实验五蛋白质的沉淀和变性实验
一、实验目的
1.加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。
2.了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。
3.了解蛋白质变性与沉淀的关系。
二、实验原理
在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。蛋白质的沉淀反应可分为两类。
1.可逆的沉淀反应。
此时蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引起沉淀的因素后，蛋白质的沉淀仍能溶解在原来的溶剂中，并保持其天然性质而不变性。如大多数蛋白质的盐析作用或在低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用于蛋白质。提纯蛋白质时，常利用此类反应。
2.不可逆沉淀反应。
此时蛋白质分子内部结构发生大改变，蛋白质常因变性而沉淀，不再溶于原来的溶剂中。如加热引起的蛋白质沉淀于凝固，蛋白质于重金属离子或某些有机酸的反应都属于此类反应。
蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电荷）并不析出。因此变性蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性。
三、实验材料、器材与试剂
1.材料
鸡蛋清的水溶液（新鲜鸡蛋清：水=1：9）。
2.器材
（1）试管及试管架；
（2）吸量管；
（3）滴灌；
（4）小烧杯；
（5）容量瓶。
3.试剂
（1）3%硝酸银溶液；
（2）5%三氯乙酸溶液
（3）95%乙醇；
（4）饱和硫酸铵溶液；
（5）硫酸铵结晶粉末。
四、实验方法
1. 蛋白质的盐析
中性无机盐（硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等）的浓溶液能析出蛋白质。盐的浓度不同，析出的蛋白质也不同。如球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中析出，而清蛋白则在饱和硫酸铵溶液中才能析出。由盐析获得的蛋白质沉淀，当降低其盐类浓度时，又能再溶解，故蛋白质的盐析是可逆的过程。
加蛋清溶液5mL于试管中，再加入等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置数分钟则析出球蛋白的沉淀。倒出少量浑浊沉淀，加少量水，观察是否溶解，为什么？将管内容物过滤，向滤液中加硫酸铵粉末到不再溶解为止，此时析出的沉淀为清蛋白。取出部分清蛋白，加少量蒸馏水，观察沉淀的再溶解。
2.重金属离子沉淀蛋白质。
重金属离子与蛋白质结合成不溶于水的复合物。
取一支试管，加入蛋白质溶液2mL，再加3%硝酸银溶液1～2滴，振荡试管有沉淀生成，放置片刻，倾去上清液，向沉淀中加入少量的水，沉淀是否溶解？为什么？
3.某些有机酸沉淀蛋白质。
取一支试管，加入蛋白质溶液2mL再加入1mL5%三氯乙酸溶液，振荡试管，观察沉淀的生成。放置片刻，倾去上清液，向沉淀中加入少量水，观察沉淀是否溶解。
4.有机溶剂沉淀蛋白质。取一支试管，加入2mL蛋白质溶液，再加入2mL95%乙醇，混匀，观察沉淀的生成。
五、实验结果
略
强氧化性是如何破坏蛋白质的？ 首先，先认识蛋白质的空间结构。基本上都是外部是亲水的，内部的功能区域是疏水的（球状蛋白基本是这样的）。 氨基酸中 侧链亲水的有： 甘氨酸； 带羟基的丝氨酸（Ser），苏氨酸(Thr)，酪氨酸(Tyr)； 带巯基的半胱氨酸(Cys)； 带酰胺基的天冬酰胺(Asn)，谷氨酰胺(Gln)； 酸性的赖氨酸(Lys)，精氨酸(Arg)，组氨酸(His)， 以及碱性的天冬氨酸(Asp)，谷氨酸(Glu)。 侧链疏水的有： 侧链烷基的丙氨酸(Ala)，缬氨酸(Val)，亮氨酸(leu)，甲硫氨酸(Met)，异亮氨酸(Ile)；带吲哚基的色氨酸(Trp)； 带苯环的苯丙氨酸(Phe)； 带吡咯环的脯氨酸(Pro)。 由上可知，外部亲水的羟基，巯基都是还原性基团： 羟基被氧化的酮羰基，醛基或羧基（酪氨酸的酚羟基被洋洋为什么，我就不知道）。 巯基被氧化为磺基，要是在酸性条件下，磺基是可以脱离的，这也是用二氧化硫漂白的纸张变黄的原因。 另外色氨酸中吲哚基含有碳碳双键，具有还原性。 故强氧化性可以使蛋白质变性。 碱性条件是如何破环蛋白质的？ 碱性条件可以破环除色氨酸外的所有氨基酸。 碱性条件氢氧根跟氨基作用，使氨基脱离形成氨水，气化跑掉。色氨酸能保留的下来的原因是色氨酸吲哚基中的氮是以亚氨基的形式存在。至于为何，目前我解释不了。 酸性条件是如何破环蛋白质的？ 酸性条件可以破环含羟基的氨基酸的羟基。具体我不知道，没修炼到家，只是我根据老师给的资料推测的。 酸性条件可以破环色氨酸色氨酸吲哚基中的亚氨基被破环，我想应该是被还原成氨基。 至于重金属离子使蛋白质变性的原因，我也不清楚。 以上只是草草的解释，具体涉及原子作用里的问题，我的有机化学没学好，有待进一步深造。这些都是改变物理条件也不能恢复的反应，故是蛋白质变性的因素。 至于为什么强还原性不能使蛋白质变性？ 还原性最强的是金属单质（我知道的好像就金属单质），以上氨基酸的官能团，不是惰性基
P13三、5 、常用蛋白质沉淀方法有哪些？列举沉淀应用的实例 蛋白质分子凝聚从溶液中析出的现象称为蛋白质沉淀(precipitation)，变性蛋白质一般易于沉淀，但也可不变性而使蛋白质沉淀，在一定条件下，变性的蛋白质也可不发生沉淀。 常用蛋白质沉淀的方法有： (一)盐析(Salting Out) 在蛋白质溶液中加入大量的中性盐以破坏蛋白质的胶体稳定性而使其析出，这种方法称为盐析。常用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等。例如用半饱和的硫酸铵来沉淀出血清中的球蛋白，饱和硫酸铵可以使血清中的白蛋白、球蛋白都沉淀出来，盐析沉淀的蛋白质，经透析除盐，仍保证蛋白质的活性。 (二)重金属盐沉淀蛋白质 蛋白质可以与重金属离子如汞、铅、铜、银等结合成盐沉淀。重金属沉淀的蛋白质常是变性的，但若在低温条件下，并控制重金属离子浓度，也可用于分离制备不变性的蛋白质。如临床上利用蛋白质能与重金属盐结合的这种性质，抢救误服重金属盐中毒的病人，给病人口服大量蛋白质，然后用催吐剂将结合的重金属盐呕吐出来解毒。 (三)生物碱试剂以及某些酸类沉淀蛋白质 蛋白质又可与生物碱试剂(如苦味酸、钨酸、鞣酸)以及某些酸(如三氯醋酸、过氯酸、硝酸)结合成不溶性的盐沉淀。如临床血液化学分析时常利用此原理除去血液中的蛋白质，此类沉淀反应也可用于检验尿中蛋白质。 (四)有机溶剂沉淀蛋白质 可与水混合的有机溶剂，如酒精、甲醇、丙酮等，对水的亲和力很大，能破坏蛋白质颗粒的水化膜，在等电点时使蛋白质沉淀。在常温下，有机溶剂沉淀蛋白质往往引起变性。例如酒精消毒灭菌就是如此，但若在低温条件下，则变性进行较缓慢，可用于分离制备各种血浆蛋白质。
蛋白质在烹调过程中的变化 富含蛋白质的食物在烹调加工中，原有的化学结构将发生多种变化，使蛋白质改变了原有的特性，甚至失去了原有的性质，这种变化叫做蛋白质的变性。蛋白质的变性受到许多因素的影响，如温度、浓度、加工方法、酸、碱、盐、酒等。许多食品加工需要应用蛋白质变性的性质来完成，如:水煮蛋、咸蛋、皮蛋、豆腐、豆花、鱼丸子、肉皮冻等。 在烹调过程中，蛋白质还会发生水解作用，使蛋白质更容易被人体消化吸收和产生诱人的鲜香味。因此我们需要了解和掌握蛋白质在烹调和食品加工过程中的各种变化，使烹调过程更有利于保存时食物中的营养素和增进营养素在人体的吸收。 一、烹调使蛋白质变性 1、振荡使蛋白质形成蛋白糊 在制作芙蓉菜或蛋糕时，常常把鸡蛋的蛋清和蛋黄分开，将蛋清用力搅拌振荡，使蛋白质原有的空间结够发生变化，因其蛋白质变性。变形后的蛋白质将形成一张张有粘膜的网，把空气包含到蛋白质的分子中间，使蛋白质的体积扩大扩大很多倍，形成粘稠的白色泡沫，即蛋泡糊。 蛋清形成蛋泡糊是振荡引起蛋白质的变性。蛋清能否形成稳定的蛋泡糊，受很多因素的影响。蛋清之所以形成蛋泡糊，是由于蛋清中的卵粘蛋白和类粘蛋白能增加蛋白质的粘稠性和起泡性，鸡蛋越新鲜，蛋清中的卵粘蛋白和类粘蛋白质越多，振荡中越容易形成蛋泡糊。因此烹调中制作蛋泡糊，要选择新鲜鸡蛋。 如果搅拌震动的时的温度越低或振荡时间较短，蛋清形成的蛋白糊放置不久仍会还原为蛋清，因为这种情况下，只能破坏蛋白质的三、四结构，蛋白质二级螺旋结构没有拉伸开，无法形成稳定的蛋白质网。一旦失去振荡的条件，空气就会从泡沫中逸出，蛋白质又回复到原来的结构，这种变性称为可逆性。烹调和食品加工都不希望发生这种可逆变性发生，要设法提高蛋泡糊的稳定性。 向蛋清中加入一定量的糖，可以提高蛋泡糊的稳定性。蛋清中的卵清与空气接触凝固，使振荡后形成的气体泡膜变硬，不能保容较多的气体，影响蛋泡糊的膨胀。糖很强的渗透性，可以防止卵清蛋白遇空气凝固，使蛋泡糊的泡膜软化，延伸性、弹性都增加，蛋泡糊的体积和稳定性也增加。 做蛋泡糊时，容器、工具和蛋清液都不能沾油。搅打蛋清时如果沾上少量油脂就会严重破坏蛋清的起泡性能，因为油脂的表面张力大于蛋清泡膜的表面张力，能将蛋泡糊的的泡沫拉裂，泡沫中的空气很快从断裂处逸出，蛋泡糊就不能形成。
实验一蛋白质的沉淀及变性 发布时间：2010-12-23 浏览次数：850 一、实验目的 1．熟悉蛋白质的沉淀反应。 2．进一步掌握蛋白质的有关性质。 二、实验原理 蛋白质因受某些物理或化学因素的影响，分子的空间构象被破坏，从而导致其理化性质发生改变并失去原有的生 物学活性的现象称为蛋白质的变性作用。变性作用并不引起蛋白质一级结构的破坏，而是二级结构以上的高级结构 的破坏，变性后的蛋白质称为变性蛋白。 引起蛋白质变性的因素很多，物理因素有高温、紫外线、X-射线、超声波、高压、剧烈的搅拌、震荡等。化学因素 有强酸、强碱、尿素、胍盐、去污剂、重金属盐（如Hg2+、Ag+、Pb2+等）三氯乙酸，浓乙醇等。不同蛋白质对各种因 素的敏感程度不同。 用大量中性盐使蛋白质从溶液中析出的过程称为蛋白质的盐析作用。蛋白质是亲水胶体，在高浓度的中性盐影 响下脱去水化层，同时，蛋白质分子所带的电荷被中和，结果蛋白质的胶体稳定性遭到破坏而沉淀析出。经透析或 用水稀释时又可溶解，故蛋白质的盐析作用是可逆过程。盐析不同的蛋白质所需中性盐浓度与蛋白质种类及pH有关。 分子量大的蛋白质(如球蛋白)比分子量小的(如白蛋白)易于析出。改变盐浓度，使不同分子量的蛋白质分别析出。 三、实验材料 1．新鲜蛋清或血清，蛋白质溶液。 2．固体硫酸铵及饱和硫酸铵溶液。 3．95％乙醇，1％CuSO4，饱和苦味酸，0.1mol/LHAC，NaCl, 4．试管，三角漏斗、玻棒，滤纸，试管架酒精灯，移液管。 四、操作方法 1．卵清蛋白的分离
(1)、取卵清约2 ml于试管中，加等体积的饱和硫酸铵溶液，搅拌均匀，蛋白质析出，静置，用滤纸过滤致滤液澄清，沉淀为卵球蛋白，将此沉淀用2 ml半饱和硫酸铵洗涤一次。 (2)、将析出卵清球蛋白后的滤液放人试管中，再加人固体硫酸铵使之达饱和，观察有无沉淀产生，若有沉淀，则过滤之，滤出的沉淀却为卵清白蛋白。 2．乙醇沉淀蛋白质（乙醇为脱水剂，能破坏蛋白质胶体质的水化层而使其沉淀析出）。 取蛋白质滤液1ml，加晶体NaCl少许（加速沉淀并使沉淀完全）。带溶解后再加入95％乙醇2ml混匀，观察有无沉淀析出。 3．重金属盐沉淀蛋白质。蛋白质与重金属离子结合成不容性盐类而沉淀。取试管1支加蛋白质溶液2ml，滴加1％CuSO4溶液，至有沉淀生成。 4．生物碱试剂沉淀蛋白质。植物体内具有显著生理作用的含氮碱性化合物称为生物碱。能沉淀生物碱或与其产生颜色反应的物质称为生物碱试剂，如苦味酸。生物碱试剂能和蛋白质结合生成沉淀，可能因蛋白质和生物碱含有相似的含氮基团。2ml蛋白质溶液及1％醋酸溶液4－5滴，加5％苦味酸数滴。
浅谈蛋白质变性的原因 引起蛋白质变性的原因可分为物理和化学因素两类.物理因素可以是加热、加压、脱水、搅拌、振荡、紫外线照射、超声波的作用等；化学因素有强酸、强碱、尿素、重金属盐、十二烷基磺酸钠(SDS)等.在临床医学上,变性因素常被应用于消毒及灭菌.反之,注意防止蛋白质变性就能有效地保存蛋白质制剂.蛋白质的变性很复杂,要判断变性是物理变化还是化学变化,要视具体情况而定.如果有化学键的断裂和生成就是化学变化；如果没有化学键的断裂和生成就是物理变化. 1、重金属盐使蛋白质变性,是因为重金属阳离子可以和蛋白质中游离的羧（suo）基（含 C、H、O的基）形成不溶性的盐,在变性过程中有化学键的断裂和生成,因此是一个化学变化. 2、强酸、强碱使蛋白质变性,是因为强酸、强碱可以使蛋白质中的氢键断裂.也可以和游离的氨基或羧基形成盐,在变化过程中也有化学键的断裂和生成,因此,可以看作是一个化学变化. 3、尿素、乙醇、丙酮等,它们可以提供自己的羟基或羰基上的氢或氧去形成氢键,从而破坏了蛋白质中原有的氢键,使蛋白质变性.但氢键不是化学键,因此在变化过程中没有化学键的断裂和生成,所以是一个物理变化. 4、加热、紫外线照射、剧烈振荡等物理方法使蛋白质变性,主要是破坏蛋白质分子中的氢键,在变化过程中也没有化学键的断裂和生成,没有新物质生成,因此是物理变化.否则,鸡蛋煮熟后就不是蛋白质了.而我们知道,熟鸡蛋依然有营养价值,其中的蛋白质反而更易为人体消化系统所分解吸收. (1)蛋白质受热或遇到_____、____、____等化学物质，会发生化学反应，失去原有的生理 活性。（填具体物质） (2)维生素是人们不可缺少的营养物质，缺乏维生素或摄入不足，会导致人体患病。缺乏 维生素C，会引起___________。请例举两种富含维生素的常见食品：_________、_________等。 (2)1蛋白质受热或遇到（）、（）、（）等化学物质时,结构就会被破坏,失去 生理活性.（填类） 2变质食品中含有有毒的（）,其中（）的毒性较大. 3一氧化碳可与人体血液中的（）结合,使红细胞输氧能力降低.，尼古丁和焦油使吸烟者对香烟产生依赖性并诱发疾病.
蛋白质变性机理 1、蛋白质介绍 2、蛋白质变性结果 1)活性丧失 蛋白质的生物活性是指蛋白质所具有的酶、激素、毒素、抗原与抗体、血红蛋白的载氧能力等生物学功能。生物活性丧失是蛋白质变性的主要特征。有时蛋白质的空间结构只要轻微变化即可引起生物活性的丧失。 2）某些理化性质的改变 蛋白质变性后理化性质发生改变，如溶解度降低而产生沉淀，因为有些原来在分子内部的疏水基团由于结构松散而暴露出来, 分子的不对称性增加，因此粘度增加，扩散系数降低 蛋白质分子凝聚从溶液中析出
3）生物化学性质的改变 蛋白质变性后，分子结构松散，不能形成结晶，易被蛋白酶水解。蛋白质的变性作用主要是由于蛋白质分子内部的结构被破坏。天然蛋白质的空间结构是通过氢键等次级键维持的，而变性后次级键被破坏，蛋白质分子就从原来有序的卷曲的紧密结构变为无序的松散的伸展状结构（但一级结构并未改变）。所以，原来处于分子内部的疏水基团大量暴露在分子表面，而亲水基团在表面的分布则相对减少，至使蛋白质颗粒不能与水相溶而失去水膜，很容易引起分子间相互碰撞而聚集沉淀。 4）致变因素 引起蛋白质变性的原因可分为物理和化学因素两类。物理因素可以是加热、加压、脱水、搅拌、振荡、紫外线照射、超声波的作用等；化学因素有强酸、强碱、尿素、重金属盐、十二烷基磺酸钠(SDS)等。在临床医学上，变性因素常被应用于消毒及灭菌。 反之，注意防止蛋白质变性就能有效地保存蛋白质制剂。蛋白质的变性很复杂，要判断变性是物理变化还是化学变化，要视是物理变化 加热、紫外线照射、剧烈振荡等物理方法使蛋白质变性，主要是破坏蛋白质分子中的氢键，在变化过程中也没有化学键的断裂和生成，没有新物质生成，因此是物理变化。 否则，鸡蛋煮熟后就不是蛋白质了。而我们知道，熟鸡蛋依然有营养价值，其中的蛋白质反而更易为人体消化系统所分解吸收。 5）复性
實驗3 蛋白質的沉澱與變性反應 目的 (1)瞭解蛋白質的沉澱反應、變性作用和凝固作用的原理及它們的相互關係。 (2)學習鹽析和透析等生物化學的操作技術。 原理 在水溶液中，蛋白質分子的表面，由於形成水化層和雙電層而成為穩定 的膠體顆粒，所以蛋白質溶液和其他親水膠體溶液相類似。但是，蛋白質膠 體顆粒的穩定性是有條件的，相對的。在一定的物理化學因素影響下，蛋白 質顆粒失去電荷，脫水，甚至變性，則以固態形式從溶液中析出，這個過程 稱為蛋白質的沉澱反應。這種反應可分為以下兩種類型: 一、可逆澱汲反應 在發生沉澱反應時，蛋白質雖已沉澱析出，但它的分子內部結構並未發 生顯著變化，基本上保持原有的性質，沉澱因素除去後，能再溶於原來的溶 劑中。這種作用稱為可逆沉澱反應，又叫作不變性沉澱反應。屬於這一類的 反應有鹽析作用; 在低溫下，乙醇、丙酮對蛋白質的短時間作用以及利用等 電點的沉澱等。 二、不可逆沉澱反應
在發生沉澱反應時，蛋白質分子內部結構、空間構象遭到破壞，失去原來的天然性質，這時蛋白質已發生變性。這種變性蛋白質的沉澱不能再溶解於原來溶劑中的作用叫作不可逆沉澱反應。重金屬鹽、植物鹼試劑、過酸、過鹼、加熱、震盪、超聲波，有機溶劑等都能使蛋白質發生不可逆沉澱反應。試劑和器材 一、試劑 1．蛋白質溶液 取5m1雞蛋蛋白蛋清，用蒸餾水稀釋至100ml，攪拌均勻後用4-8層紗布過濾，新鮮配製。 2．蛋白質氯化鈉溶液 取20ml蛋清，加蒸餾水200ml和飽和氯化鈉溶液100ml，充分攪勻 後，以紗布濾去不溶物(加入氯化鈉的目的是溶解球蛋白)。 硫酸銨粉末，飽和硫酸銨溶液，3%硝酸銀，0.5% 醋酸鉛，10% 三氯醋酸，濃鹽酸，濃硫酸，濃硝酸，5% 磺基水楊酸(sulfosalicyclic acid)，0.1% 硫酸銅，飽和硫酸銅溶液，0.1% 醋酸，10% 醋酸，飽和氯化鈉溶液，10% 氫氧化鈉溶液。 二、器材 試管，試管架，小玻璃漏斗，濾紙，玻璃紙，玻璃棒，500ml 燒杯，10 ml量筒。
蛋白质的变性 湖南省长沙市长大附中高二92班莫超指导老师：胡老师 “生命是蛋白体的存在方式”，蛋白质是构成生命的物质基础。蛋白质对于我们来说再熟悉不过了，它在生产生活、医疗、生命体的活动和科学前沿上都有着举足轻重的作用，而人类健康对于蛋白质有着重要的需求和条件。为了更充分地了解蛋白质的作用和性质，我做了以下的探究实验。 实验日期：2008年11月日 实验目的： 1）掌握蛋白质的变性和盐析的区别，加深对蛋白质的理解。 2）通过设计实验、动手操作等提高自自己对实验的实践能力。 3）通过实验，感受它带给我们的乐趣，提高自己对化学的兴趣度。实验提示： 1）蛋白质的变性与凝结：蛋白质的分子表面上有大量各种极性基团，它们强烈吸引水分子，使溶液中的蛋白质成为高度水化的分 子。直接吸附在蛋白质分子表面的水分子结合得最牢固，称为结 合水，其数量约为蛋白质量的20%~50%；吸附在外层的水分子数 量更多，但结合较松散。蛋白质的水化使它在溶液中有很高的稳 定性，是典型的亲水胶体。另一方面，蛋白质在多种条件下会发 生胶凝作用，形成体积相当大的内部有很多空腔并包容着大量液 体的软胶状物体。常见的例子如鸡蛋受热时整体凝固，少量的蛋 白质将大量的水分子包围在一起凝固，不能再流动。蛋白质的凝 固通常是在发生变性作用以后产生的。蛋白质在多种情况下会发 生变性，加热和多种物理、化学或机械处理都可能使蛋白质发生 变性作用，使蛋白质的分子结构变成松散的无定形结构，分子中
的活性基团更多暴露，化学活性增强，较易发生各种化学反应和 凝结作用。变性蛋白质和天然蛋白质最明显的区别是溶解度降低，同时蛋白质的黏度增加，结晶性破坏，生物学活性丧失，易被蛋 白酶分解，即发生凝固。 2）蛋白质的盐析：在蛋白质溶液中加入某些浓的无机盐（如Na2SO4或(NH4)2SO4等）溶液后，可以使蛋白质凝聚而从溶液中析 出，这种作用叫做盐析。这样析出的蛋白质仍可以溶解在水中， 也不影响原来的性质。盐析是可逆过程。 实验用鸡蛋清溶液的制取： 取鸡蛋清25ml，加入100ml蒸馏水，搅匀后，用浸湿的纱布过滤，即可得到鸡蛋清溶液。 实验用品： 1）蛋白质来源：鸡蛋蛋清或豆浆。 2）实验所用仪器和试剂：试管、烧杯、玻璃棒、酒精灯、试管夹、胶头滴管、石棉网、三角架、蒸馏水、硝酸铅溶液、甲醛溶液、 饱和硫酸铵溶液。 实验过程： 1）实验设计依据的原理： A：高温、重金属离子、甲醛能使蛋白质变性而凝结，且凝结后的蛋白质不能溶于水，变性是化学变化。 B：在蛋白质溶液中加入盐溶液可降低蛋白质的溶解度，因而使蛋白质从深液中析出，盐析是物理变化。 应用：高温消毒、甲醛溶液保存动物标本、漂白粉消毒等；盐析用来分离和提纯蛋白质。
蛋白质变性后的方面 （一）生物活性丧失 蛋白质的生物活性是指蛋白质所具有的酶、激素、毒素、抗原与抗体、血红蛋白的载氧能力等生物学功能。生物活性丧失是蛋白质变性的主要特征。有时蛋白质的空间结构只有轻微变化即可引起生物活性的丧失。 （二）某些理化性质的改变 蛋白质变性后理化性质发生改变，如溶解度降低而产生沉淀，因为有些原来在分子内部的疏水基团由于结构松散而暴露出来,分子的不对称性增加，因此粘度增加，扩散系数降低。（三）生物化学性质的改变 蛋白质变性后，分子结构松散，不能形成结晶，易被蛋白酶水解。蛋白质的变性作用主要是由于蛋白质分子内部的结构被破坏。天然蛋白质的空间结构是通过氢键等次级键维持的，而变性后次级键被破坏，蛋白质分子就从原来有序的卷曲的紧密结构变为无序的松散的伸展状结构（但一级结构并未改变）。所以，原来处于分子内部的疏水基团大量暴露在分子表面，而亲水基团在表面的分布则相对减少，至使蛋白质颗粒不能与水相溶而失去水膜，很容易引起分子间相互碰撞而聚集沉淀。 DNA变性
DNA变性指DNA分子由稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结构的现象。变性时维持双螺旋稳定性的氢键断裂，碱基间的堆积力遭到破坏，但不涉及到其一级结构的改变。凡能破坏双螺旋稳定性的因素，如加热、极端的pH、有机试剂甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等，均可引起核酸分子变性。 变性DNA常发生一些理化及生物学性质的改变： 1）溶液粘度降低。DNA双螺旋是紧密的刚性结构，变性后代之以柔软而松散的无规则单股线性结构，DNA粘度因此而明显下降。2）溶液旋光性发生改变。变性后整个DNA分子的对称性及分子局部的构性改变，使DNA溶液的旋光性发生变化。 3）增色效应(hyperchromic effect)。指变性后DNA溶液的紫外吸收作用增强的效应。DNA分子中碱基间电子的相互作用使DNA分子具有吸收260nm波长紫外光的特性。在DNA双螺旋结构中碱基藏入内侧，变性时DNA双螺旋解开，于是碱基外露，碱基中电子的相互作用更有利于紫外吸收，故而产生增色效应。 各类连接键，结构稳定的键 多肽链中氨基酸残基的构成以及排列顺序称为氨基酸的一级结构,连接一级结构的键是肽键。氨基酸的二级结构是指氨基酸主链原子的局部空间结构,并不涉及氨基酸残基侧链构象,二级结构的种类有α-螺旋、β-折叠、β-转角儿以及无规卷曲。氢键是维系二级结构最主要的键。三级结构是指多肽链主链以及侧链原子的空间排布。次
实验蛋白质的沉淀反应与颜色反应 一、实验目的 掌握鉴定蛋白质的原理和方法。熟悉蛋白质的沉淀反应，进一步熟悉蛋白质的有关反应。 二、实验原理 蛋白质分子中某种或某些集团可与显色剂作用，产生颜色。不同的蛋白质由于所含的氨基酸不完全相同，颜色反应亦不完全相同。颜色反应不是蛋白质的专一反应，一些非蛋白物质也可产生同样的颜色反应，因此不能根据颜色反应的结果来决定被测物是否为蛋白质。另外，颜色反应也可作为一些常用蛋白质定量测定的依据。蛋白质是亲水性胶体，在溶液中的稳定性与质点大小、电荷、水化作用有关，但其稳定性是有条件的，相对的。如果条件发生了变化，破坏了蛋白质的稳定性，蛋白质就会从溶液中沉淀出来。 三、实验仪器 1、吸管 2、滴管 3、试管 4、电炉 5、pH试纸 6、水浴锅 7、移液管 四、实验试剂 1、卵清蛋白液：鸡蛋清用蒸馏水稀释10-20倍，3-4层纱布过滤，滤液放在冰箱里冷藏备用。 2、0.5%苯酚：1g苯酚加蒸馏水稀释至200ml。
3、Millon’s试剂：40g汞溶于60ml浓硝酸（水浴加温助溶）溶解后，冷却，加二倍体积的蒸馏水，混匀，取上清夜备用。此试剂可长期保存。 4、尿素晶体 5、1%CuSO 4：1g CuSO 4 晶体溶于蒸馏水，稀释至100ml 6、10%NaOH：10g NaOH溶于蒸馏水，稀释至100ml 7、浓硝酸 8、0.1%茚三酮溶液：0.1g茚三酮溶于95%的乙醇并稀释至100ml. 9、冰醋酸 10、浓硫酸 11、饱和硫酸铵溶液：100ml蒸馏水中加硫酸铵至饱和。 12、硫酸铵晶体：用研钵研成碎末。 13、95%乙醇。 14、醋酸铅溶液：1g醋酸铅溶于蒸馏水并稀释至100ml 15、氯化钠晶体 16、10%三氯乙酸溶液：10g三氯乙酸溶于蒸馏水中并稀释至100ml 17、饱和苦味酸溶液：100ml蒸馏水中加苦味酸至饱和。 18、1%醋酸溶液。 五、实验步骤 蛋白质的颜色反应 （一）米伦（Millon’s）反应
沉淀蛋白质的常用方法（TCA、乙醇、丙酮沉淀蛋白操作步骤） 2010-08-18 15:19 TCA-DOC For precipitation of very low protein concentration 1) To one volume of protein solution, add 1/100 vol. of 2% DOC (Na deoxy cholate, detergent). 2) Vortex and let sit for 30min at 4oC. 3) Add 1/10 of Trichloroacetic acid (TCA) 100% vortex and let sit ON at 4oC (preparation of 100% TCA: 454ml H2O/kg TCA. Maintain in dark bottle at 4oC.Be careful, use gloves!!!). 4) Spin 15min 4oC in microfuge at maximum speed (15000g). Carefully discharge supernatant and retain the pellet: dry tube by inversion on tissue paper (pellet may be difficult to see). [OPTION: Wash pellet twice repellet samples 5min at full speed between washes]. 5) Dry samples under vaccum (speed vac) or dry air. For PAGE-SDS, resuspend samples in a minimal volume of sample buffer. (The presence of some TCA can give a yellow colour as a consequence of the acidification of the sample buffer ; titrate with 1N NaOH or 1M TrisHCl pH8.5 to obtain the normal blue sample buffer colour.) Normal TCA To eliminate TCA soluble interferences and protein concentration 1) To a sample of protein solution add Trichloroacetic acid (TCA) 100% to get 13% final concentration. Mix and keep 5min –20oC and then 15min 4oC; or longer time at 4oC without the –20oC step for lower protein concentration. Suggestion: leave ON if the protein concentration is very low. (preparation of 100% TCA: 454ml H2O/kg TCA. Maintain in dark bottle at 4oC.Be careful, use gloves!!!). 2) Spin 15min 4oC in microfuge at maximum speed (15000g). Carefully discharge supernatant and retain the pellet: dry tube by inversion on tissue paper (pellet may be difficult to see). 3) For PAGE-SDS, resuspend samples in a minimal volume of sample buffer. (The presence of some TCA can give a yellow colour as a consequence of the acidification of the sample buffer ; titrate with 1N NaOH or 1M TrisHCl pH8.5 to obtain the normal blue sample buffer colour.) Acetone Precipitation To eliminate acetone soluble interferences and protein concentration
蛋白质纯化方法 蛋白质浓缩有多种方法，有盐析，超滤，离子交换，有机溶剂沉淀等方法。 有机溶剂沉淀法：有机溶剂能降低溶液的电解常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导致溶解度的降低；另外，有机溶剂与水的作用，能破坏蛋白质的水化膜，故蛋白质在一定浓度的有机溶剂中的溶解度差异而分离的方法，称“有机溶剂分段沉淀法”，它常用于蛋白质或酶的提纯。使用的有机溶剂多为乙醇和丙酮。高浓度有机溶剂易引起蛋白质变性失活，操作必须在低温下进行，并在加入有机溶剂时注意搅拌均匀以避免局部浓度过大。由此法析出的沉淀一般比盐析容易过滤或离心沉降，分离后的蛋白质沉淀，应立即用水或缓冲液溶解，以降低有机溶剂浓度。操作时的pH值大多数控制在待沉淀蛋白质的等电点附近，有机溶剂在中性盐存在时能增加蛋白质的溶解度，减少变性，提高分离的效果，在有机溶剂中添加中性盐的浓度为0.05mol/L左右，中性盐过多不仅耗费有机溶剂，可能导致沉淀不好。沉淀的条件一经确定，就必须严格控制，才能得到可重复的结果。医学教育`网搜集整理有机溶剂浓度通常以有机溶剂和水容积比或用百分浓度表示。有机溶剂沉淀蛋白质分辨力比盐析法好，溶剂易除去；缺点是易使酶和具有活性的蛋白质变性。故操作时要求条件比盐析严格。对于某些敏感的酶和蛋白质，使用有机溶剂沉淀尤其要小心。 可与水混合的有机溶剂，如酒精、甲醇、丙酮等，对水的亲和力很大，能破坏蛋白质颗粒的水化膜，在等电点时使蛋白质沉淀。在常温下，有机溶剂沉淀蛋白质往往引起变性。例如酒精消毒灭菌就是如此，但若在低温条件下，则变性进行较缓慢，可用于分离制备各种血浆蛋白质。
蛋白质浓缩技术是免疫学中常用的手段，现介绍几种常用的浓缩技术。 （一）透析袋浓缩法 利用透析袋浓缩蛋白质溶液是应用最广的一种。将要浓缩的蛋白溶液放入透析袋（无透析袋可用玻璃纸代替），结扎，把高分子（6 000－12 000）聚合物如聚乙二醇（碳蜡）、聚乙烯吡咯、烷酮等或蔗糖撒在透析袋外即可。也可将吸水剂配成30％－40％浓度的溶液，将装有蛋白液的透析袋放入即可。吸水剂用过后，可放入温箱中烘干或自然干燥后，仍可再用。 （二）冷冻干燥浓缩法 这是浓缩蛋白质的一种较好的办法，它既使蛋白质不易变性，又保持蛋白质中固有的成分。它是在冰冻状态下直接升华去除水分。具体做法是将蛋白液在低温下冰冻，然后移置干燥器内（干燥器内装有干燥剂，如NaOH、CaCl2和硅胶等）。密闭，迅速抽空，并维持在抽空状态。数小时后即可获得含有蛋白的干燥粉末。干燥后的蛋白质保存方便，应用时可配成任意浓度使用。也可采用冻干机进行冷冻干燥。 （三）吹干浓缩法 将蛋白溶液装入透析袋内，放在电风扇下吹。此法简单，但速度慢，且温度不能过高，最好不要超过15℃。 （四）超滤膜浓缩法 此法是利用微孔纤维素膜通过高压将水分滤出，而蛋白质存留于膜上达到浓缩目的。有两种方法进行浓缩：一种是用醋酸纤维素膜装入高压过滤器内，在不断搅拌之下过滤；另一种是将蛋白液装入透析袋内置于真空干燥器的通风口上，负压抽气，而使袋内液体渗出。 （五）凝胶浓缩法 选用孔径较小的凝胶，如SephadexG25或G50，将凝胶直接加入蛋白溶液中。根据干胶的吸水量和蛋白液需浓缩的倍数而称取所需的干胶量。放入冰箱内，凝胶粒子吸水后，通过离心除去。 （六）浓缩胶浓缩法 浓缩胶是一种高分子网状结构的有机聚合物，具有很强的吸水性能。每克干胶可吸水120ml～150ml。它能吸收低分子量的物质，如水、葡萄糖、蔗糖、无机盐等，适宜浓缩10 000分子量以上的生物大分子物质。浓缩后，蛋白质的回收率可达80％～90％。比浓缩胶应用方便，直接加入被浓缩的溶液中即可。必须注意，浓缩溶液的pH值应大于被浓缩物质的等电点，否则在浓缩胶表面产生阳离子交换，影响浓缩物质的回收率。 选择材料及预处理 以蛋白质和结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代生物学发展的主要方向，研究蛋白质，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理不外乎两方面。一是得用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于来同区域而达到分离目的，如电泳，超速离心，超滤等。在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性，防止酸、硷、高温，剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失。蛋白质的制备一般分为以下四个阶段：选择材料和预处理，细胞的破碎及细胞器的分离，提取和纯化，浓细、干燥和保存。
浅谈蛋白质变性和水解原理的烹饪应用 作者:黄五洲 摘要:蛋白质的变性与水解是烹饪化学中的重要原理,是烹饪时原料发生的各种变化中最重要的变化之一.理解蛋白质的变性与水解的理论,运用其理论指导烹饪实践,解决烹饪的相关问题,无疑对菜肴食品的色、香、味、形、质感的改善与提高有着重要的现实意义.本文谨以本人多年的烹饪学习与实践体会,浅谈蛋白质的变性与水解,以求与烹饪同行作为学习交流,以求对烹饪后学者有所指点帮助 关键词:蛋白质变性.水解 论文正文 一.蛋白质的理解 蛋白质是一种结构十分复杂的高分子有机化合物。由碳、氢、氧、氮等元素构成。 蛋白质是食物原料, 特别是肉食性原料的主要组成分(一般的食物原料, 蛋白质与水分、碳水化合物、脂类即点有原料有效成分的95%多), 豆类、蛋类、各种瘦肉和鱼类含蛋白质较丰富13%～18%。粮谷类的蛋白质含量为7%～10%。蔬菜为0.9%～2%。因此说, 蛋白质在烹饪过程中的变化, 是食物原料烹饪过程中最重要变化, 学习、关注蛋白质的烹饪变化情况, 对烹饪菜肴食品的色、香、味、形以及质感的调整有着重要的指导意义 二.蛋白质的变性与水解的概念认识 蛋白质在温度、酸、碱、盐、有机溶剂、机械作用、紫外线照射等物理化学因素作用下，内部的分子高度规则性排列发生了变化，使蛋白质改变了原来的性质，这就是蛋白质变性。原料内蛋白质变性，有利于人体消化液对蛋白质的消化吸收，并可形成菜品特殊的形态、口感和滋味。 肉料蛋白质变性后，若继续加热，蛋白质会发生水解，形成多肽，这些多肽类物质进一步水解，最后分解成各种氨基酸，溶于汤汁中，使汤汁有鲜味。 三. 蛋白质的变性的烹饪应用 1.温度使蛋白质变性 ⑴烹饪熟处理 肉料须经过加热至蛋白质变性才是成熟。成熟的肉与生肉相比，无论在形态、口感，还是滋味方面，都有极大的区别。 事实上, 烹饪更多的利在利用温度使蛋白质发生应有的变化,从而获得良好的色、香、味、形、质感,使之成为美食,使烹饪成为一种艺术 ⑵温度使蛋白质变性,从而形成菜肴良好的形态 利用蛋白质变性原理,在带有一定韧性的动物原料表面刻切花刀,经焯水处理,能获得菜肴食品优美的形态.
蛋白质沉淀法 在生化制备中，沉淀主要用于浓缩目的，或用于除去留在液相或沉淀在固相中的非必要成分。在生化制备中常用的有以下几种沉淀方法和沉淀剂： 1．盐析法多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。 2．有机溶剂沉淀法多用于生物小分子、多糖及核酸产品的分离纯化，有时也用于蛋白质沉淀。 3．等电点沉淀法用于氨基酸、蛋白质及其它两性物质的沉淀。但此法单独应用较少，多与其它方法结合使用。 4．非离子多聚体沉淀法用于分离生物大分子。 5．生成盐复合物沉淀用于多种化合物，特别是小分子物质的沉淀。 6．热变性及酸碱变性沉淀法用于选择性的除去某些不耐热及在一定PH值下易变性的杂蛋白。 第一节盐析法 一般来说，所有固体溶质都可以在溶液中加入中性盐而沉淀析出，这一过程叫盐析。在生化制备中,许多物质都可以用盐析法进行沉淀分离，如蛋白质、多肽、多糖、核酸等，其中以蛋白质沉淀最为常见，特别是在粗提阶段。 盐析法分为两类，第一类叫Ks分段盐析法，在一定PH和温度下通过改变离子强度实现，用于早期的粗提液；第二种叫b分段盐析法，在一定离子强度下通过改变PH和温度来实现，用于后期进一步分离纯化和结晶。 一．影响盐析的若干因素 1．蛋白质浓度 高浓度蛋白溶液可以节约盐的用量，但许多蛋白质的b 和Ks常数十分接近，若蛋白浓度过高，会发生严重的共沉淀作用；在低浓度蛋白质溶液中盐析，所用的盐量较多，而共沉淀作用比较少，因此需要在两者之间进行适当选择。用于分步分离提纯时，宁可选择稀一些的蛋
白质溶液，多加一点中性盐，使共沉淀作用减至最低限度。一般认为2.5%-3.0%的蛋白质浓度比较适中。 2．离子强度和类型 一般说来，离子强度越大，蛋白质的溶解度越低。在进行分离的时候，一般从低离子强度到高离子强度顺次进行。每一组分被盐析出来后，经过过滤或冷冻离心收集，再在溶液中逐渐提高中性盐的饱和度，使另一种蛋白质组分盐析出来。 离子种类对蛋白质溶解度也有一定影响，离子半径小而很高电荷的离子在盐析方面影响较强，离子半径大而低电荷的离子的影响较弱，下面为几种盐的盐析能力的排列次序：磷酸钾>硫酸钠>磷酸铵>柠檬酸钠>硫酸镁。 3．PH值 一般来说，蛋白质所带净电荷越多溶解度越大，净电荷越少溶解度越小，在等电点时蛋白质溶解度最小。为提高盐析效率，多将溶液PH值调到目的蛋白的等电点处。但必须注意在水中或稀盐液中的蛋白质等电点与高盐浓度下所测的结果是不同的，需根据实际情况调整溶液PH值，以达到最好的盐析效果。 4．温度 在低离子强度或纯水中，蛋白质溶解度在一定范围内随温度增加而增加。但在高浓度下，蛋白质、酶和多肽类物质的溶解度随温度上升而下降。在一般情况下，蛋白质对盐析温度无特殊要求，可在室温下进行，只有某些对温度比较敏感的酶要求在0-4℃进行。 二．硫酸铵的使用 硫酸铵中常含有少量的重金属离子，对蛋白质巯基有敏感作用，使用前必须用H2S处理：将硫酸铵配成浓溶液，通入H2S饱和，放置过夜，用滤纸除去重金属离子，浓缩结晶，100℃烘干后使用。另外，高浓度的硫酸铵溶液一般呈酸性（PH=5.0左右），使用前也需要用氨水或硫酸调节至所需PH。 硫酸铵的加入有以下几种方法：1）加入固体盐法用于要求饱和度较高而不增大溶液体积的情况；2）加入饱和溶液法用于要求饱和度不高而原来溶液体积不大的情况；3）透析平衡法先将盐析的样品装于透析袋中，然后浸入饱和硫酸铵中进行透析，透析袋内硫酸铵饱和
蛋白质变性 蛋白质的变性既有物理变化，也有化学变化： 蛋白质是由多种氨基酸通过肽键构成的高分子化合物，在蛋白质分子中各氨基酸的结合顺序称为一级结构：蛋白质的同一多肽链中的氨基和酰基之间可以形成氢键，使得这一多肽链具有一定的构象，这些称为蛋白质的二级结构；多肽链之间又可互相扭曲折叠起来构成特定形状的排列称为三级结构，三级结构是与二硫键，氢键等联系着的。变性作用是蛋白质受物理或化学因素的影响，改变其分子内部结构和性质的作用。一般认为蛋白质的二级结构和三级结构有了改变或遭到破坏，都是变性的结果。能使蛋白质变性的化学方法有加强酸，强碱，重金属盐，尿素，乙醇，丙酮等；能使蛋白质变性的物理方法有加热，紫外线照射，剧烈振荡等。重金属盐使蛋白质变性，是因为重金属阳离子可以和蛋白质中游离的羧基形成不溶性的盐，在变性过程中有化学键的断裂和生成，因此是一个化学变化。 强酸、强碱使蛋白质变性，是因为强酸、强碱可以使蛋白质中的氢键断裂。也可以和游离的氨基或羧基形成盐，在变化过程中也有化学键的断裂和生成，因此，可以看作是一个化学变化。 尿素、乙醇、丙酮等，它们可以提供自己的羟基或羰基上的氢或氧去形成氢键，从而破坏了蛋白质中原有的氢键，使蛋白质变性。但氢键不是化学键，因此在变化过程中没有化学键的断裂和生成，所以是一个物理变化。加热、紫外线照射，剧烈振荡等物理方法使蛋白质变性，主要是破坏厂蛋白质分子中的氢键，在变化过程中也没有化学键
的断裂和生成，没有新物质尘成，因此是物理变化。否则，鸡蛋煮熟后就不是蛋白质了。 从以上分析可以看出，蛋白质的变性既有物理变化，也有化学变化。但蛋白质的变性是很复杂的，要判断变性是物理变化还是化学变化，要视具体情况而定。如果有化学键的断裂和生成就是化学变化；如果没有化学键的断裂和生成就是物理变化。 天然蛋白质的严密结构在某些物理或化学因素作用下，其特定的空间结构被破坏，从而导致理化性质改变和生物学活性的丧失，如酶失去催化活力，激素丧失活性称之为蛋白质的变性作用(denaturation)。变性蛋白质只有空间构象的破坏，一般认为蛋白质变性本质是次级键，二硫键的破坏，并不涉及一级结构的变化。 变性蛋白质和天然蛋白质最明显的区别是溶解度降低，同时蛋白质的粘度增加，结晶性破坏，生物学活性丧失，易被蛋白酶分解。 引起蛋白质变性的原因可分为物理和化学因素两类。物理因素可以是加热、加压、脱水、搅拌、振荡、紫外线照射、超声波的作用等；化学因素有强酸、强碱、尿素、重金属盐、十二烷基磺酸钠(SDS)等。在临床医学上，变性因素常被应用于消毒及灭菌。反之，注意防止蛋白质变性就能有效地保存蛋白质制剂。 变性并非是不可逆的变化，当变性程度较轻时，如去除变性因素，有的蛋白质仍能恢复或部分恢复其原来的构象及功能，变性的可逆变化称为复性。例如，前述的核糖核酸酶中四对二硫键及其氢键。在β 巯基乙醇和8M尿素作用下，发生变性，失去生物学活性，变性后如
蛋白质变性和凝固 蛋白质分子在一定的物理或化学因素的影响下，其分子结构发生改变，从而改变蛋白质的性质，这个变化叫蛋白质的变性。变性后的蛋白质尽管它的化学组成没有改变，但空间构型已遭破坏，内部某些特征已发生改变，因此，原有生物活性也发生变化。同时也不再溶于水，从溶液中凝结沉淀出来，这个过程叫蛋白质的凝固。高温灭菌消毒，就是利用加热使蛋白质凝固从而使细胞死亡。 有关蛋白质的结构 A.氨基酸 (1)每个氨基酸分子都具有中心碳原子，至少都有一个氨基和一个羧基，并且都有一个氨基和一个羧基连接在该碳原子上。注意理解“至少”的含义，比如当R基含有氨基或羧基时，这个氨基酸分子就不只有一个氨基和羧基了，同时还要注意氨基酸分子中都有一个氨基和羧基直接连在同一个碳原子上。 (2)不同的氨基酸分子具有不同的R基，细胞内构成蛋白质的大约20种氨基酸，在结构上的主要区别就是R基结构的不同。 B.二肽 (1)由两个氨基酸分子脱水缩合而成，失去水分子中的氢分别来自羧基和氨基。 (2)二肽化合物中，连接两个氨基酸分子的那个键(—CO—NH—)叫肽键。
C.多肽 (1)由多个氨基酸分子缩合而成的含有多个肽键的化合物，因其呈链状，也称肽链。 (2)注意区分肽、肽键和肽链：肽键是肽的连接结构，而肽链是多肽的空间结构。 (3)氨基酸间脱水缩合时，原来的氨基和羧基已不存在，形成的化合物即多肽的一端只有一个氨基，另一端只有一个羧基(不计R基上的氨基和羧基数)。所以对于一条多肽来说，至少应有的氨基和羧基数都是一个。(4)若有n个氨基酸分子缩合成m条肽链，则可形成(n-m)个肽键，脱去(n-m)个水分子，至少有—NH２和—COOH各m个。 (5)蛋白质分子可以含有一条或m条肽链，肽链通过化学键(不是肽键)互相连接，具有不同的空间结构。 (6)关于蛋白质分子量的计算：n个氨基酸形成m条肽链，每个氨基酸的平均分子量为a，那么由此形成的蛋白质的分子量为: n?a-(n-m)?18 (其中n-m为失去的水分子数，18为水的分子量) 总共 1页 1
蛋白质沉淀浓缩方法原理及详细解析 令狐采学 在生化制备中，沉淀主要用于浓缩目的，或用于除去留在液相或沉淀在固相中的非必要成分。在生化制备中常用的有以下几种沉淀方法和沉淀剂： 1．盐析法多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。 2．有机溶剂沉淀法多用于生物小分子、多糖及核酸产品的分离纯化，有时也用于蛋白质沉淀。 3．等电点沉淀法用于氨基酸、蛋白质及其它两性物质的沉淀。但此法单独应用较少，多与其它方法结合使用。 4．非离子多聚体沉淀法用于分离生物大分子。 5．生成盐复合物沉淀用于多种化合物，特别是小分子物质的沉淀。 6．热变性及酸碱变性沉淀法用于选择性的除去某些不耐热及在一定PH值下易变性的杂蛋白。 第一节盐析法 一般来说，所有固体溶质都可以在溶液中加入中性盐而沉淀析出，这一过程叫盐析。在生化制备中,许多物质都可以用盐析法进行沉淀分离，如蛋白质、多肽、多糖、核酸等，其中以蛋白质沉淀最为常见，特别是在粗提阶段。 盐析法分为两类，第一类叫Ks分段盐析法，在一定PH和温度下通过改变离子强度实现，用于早期的粗提液；第二种叫Kb分段盐析法，在一定离子强度下通过改变PH和温度来实现，用于后期进一步分离纯化和结晶。 一．影响盐析的若干因素 1．蛋白质浓度 高浓度蛋白溶液可以节约盐的用量，但许多蛋白质的b 和Ks常数十分接近，若蛋白浓度过高，会发生严重的共沉淀作用；在低浓度蛋白质溶液中盐析，所用的盐量较多，而共沉淀作用比较少，因此需要在两者之间进行适当选择。用于分步分离提纯时，宁可选择稀一些的蛋白质溶液，多加一点中性盐，使共沉淀作用减至最低限度。一般认为2.5%-3.0%的蛋白质浓度比较适中。