黄芪多糖对STZ糖尿病小鼠内皮祖细胞功能的作用_张根水

黄芪多糖对STZ糖尿病小鼠内皮祖细胞功能的作用*张根水，张贵平，罗柳金（广州医学院药理学教研室，广州510182）摘要目的：观察黄芪多糖对STZ诱导一型糖尿病小鼠骨髓内皮祖细胞（EPCs）功能的作用。

方法：糖尿病小鼠给予100 mg/kg与400mg/kg黄芪多糖腹腔注射4周，观察小鼠EPCs小管形成能力、粘附能力以及VEGF蛋白表达。

结果：黄芪多糖给药4周后，100mg/kg与400mg/kg两个剂量组EPCs小组形成与细胞粘附显著多于对照组（P＜0．05），明显降低STZ糖尿病小鼠血糖水平（P＜0．05），并能明显升高VEGF蛋白表达（P＜0．05）。

结论：黄芪多糖能改善糖尿病EPCs功能，可能有助于糖尿病伤口愈合的内皮修复。

关键词黄芪多糖；糖尿病；血管内皮生长因子；内皮祖细胞黄芪多糖（Astragalus polysaccharide，APS）为中药黄芪中重要有效成分之一，上世纪九十年代以来，人们发现黄芪多糖对实验糖尿病模型具有治疗作用，引起了人们的兴趣和重视。

更深入研究发现黄芪多糖具有广泛的药理作用，并有大量研究表明黄芪多糖在糖尿病治疗中具有重要意义［1］。

内皮祖细胞（Endothelial progenitor cells，EPCs）是血管内皮细胞的前体细胞，其主要功能为参与出生后缺血组织的血管发生和血管损伤后的修复，EPCs数量及功能与糖尿病伤口局部血管新生及伤口愈合关系密切［2］，本研究观察黄芪多糖对一型糖尿病小鼠EPCs功能的作用。

1材料与方法1．1试验药物黄芪多糖：西安鸿生生物技术有限公司产品，批号：100223；规格：1000g/袋；纯度＞95%。

1．2动物SPF级8周龄C57BL/6小鼠：南方医科大学实验动物中心，批文：SCXK（粤）2011-0015。

1．3试剂链脲霉素（Streptozotocin，STZ，Sigma）；Vitronectin（Sigma）；Matrigel（Sigma）；EGM-2培养基（Lonza）；Hoechst33258（Sigma）。

BCA蛋白含量测定试剂盒（PIERCE）。

兔抗小鼠血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）一抗（Abcom）。

1．4仪器CO2水套式培养箱（美国Thermo）；倒置式生物显微镜（日本Nikon TE300）；OneTouchUltra血糖仪（美国John-son）；垂直电泳仪（Bio-Rad）；Odyssey近红外双色激光成像系统（LI-COR）。

1．5方法C57BL/6小鼠腹腔注射链脲霉素60mg/kg连续5天，STZ注射前溶于pH4．50．05mol/L柠檬酸钠中。

注射STZ4周用血糖仪检测检测尾静脉血糖，每组8只，空白对照组C57BL/6小鼠不注射STZ，不组予药物。

糖尿病模型分成模型组、低剂量组、高剂量组。

模型组每天予生理盐水20ml/kg腹腔注射；低剂量组第5周至第8周每天给予黄芪多糖100mg/kg腹腔注射；高剂量组第5周至第8周每天给予黄芪多糖400mg/kg腹腔注射；连续给药4周至实验第8周后检测血糖，小鼠吸入过量CO2死亡后，无菌条件下分离其股骨、胫骨、髋骨及肱骨，并置于4ml冰冷的EGM-2培养基中。

在培养皿中去除肌肉组织，并切除两端骨骺，使用1ml注射器吸取EGM-2培养基将骨髓完全冲出，并收集至15ml离心管中，于400g4ħ离心20min收集骨髓细胞。

弃上清，用1ml红细胞裂解液裂解红细胞1min，再分别用PBS和EGM-2培养基洗涤细胞一次。

最后将细胞按照1ˑ106/cm3的密度接种在已包被Vitronectin的六孔板中，置于37ħ，5%CO2中培养。

1．5．1EPCs小管形成实验在预冷的48孔板中加入150μl的Matrigel，于37ħ孵育1h。

将待检测的EPCs用0．05%胰酶消化后，制成细胞悬液，以5ˑ104/孔的密度接种于Matrigel上，在37ħ，5%CO2孵箱中孵育15h后，于显微镜下照相。

当管型结构的长度大于等于宽度的四倍时，被认为是形成小管。

应用Image-Pro Plus软件计算形成小管的总长度。

1．5．2EPCs粘附功能实验EPCs细胞按照2．0ˑ104的密度接种在已包被Vitronectin的48孔板中，置于37ħ，5%CO2中培养1小时后，PBS洗去未粘附的细胞，粘附细胞用2%多聚甲醛固定，固定细胞用Hoechst33258染色细胞核，在ˑ100显微镜下取5个随机视野进行细胞计数。

1．5．3VEGF蛋白检测体外培养EPCs部分用于小管形成与粘附功能实验，其它细胞收集，提取总蛋白，BCA法蛋白定量，Western blot常规方法进行蛋白电泳、转膜、孵抗体；以-actin为内参蛋白，采用近红外荧光标记二抗，直接洗涤成像，Odyssey红外双色激光成像系统700通道检测，系统自带软件分析蛋白表达。

2结果2．1血糖糖尿病模型小鼠注射STZ后，第4周血糖明显升高，与空白对照组比较差异有显著性，实验第5周至实验第8周，连续给予100mg/kg、400mg/kg黄芪多糖均能明显降低血糖，明显低于STZ模型组，并与剂量相关。

模型组与黄芪多糖治疗组血糖明显高于正常组，见表1。

2．2EPCs小管形成实验STZ模型小鼠EPCs小管形成能力明显低于正常C57BL/6小鼠EPCs（P＜0．05）。

经黄芪多糖治疗4周1型糖尿病小鼠EPCs小管形成能力明显增强，与模型对照组比较差异有显著性（P＜0．05）（表2，图1）。

77中药药理与临床2012；28（6）*基金项目：广州医学院博士启动基金项目（No：2009－17）表1黄芪多糖对1型糖尿病模型小鼠血糖的影响（珋x ʃs ，mmol /L ）组别鼠数（只）剂量（mg /kg ）0周4周8周对照组86．6ʃ0．46．7ʃ0．6##6．7ʃ0．4##模型组86．7ʃ0．221．6ʃ3．622．8ʃ3．5黄芪多糖81006．4ʃ0．422．6ʃ3．118．0ʃ2．8#黄芪多糖84006．6ʃ0．621．8ʃ3．512．8ʃ1．8#与模型组比较#P ＜0．05，##P ＜0．01（下同）表2黄芪多糖对1型糖尿病模型小鼠EPCs 小管形成能力的影响（珋x ʃs ）组别鼠数（只）剂量（mg /kg ）小管形成数（对照组倍数）对照组81．00ʃ0．18##模型组80．58ʃ0．14黄芪多糖81000．79ʃ0．20#黄芪多糖84000．92ʃ0．30#图1黄芪多糖对1型糖尿病模型小鼠EPCs 小管形成能力影响代表性结果（放大倍数：ˑ100）2．3EPCs 粘附功能实验STZ 模型糖尿病小鼠EPCs 培养过程，粘附细胞数明显降低，与正常C 57BL /6小鼠EPCs 差异有显著性（P ＜0．05）。

100mg /kg 、400mg /kg 黄芪多糖连续治疗4周，EPCs 粘附功能实验中粘附于包被vitronectin 培养板细胞数明显增加，显著高于STZ 模型组（P ＜0．05）（表3，图2）。

表3黄芪多糖对1型糖尿病模型小鼠EPCs 粘附功能的影响（珋x ʃs ）组别鼠数（只）剂量（mg /kg ）视野细胞数（个）对照组846．0ʃ19．0##模型组817．3ʃ4．8黄芪多糖810029．3ʃ10．9#黄芪多糖840037．5ʃ18．8#图2黄芪多糖对1型糖尿病模型小鼠EPCs 粘附功能的影响代表性结果（Hoechst 33258染色，放大倍数：ˑ100）2．4VEGF 蛋白表达STZ 模型糖尿病小鼠骨髓来源EPCs VEGF 蛋白表达明显低于正常C57BL /6小鼠EPCs （P ＜0．05）。

经黄芪多糖治疗4周后，骨髓来源EPCs 体外培养后VEGF 蛋白表达明显高于STZ 模型组，见表4，图3。

表4黄芪多糖对1型糖尿病模型小鼠EPCs VEGF 蛋白表达的影响（珋x ʃs ）组别剂量（mg /kg ）鼠数（只）VEGF 表达（β-actin 倍数）对照组80．00893ʃ0．00380##模型组80．00190ʃ0．00080黄芪多糖10080．00414ʃ0．00081#黄芪多糖40080．00782ʃ0．00185#图3黄芪多糖对1型糖尿病模型小鼠EPCs VEGF 蛋白表达的影响。

3讨论外周血流减少与局部血管新生障碍是糖尿病病人伤口愈合延迟或不愈合的关键因素［3］。

大量的临床及基础研究已经证实了糖尿病病人外周血管新生功能严重受损［4，5］。

因此，恢复与促进血管新生功能对改善糖尿病伤口愈合具有重要的临床意义。

骨髓来源的内皮祖细胞在生理或病理因素刺激下，可从骨髓动员到外周血并趋化至伤口部位，是伤口血管新生关键因素之一。

已有大量研究表明EPCs 数量及功能与糖尿病伤口局部血管新生及伤口愈合关系密切，而EPCs 数量减少及功能降低是糖尿病伤口延迟愈合的重要机制［5］。

因此改善EPCs 功能和促进糖尿病血管新生为是提高糖尿病伤口愈合效果的重要策略。

实验中发现黄芪多糖能明显增强STZ 糖尿病小鼠EPCs 小管形成能力，这将有助于EPCs 参加糖尿病伤口愈合中血管新生的新内皮形成。

黄芪多糖增强EPCs 粘附功能改善糖尿病EPCs 归巢于伤合损伤位置而参与血管新生与伤口愈合。

糖尿病EPCs 功能下降的原因很多，高血糖与氧化应激是已知87中药药理与临床2012；28（6）最为重要两个原因［6］。

黄芪多糖降低STZ 整体血糖水平有助于改善EPCs 功能。

已有大量文献报道黄芪多糖抗氧化、抑制炎症反应等作用［7］，这些作用也可能是改善EPCs 功能机制之一。

VEGF 具有促进EPCs 在骨髓内募集并向外周血迁移，促进骨髓EPCs 动员、并归巢至损伤部位参与组织血管修复［8］。

STZ 糖尿病小鼠EPCs VEGF 表达下降，提示其不仅有EPCs 功能下降，而且有动员障碍。

而黄芪多糖的作用进一步提示其可能对EPCs 参与糖尿病伤口有促进作用。

参考文献1Zhou X ，Xu Y ，Yang G ，et al．Increased galectin-1expression in mus-cle of Astragalus polysaccharide-treated Type 1diabetic mice．J Nat Med ，2011；65（3）ʒ500 5072Marrotte EJ ，Chen DD ，Hakim JS ，et al．Manganese superoxide dis-mutase expression in endothelial progenitor cells accelerates wound healing in diabetic mice．J Clin Invest ，2010；120（12）ʒ4207 42193Barcelos LS ，Duplaa C ，Krflnkel N ，et al．Human CD133+progenitorcells promote the healing of diabetic ischemic ulcers by paracrine stimulation of angiogenesis and activation of Wnt signaling．Circ Res ，2009；104（9）ʒ1095 11024Bauer SM ，Bauer RJ ，Velazquez OC．Angiogenesis ，vasculogenesis ，and induction of healing in chronic wounds．Vasc Endovascular Surg ，2005；39ʒ293 3065Fadini GP ，Miorin M ，Facco M ，et al．Circulating endothelial progenitorcells are reduced in peripheral vascular complications of type 2diabetes melli-tus．J Am Coll Cardiol ，2005；45（9）ʒ1449 14576Kim KA ，Shin YJ ，Kim JH ，et al．Dysfunction of endothelial progenitorcells under diabetic conditions and its underlying mechanisms．Arch Pharm Res ，2012；35（2）ʒ223 2347Li XT ，Zhang YK ，Kuang HX ，et al．Mitochondrial Protection and Anti-aging Activity of Astragalus Polysaccharides and Their Potential Mechanism．Int J Mol Sci ，2012；13（2）ʒ1747 17618Kang L ，Chen Q ，Wang L ，et al．Decreased mobilization of endothelialprogenitor cells contributes to impaired neovascularization in diabetes．Clin Exp Pharmacol Physiol ，2009；36（10）ʒe47 56Effects of astragalus polysaccharide on function of EPCs in STZ-induced diabetic mice．Zhang Genshui ，Zhang Guiping ，Luo Liujin（Partment of Pharmacology ，Guangzhou Medical College ，Guangzhou 510182）AIM ：To study the effects of astragalus polysaccharide （APS ）on function of endothelial progenitor cells （EPCs ）in streptozotocin in-duced type I diabetic mice．Methods ：The effects of APS with 100and 400mg /kg intraperitoneal injection were investigated by determination tube formation ，adhesion of EPCs and VEGF protein expression．Results ：Long-term administration with 100and 400mg /kg APS significantly increased the tube formation ，adhesion function and VEGF protein expression of EPCs compare to the control group besides the decreasing effects on blood glucose of STZ-induced diabetic mice （P ＜0．05）．Conclusion ：These results suggest that chronic treatment with APS ex-perts an ameliorate effect on EPCs function in STZ-induced diabetic mice．The effects of APS suggest the application of APS in the wound healing of diabetes．Key wordsAstragalus polysaccharide （黄芪多糖）；diabetes ；vascular endothelial growth factor ；endothelial progenitor cells黄精多糖干预长春新碱诱导的骨髓基质细胞生长抑制及凋亡胡微煦1，文珠2*，戎吉平2，俞火2，胡国柱3（1复旦大学附属肿瘤医院，上海200032；2江西省医学科学研究所，南昌330006；3江西省人民医院临床医学研究所，南昌330006）摘要目的：探讨黄精多糖（PSP ，polygonatum sibiricum polysaccharides ）干预长春新碱（VCR ）诱导的小鼠骨髓基质细胞（BMSCs ）生长抑制及凋亡的作用。