毕赤酵母重组子的MDMM签定方法

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毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白综述：基本特征：作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。

不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。

它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。

同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。

这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。

与酿酒酵母相似技术：许多技术可以通用：互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。

例如：HIS4基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3等基因在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。

毕赤酵母是甲醇营养型酵母：毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。

甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。

为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。

毕赤酵母的培养巴斯德毕赤酵母是甲醇营养型酵母中的一类能够利用甲醇作为唯一碳源和能源的酵母菌。

与其它酵母一样，在无性生长期主要以单倍体形式存在，当环境营养限制时，常诱导2个生理类型不同的接合型单倍体细胞交配，融合成双倍体。

比赤酵母表达常用的培养基：1 LB培养基胰蛋白胨1% 酵母粉0.5% 氯化钠1% PH 7.0----------------大肠杆菌培养制作平板加入2%的琼脂粉，121摄氏度20分钟，可于室温保存。

用于培养pPICZ αA 原核宿主菌TOP10F’时可加入Zeocin 25ug / mL（博来霉素，抗菌素）宿主细胞His- -----------诱变造成的。

MD------------酵母转化筛选培养基（营养缺陷型His-）13.4g/L酵母基本氮源；0.4mg/L生物素；20g/L葡萄糖用于表达的毕赤酵母都属于组氨酸缺陷型的只有染色体上成功整合入重组质粒载体基因的毕赤酵母菌株才能在组氨酸缺失的MD培养基生长，以此筛选出重组子。

MM--------------酵母转化进一步筛选培养基仅能满足微生物野生型菌株生长需要的培养基，成为基本培养基（minimal medium,MM），有时用符号“[ －]”来表示。

不同微生物的基本培养基是不相同的。

2 LLB 培养基胰蛋白胨1% 酵母粉0.5% 氯化钠0.5%PH 7.0制作平板时加入2％琼脂粉。

121℃高压灭菌20min。

可于室温保存数月。

用于培养pPICZ αA 原核宿主菌TOP10F’时，加入Zeocin 25ug / ml，可以4℃条件下保存1～2 周.3 YPD培养基酵母粉1%，胰蛋白胨2%，葡萄糖2%，固体加2%的琼脂粉，YPD 培养基可常温保存,是毕赤酵母的最基本培养基，琼脂YPD 平板在4℃可保存几个月。

加入Zeocin 100ug / ml，成为YPDZ 培养基，可以4℃条件下保存1～2 周。

4 BMGY培养基酵母粉1% 蛋白胨2%，磷酸钾缓冲溶液平PH 6 100mmol/L YNB（酵母氮源）1.34% 生物素（4×10 -5）%甘油1%，毕赤酵母诱导表达前培养基，YNB和Biotin过滤除菌。

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毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白综述：基本特征：作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。

不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。

它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。

同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。

这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。

与酿酒酵母相似技术：许多技术可以通用：互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。

例如：HIS4基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3等基因在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。

毕赤酵母是甲醇营养型酵母：毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。

甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。

为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。

毕赤酵母PCR表型鉴定的模板制备方法
方法一：
取对数生长期酵母菌株1.5ml，13000r/min，离心15s，去上清，双蒸水洗涤一次，13000r/min 离心15s，沉淀悬浮于200ulTE缓冲液中，在沸水上煮10min，冰浴10min，13000r/min，离心5min，将上清液储存于－20度取2ul用于PCR。

方法二：
1.尽量多挑菌落，悬于100ul悬浮液中，混匀。

2.加入150ul裂解液，混匀，煮沸10min。

3.加入等体积酚氯仿，抽提5－10min。

4.14000rpm，10min，取上层清液，转入另一个1.5ml离心管中。

5.加等体积异丙醇，冷冻10min，14000rpm，10min。

6.轻轻倒去上清，扣干，55度烤干。

7.加入适量（20ul）TE复溶，看情况调整浓度，可做PCR模板
方法二肯定能提到供表型鉴定的DNA，提完后可以跑电泳看看是否有DNA，如果有提到，但PCR扩不出，那可以把模板稀释5倍或10倍，再扩应该没问题。

这个方法没有第一个快，但稳定，也不像其它资料上说的那么麻烦，所以是个很好的方法。

悬浮液和裂解液是一般抽提质粒用的那种，在分子克隆手册上可以找到配方，在这里就不再详述了。

重组子鉴定的方法
子鉴定是一种基于DNA分析的技术，用于确认一个组织样本是否来自于另一个特定的组织样本。

这种技术通常用于确定父子或母子关系，但也可以用于其他类型的亲属关系鉴定。

重组子鉴定的方法通常包括以下步骤：
1. 提取DNA样本：首先需要从被鉴定的两个个体中提取DNA样本，通常是通过采集口腔细胞、血液或其他体液样本来获取DNA。

2. PCR扩增：提取的DNA样本会经过多重PCR扩增，用于增加特定基因座的DNA片段，以便进一步分析。

3. DNA分析：扩增的DNA片段会通过基因分型技术进行分析，包括STR（短串联重复序列）分析和SNP（单核苷酸多态性）分析等。

这些分析可以确定个体之间的遗传关系。

4. 数据分析和比对：通过比对被鉴定的DNA样本和参考样本的DNA分析数据，可以确定它们之间的遗传关系，从而确认是否存在亲缘关系。

5. 结果报告：最终会得出一个结论，说明被鉴定的两个个体之间的亲缘关系。

这个结果通常会被用来作为法律证据或其他用途。

重组子鉴定的方法需要在专业实验室中进行，技术要求较高，因此通常由经验丰富的专业人员进行操作。

同时，严格的实验室标准和质量控制也十分重要，以确保结果的准确性和可靠性。

毕赤酵母表达（pichia pastoris expression ）实验手册2010-07-15 10:54:56| 分类：毕赤酵母| 标签：|字号大中小订阅一．毕赤酵母表达常用溶液及缓冲液的配制二．毕赤酵母表达的培养基配制三．主要试验环节的操作 3.1 酵母菌株的分离纯化 3.2 pPICZαA原核宿主菌TOP10F’的活化培养 3.3毕赤酵母表达的试验方法 3.4 毕赤酵母电转化方法 3.5 Pichia酵母表达直接PCR鉴定重组子的方法 3.6 毕赤酵母基因组提取方法 3.7 Mut+表型重组酵母的诱导表达实验关键词：酵母实验毕赤酵母表达 pichia pastoris expression 毕赤酵母酵母菌株大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、周期短、生产成本低。

然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。

大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。

另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。

包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。

大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。

但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。

近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，原因是与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，除了具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点外，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻译后加工、修饰的不足。

毕赤酵母表达系统毕赤酵母表达系统前言：所用表达质粒有pPIC3.5K,pAO815用于胞内表达，而pPIC9K用于分泌表达，所有载体均利用AOX1启动子来诱导高水平表达。

抗性选择：最有效的筛选遗传霉素抗性及高抗性克隆的程序需要先对HIS＋转化子进行选择，再进行不同水平遗传霉素抗性筛选。

毕赤菌株表型：毕赤酵母菌GS115 及KM71 在组氨酸脱氢酶位点（His4）有突变,因而不能合成组氨酸，所有表达质粒都有HIS4 基因可与宿主进行互补，通过不含组氨酸的培养基来选择转化子。

GS115 及KM71都可在复合培养基如YPD（YEPD）及含组氨酸的最小培养基中生长。

转化之前，GS115 及KM71 都不能在最小培养基中生长，因为它们是His-。

培养温度：毕赤酵母生长温度为28-30度（液体、平板、斜面）。

在32 度以上诱导生长时，对蛋白表达有害，甚至会导致细胞死亡。

贮存：贮存细胞几周或几月，用YPD培养基或YPD 琼脂斜面1 挑取所需菌株单克隆在YPD 平板上划线生长；2 挑取单克隆转移至YPD进行穿刺培养，30 度2 天；3 细胞在4 度可放几周几月或几年，存于－80度1 挑取所需菌株单克隆在YPD 中过夜培养；2 收集细胞，在含15%甘油的YPD 中悬浮至终OD600 为50-100（大约2.5-5.0×109细胞/ml）；3 细胞先用液氮或干冰/酒精浴中冰冻再贮存于-80 度。

注意：在4 度或－80 度长期保存后，用之前建议在MM、MD 或MGY 平板上划线培养以检测His+转化子的表型是否正确及其活力。

以质粒pPIC9K，酵母Pichia pastoris GS115为例说明做法。

载体pPIC9K酶切为点线性化质粒DNA：建议使用下列方法线性化载体以获得Mut+及Muts重组子，可能其中一个会比另一个更利于表达多拷贝重组子。

如果只想得到Muts 重组子，使用KM71 菌株。

单个十字交换事件可比双重十字交换更容易、更有效地获得Muts 重组菌（例如：插入AOX1或his4 而不是取代AOX1）。

毕赤酵母表达系统的构建1.确定转入的目的基因，并设计相应引物，进行PCR反应，获取目的基因片段。

（所需药品-高保真酶，引物，dntp，胶回收试剂盒。

）2.对目的基因及载体Ppic9k进行酶切产生粘性接头并纯化回收。

（所需药品- SalI、StuI、SacI 【用于于GS115产生His+Mut+】；BglII【用于于GS115产生His+Muts】）酶切体系酶切体系50 μL目的DNA 10 μL酶切缓冲液 5 μL限制性内切酶 1 μL超纯水34μL37 ℃酶切 1～4小时。

酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析。

3.将酶切正确的目的片度与质粒相连（所需药品-连接试剂盒SolutionⅠ[宝生物]）载体DNA0.5µL目的片段DNA 4.5µL连接试剂盒SolutionⅠ 5 µL充分混匀，置于16 ℃连接4 h或4 ℃连接过夜。

4.转入DH5α扩繁质粒（所需药品- A mp；DH5α；CaCl2）将DNA目的片段和载体的连接产物与200µL感受态细胞混匀，冰浴30min。

45℃热击45-60s，冰浴3min后加入800μL LB 液体培养基37℃震荡培养1h。

（1 ）转化后，将转化混合物涂在含50-100ug/ul A mp 的LB平板上，选择A mp 抗性克隆（2）挑取10 个A mp 抗性转化子，接种含150ug/ul A mp 的培养基，37 度振荡培养过夜（3 ）提取质粒进行PCR及酶切检测并送交测序。

（pPIC9k 测序时，用α-factor 引物及3’AOX1 测序引物。

将引物重悬于20ul灭菌水中，制成0.1ug/ul 溶液）4 在0.85ml 过夜培养菌液中加入0.15ml 灭菌甘油，以便保存所需克隆，涡旋混匀转入标记好的储存管中。

在液氮或干冰/酒精浴中冷冻后移入-70 度保存。

5 测序证实结构正确后，可准备转化DNA5.毕赤酵母电转化：细胞准备：毕赤酵母感受态制备：（1）取1 mL GS115过夜培养物(OD6006．0～10．0)转接于100 mL YPD液体培养基中28℃-3O℃、250—300 r／min培养至酵母菌的对数生长期(OD600 1．0～1．3)（2）取此菌1 mL分装到1．5 mL EP管中，4℃、10 000 g离心1 min，弃上清液，沉淀用无菌水(4℃预冷)洗涤，同样条件下离心，弃上清液。

毕赤酵母同源重组的原理及目的基因整合方式毕赤酵母同源重组的原理及目的基因整合方式通过转化DNA与毕赤酵母基因组中同源序列的同源重组，毕赤酵母与酿酒酵母一样可产生稳定的阳性转化子。

这些重组的菌株在无选择压力条件下，即使其携带的基因是多拷贝的，也表现出极度稳定性。

常用的表达载体都含有HIS4基因，编码组氨酸脱氢酶基因，这些载体经限制性内切线性化以后，可在AOX1或his4位点进行同源重组，从而产生HIS+重组子。

单交换插入比双交换（替换）要更容易发生，多拷贝事件自发发生的几率只有单交换几率的1-10%。

1. 基因插入AOX1或aox1::AGR4位点GS115 的AOX1或KM71 的aox1::AGR4 位点可以与载体上AOX1位点（AOX1 启动子，AOX1 转录终止子TT或下游3’AOX1三个位点发生同源重组，这样就在AOX1 或aox1::AGR4 基因的上游或下游插入一个或多个基因拷贝。

因为插入的表达盒没有破坏原有基因组中的AOX1，所以转化子在GS115 中为HIS+ Mut+表型，在KM71 中为HIS+Muts表型。

2. 基因替换AOX1位点在his4 菌株如GS115 中，载体及基因组中AOX1启动子及3’AOX1 区的双交换事件(取代)，结果AOX1 编码区全部被取代，产生HIS＋Muts 表型。

以AOX1 位点由基因替代而产生的Muts表型作为指示，可很容易地筛选出HIS＋转化子的Mut 表型。

基因取代的结果是缺失了AOX1 位点（Muts），增加了含有pAOX1、目的基因、HIS4的表达盒。

基因取代（双交换事件）不如基因插入（单交换事件）发生得多。

3. 基因插入His4位点GS115（Mut+）或KM71（Muts）中，载体上HIS4 基因与染色体上his4 位点之间发生单交换事件，结果在his4位点插入一个或多个基因拷贝。

由于基因组上AOX1或aox1::AGR4 位点未发生重组，这些His＋转化子的表型均与亲本菌株相同。

毕赤酵母电转化方法及转化子的筛选菌体的准备：1.挑取酵母单菌落,接种至含有5 ml YPD 培养基的50ml三角瓶中,30C、2 50 —300r/min培养过夜；2.取100-5 0 0 口〔W 1:100〕的培养物接种至含有50ml新鲜培养基的200mL三角摇瓶中,28~30C、250-30 0 r/m i n 培养过夜〔约20h〕,至OD60O 到达 1.3~1.5;3.将细胞培养物于4 C, 1500g离心5 mi n ,用50ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；4 . 按步骤3离心,用2 5ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬5 . 按步骤3离心,用2 -5ml,1M的冰预冷山梨醇溶液将菌体沉淀重悬；6 .按步骤3 离心,用1 60 d的冰预冷的1mo 1的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬,其终体积约为240 ul;备注：可将其分装为8 0.一份的包装-70冷冻起来,2周之内使用,但会影响其转化效率. 比方常见的pPIC9K的载体转GS 115 一般先用MD平板初筛,然后长出的克隆子可以挑到不同浓度的含G4 1 8抗性的YPD平板上筛选高拷贝.对正确筛选出的单菌落接YPD小瓶摇活后,转大瓶B MGY摇瓶发酵.一般对于甲醇诱导菌株,摇瓶一天左右后开始补加甲醇, 就类似BMMY 的功能了.? KM71比GS 11 5生长的要慢.毕赤酵母都应该是白色菌落的? 对于LOX家族蛋白的表达,可尝试在酵母培养基中参加C u 2+离子,提升表达量和蛋白活性?菌种保存：挑单克隆到YPD中培养1 8 -2 4 h ,然后取菌液以1 :1参加30%M菌甘油,-8 0 °Cul/管冻存〔一般用10ug以上质粒用S alI酶切,然后直接加乙醇沉淀,7 0 %乙醇洗一遍,约20ul d dH2O重溶.转化效率一般大于100个克隆每ugDNA.建议你不要用胶回收kit,回收的D NA可能还有盐,导致电击时放电时间很短.乙醇沉淀主要步骤如下：1〕酶切体系〔8 0 ul〕中2倍体积的无水乙醇加1/1 0体积的PH5.2 NaAC,混匀2〕-20C 20 分钟沉淀3 〕1 3 2 0 0rpm, 2 0min,离心后弃上清4?〕7 5%乙酉I 3 0 0u 1轻轻洗,同上离心5 m in,弃上清5〕3 7度烘箱至无乙醇气味〔或是用搔压的出风口吹出的暖风吹〕.20〕6?ul ddH2O重溶〕电击转化：8. 将5 ~20 2的线性化DNA溶解在5-10科l TE溶液中,与80 d的上述步骤6 所得的菌体混匀,转至0.2cm冰预冷的电转化杯中；9.将电转化杯冰浴5mi n ;10.根据电转化仪提供的资料,参考其他文献及屡次摸索,确定适宜的电压、电流、电容等参数,按优化的参数,进行电击；1 1.电击完毕后,马上参加1ml 1M的冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀,转至1.5ml的EP管中；〔置于30度摇床低速培养1h,再涂板〕12.将菌体悬液涂布于M D平板上,每2 0 0 ~ 6 00 pl涂布一块平板；13.将平板置于30 c倒置培养,直至单个菌落出现〔3-4天〕.推荐：电压1.5kV ;电容2 5^F电阻2 0 0 Q o电击时间为 4 ~ 10msec=P i chia酵母表达直接PCR鉴定重组子的方法1.平板上的菌落长到肉眼可见时〔约12小时〕；2,取1ml酵母悬液4000rmp离心,pbs重悬,煮沸5 mins,放到冰上5 mins,直接就可以用做pc r的模板了3,将除了模板之外的其它P CR反响液的组分准备好,并分装.3.用灭菌的牙签挑取菌落,在PCR管中涮一下,PCR扩增,禾I」用5AOX 1和3'AOX 1引物对转化子进行PCR复筛,同时检测基因插入〔如果重组质粒以单交换的方式整合到P i ch ia pas tor i s基因组,那么会扩增到两条带,一条为 2.2k b 〔KM7 1为3 .6k b〕宿主茵AOXI基因,另一条为包括目的基因和成熟肽序列和a-facto r信号肽序列的片段.〕Ea ch 50皿aliq u ot of competen t Pichia c e lls with3g由n ea rize d p1a s midD NA wi 1 l y ield50 co 1 on i es on selecti v e medium.M u t s 表型重组酵母的诱导表达实验As a g e n er a l ru1 e whe n i n ducing exp ression,n ever a ll o w c ultu r est o be more than10-30% of y o ur total f lask volume.1,挑选一单菌落,置于装有5 0ml MGY、BMG或BMGY培养基的50 0 ml摇瓶中,于28 -30 C /2 5 0- 3 00 r pm 培养至OD600 = 2—6 〔-1 6 - 1 8 h〕;2,室温下1 5 0 0 ~300 0 g离心^5 m i n,收集菌体,用1 /5至U 1/1 0原培养体积的MM, BMM 或BMMY 重悬菌体〔约2.5~5ml 〕;3,将步骤2 所得的菌液置于100ml的摇瓶中,用双层纱布或粗棉布封口,放置于2 8 -30 °C/ 2 5 0 - 300 rpm的摇床上继续生长；4,每24 h向培养基中添加1 00 %甲醇至终浓度为0. 5 ~1.0%;5,按时间点分别取菌液样品,取样量为1ml,置于1.5 ml EP 管中,最大转速离心2~ 3 min ,分别收集上清和菌体, 分析目的蛋白的表达量和菌液最正确收获时间.时间点一般取：0、2 4、48、72、96 和 1 2 0 h;6. 对分泌表达,别离样品的上清液；对胞内表达,别离样品的菌体沉淀,带检测样品用液氮或干冰速冻后,于—80 ° C保存备用；7, 可以用S DS-PAG E、Western-B lo t及活性实验检测与鉴定重组蛋白的表达.Mu t +表型重组酵母的诱导表达实验1. 挑选一单菌落,置于装有25ml MG Y、BMG或BMGY培养基的2 50m l摇瓶中,于28-30 ° C/250-30 0rpm培养至OD6O0 = 2-6 〔〜16-18 h〕;2,室温下1500-3 000 g离心5m i n,收集菌体,用M M、BMM或BMMY重悬菌体,使O D600 =1. 0 左右〔约 1 00~200ml〕;3.将步骤2所得的菌液置于1L的摇瓶中,用双层纱布或粗棉布封口,放置于28-30° C/250- 3 00 rpm的摇床上继续生长；4,每2 4 h向培养基中添加1 00%甲醇至终浓度为0 .5〜1.0%;5,按时间点分别取菌液样品, 取样量为Im l,置于1. 5ml EP管中,最大转速离心2~3min, 分别收集上清和菌体,分析目的蛋白的表达量和菌液最正确收获时间.时间点一般取：0、6、12、24、36、48、60、72、84 和9 6h;6.对分泌表达,别离样品的上清液；对胞内表达,别离样品的菌体沉淀,带检测样品用液氮或干冰速冻后,于-80° C保存备用；7. 可以用SDS-PAGE、Wester n-Blot及活性实验检测与鉴定重组蛋白的表达.BMG Y和BM MY的换液方式有2种：1.一种是离心换液,即在生长培养结束后,转移到灭菌大离心管中,4 0O0rpm室温离心5 分钟后,用BMMYfc下菌体,再转移到摇瓶,整个过程均用灭菌移液管操作.2〕另一种是静止换液,即在生长培养结束后,将摇瓶在无菌室静止4小时后,直接在酒精灯旁倾倒培养液,再参加诱导培养基,此种方法的缺点有少量生长培养基残留.是离心换液或者静止换液,到底那个好,只有根据自己的实验结果来考量.如果只是从防治污染的角度来说,静止换液也好一些,由于操作毕竟少一些,速度也快.用新开启的分析纯甲醇,一直放在无菌室里面,每次直接用灭菌T IP吸取参加摇瓶就可以了.也有人试过用膜过滤,结果膜都溶解了.菌体是在BMM件培养的,可以不用BMMY做对照,在6 0 0nm处测OD值,培养基和P B S 光吸收都很低,P B S更方便.麦芽浸提液培养酵母〔不换液,补料〕,生长阶段结束后,密度可到达10-12,诱导培养结束后,密度可到达1 8左右.如果用1体积白M0,在生长阶段结束后,换液时 ,参加1/10 — 1/2体积白MMYS行诱导培养〔即浓缩培养〕,细胞密度也可到达20以上.通常,真正的高密度发酵只有在发酵罐里才能实现,OD 600可到达40- 6 0及以上.摇瓶很难到达那样的密度,不过可以采取浓缩培养的方式实现高密度.摇瓶不能像发酵罐那样保证通气量,但可以通过装量来暂时替代这个指标.,SMu t +/Mu t 的筛选用Sac I,Sa 1 I or S t u I线性化插入HIS4位点的载体转化GS15 5后,多数转化子应为Mut+,但也有Hi s Mut '的转化子存在(见Invitr ogen protocol p36), Not I o r Bgl 11线性化插入AOX I位点的载体转化GS155后,用MD/MM 平板可区分M ut+/Mu St .Use the p 1 a t es c o nt a in i ng the H i s + t a ans f orma n t s and scre e n f or the Mut+ and MutS ph e no type as d escrib e d below.2.U sing a st e ril e to othpick , pick one c o lony and s t reak o r patch one H i s+ tr a nsforman tin aregular patte r n on bot h an MM plate an dan M D p late, m aking s u re topatcht h e MM p 1 ate firs t .3.U se a new to o thpick f or each t r a nsform ant and con tinueunt i l1 00tr a n s form a nts have b ee n patch e d (2—3 p lates).4.T o different i a t e Mut+ fr o m Mu tS, make one patch forea c hof t h e contr ols (GS11 5/His+ M u tSA 1 b u min an d GS11 5 / H i s+ Mut+3 -g al) ont o theMD and M M pl a t es.5.Incu b ate t he p 1 ates at 30 ℃ for 2 days.6.After 2 days or 1 onger at 3 0C, s core t h e plates. Mut + tra n sforma n ts w ill grow well on both M D and MM pl a tes. Mut S tr a n s f o rmants will grow we ll o n M D plate s , b ut sh o w litt 1 e o r no growth o n t he MM pla t es.。