因组数据库中获取猫血清白蛋白基因序列，通过 PCR 扩增得到目的基因。

然后，将目的基因与毕赤酵母的穿梭载体（如 pPICZα）进行重组，构建表达载体。

2. 转化毕赤酵母：将构建好的表达载体转化到毕赤酵母细胞中，通过筛选抗性平板得到转化子。

3. 诱导表达：在含有一定浓度诱导剂（如甲醇）的培养基中，培养转化子，诱导目的蛋白的表达。

甲醇诱导剂可以激活重组蛋白的表达，且在一定范围内，甲醇浓度越高，表达量也越高。

但过高的甲醇浓度会影响酵母的生长。

4. 蛋白纯化：诱导表达后的酵母细胞经过破碎、离心等步骤，获取含目的蛋白的的上清液。

然后，利用离子交换层析、凝胶过滤等方法对目的蛋白进行纯化。

5. 活性鉴定：对纯化的猫血清白蛋白重组蛋白进行活性鉴定，检测其在生理功能方面的表现，如抗氧化、抗炎等。

6. 应用：猫血清白蛋白重组蛋白在生物制药、生物材料等领域具有广泛应用前景。

例如，它可以作为生物制药的原料，用于治疗疾
病；也可以作为生物材料，用于组织工程和再生医学等。

总之，通过以上方法，可以在毕赤酵母中表达猫血清白蛋白重组蛋白，并进行纯化和活性鉴定。

这为研究猫血清白蛋白的结构和功能，以及将其应用于生物制药、生物材料等领域奠定了基础。

毕赤酵母表达系统前言：所用表达质粒有pPIC3.5K,pAO815用于胞内表达，而pPIC9K用于分泌表达，所有载体均利用AOX1启动子来诱导高水平表达。

抗性选择：最有效的筛选遗传霉素抗性及高抗性克隆的程序需要先对HIS＋转化子进行选择，再进行不同水平遗传霉素抗性筛选。

毕赤菌株表型：毕赤酵母菌GS115 及KM71 在组氨酸脱氢酶位点（His4）有突变,因而不能合成组氨酸，所有表达质粒都有HIS4 基因可与宿主进行互补，通过不含组氨酸的培养基来选择转化子。

GS115 及KM71都可在复合培养基如YPD（YEPD）及含组氨酸的最小培养基中生长。

转化之前，GS115 及KM71 都不能在最小培养基中生长，因为它们是His-。

培养温度：毕赤酵母生长温度为28-30度（液体、平板、斜面）。

在32 度以上诱导生长时，对蛋白表达有害，甚至会导致细胞死亡。

贮存：贮存细胞几周或几月，用YPD培养基或YPD 琼脂斜面1 挑取所需菌株单克隆在YPD 平板上划线生长；2 挑取单克隆转移至YPD进行穿刺培养，30 度2 天；3 细胞在4 度可放几周几月或几年，存于－80度1 挑取所需菌株单克隆在YPD 中过夜培养；2 收集细胞，在含15%甘油的YPD 中悬浮至终OD600 为50-100（大约2.5-5.0×109细胞/ml）；3 细胞先用液氮或干冰/酒精浴中冰冻再贮存于-80 度。

注意：在4 度或－80 度长期保存后，用之前建议在MM、MD 或MGY 平板上划线培养以检测His+转化子的表型是否正确及其活力。

以质粒pPIC9K，酵母Pichia pastoris GS115为例说明做法。

载体pPIC9K酶切为点线性化质粒DNA：建议使用下列方法线性化载体以获得Mut+及Muts重组子，可能其中一个会比另一个更利于表达多拷贝重组子。

如果只想得到Muts重组子，使用KM71 菌株。

单个十字交换事件可比双重十字交换更容易、更有效地获得Muts重组菌（例如：插入A OX1或his4 而不是取代AOX1）。

利用重组酵母菌生产人胰岛素摘要：利用重组酵母菌生成人胰岛素为以下流程：获得目的基因→构建重组质粒→构建基因工程菌→工程菌发酵→产物分离纯化→产品检验。

其中前三个流程为产人胰岛素酵母工程菌的构建，根据人胰岛素的氨基酸序列和酵母偏爱的密码子，采用基因半合成技术合成人胰岛素基因。

将合成的胰岛素基因克隆到pPIC9质粒，构建了毕赤(Pichia)酵母重组表达载体pPINS319，用BglII线性化后用电转化法导入毕赤酵母GSll5菌株，经过营养筛选和PCR 复筛，得到含人胰岛素基因的毕赤酵母工程菌株。

后三个流程为胰岛素的大规模发酵生产，通过补料-分批发酵获得发酵液，分离纯化后获得人胰岛素。

纯化后的重组人胰岛素产品经SDS-PAGE检测，氨基酸组成分析及小鼠惊厥实验证明制得产品为有生物活性的人胰岛素。

关键词：重组酵母；人胰岛素；发酵；纯化；鉴定Using recombinant yeast to produce human insulinHuSheng 1142043040Abstract：The proceedings of produce human insulin by recombinant yeast show as follow:get purpose gene→c onstruct the recombinant plasmid→construct the genetic engineering bacteria→fermentation of e ngineering bacterium→separation and purification of the product→identification of the product. The front three processes is building engineering bacteria of human insulin yeasts . Insulin gene was synthesized according to the amino acid sequence of human insulin and yeast preferential codons. The insulin gene was cloned in to pPIC9 vector and expression vector pPINS319 was constructed. The expression vector was digested with BgllI and then used to transform Pichia Pastoris GSll5 by electroporation. The expression analysis showed that the insulin gene w s able to expressed efficiently in Pichia Pastoris. The posterior three processes is large-scale production by fermentation.Through fed - batch fermentation getting fermentation liquor, separation and purification the fermentation liquor getting human insulin.The final products purified by supedrex 75showed one band by SDS-PAGE analysis and were identical with the native human insulin by all critetia employed.(SDS-PAGE analysis,amin acid composition analysis and bioidentity assay) Keywords：recombinant yeast;human insulin; fermentation;purification;identification 胰岛素是FDA批准的第一个用于人类的基因重组药物。

酵母成型脂肪酶筛选方法本文作者：朱珊珊、喻晓蔚、徐岩单位：江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室作为真核表达系统,巴斯德毕赤酵母表达系统正以其独特的优势和潜力得到广泛使用[1]。

本实验室在前期研究中,从一株酿造浓香型大曲酒酒曲中筛选获得的华根霉中克隆得到其脂肪酶基因proRCL(GenBank登录号No.EF405962),并在毕赤酵母中实现了克隆与高效表达[2]。

研究所用的表达载体pPIC9K含有一个来自于乙醇氧化酶Ⅰ(AOX1)基因的严格甲醇诱导型的强启动子pAOX1,但甲醇易燃,在工业放大过程中存在安全隐患。

pGAP是一种糖酵解中的关键酶――三磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,GAP)的启动子,在葡萄糖、甘油等基本碳源的存在条件下,能高效地组成型表达外源基因,在培养过程中不需更换碳源,简化了操作步骤,也更适合工业上的应用,因此我们考虑利用GAP启动子来构建组成型表达proRCL的载体。

外源基因整合入毕赤酵母,根据线性化位点位置的不同,将会导致两种整合入基因组事件――单插入与双交换的发生,产生两种不同的表型,即Mut+和MutS。

单插入事件通常会导致插入不同拷贝数的基因组,而双交换一般是将单拷贝外源基因整合入基因组。

多拷贝外源基因的整合可以提高外源蛋白的表达量,但是利用毕赤酵母表达系统进行定向进化的过程中,多拷贝的发生会干扰重组子的筛选,例如筛选酶活提高突变株时,拷贝数的增加也会导致酶活增高,从而干扰了酶活提高突变酶的筛选。

而利用商业化的pGAPZαA表达质粒无法产生双交换事件,为了同时利用启动子pGAP进行组成型表达筛选,以及将外源基因双交换整合入基因组产生单拷贝重组子,本文在保留了诱导型表达载体pPIC9K上的5′AOX1的基础上,将PCR得到的pGAP基因片段插入到5′AOX1序列之后,华根霉脂肪酶基因proRCL之前,通过载体与基因组之间的5′AOX1及3′AOX1区发生的双交换事件,将构建的组成型表达载体整合到酵母基因组中,产生MutS表型的菌株。