复配食品添加剂检验方法(沙门氏菌)
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复配食品添加剂沙门氏菌检验方法
㈠沙门氏菌指标要求：不得检出。
㈡检测依据：《食品安全国家标准食品微生物检验沙门氏菌检验GB4789.4-2010》
㈢化验设备工具仪器用品：
①冰箱。
②恒温培养箱。
③电子天平。
④均质器。
⑤取样纸。
⑥取样匙。
⑦1-5mL微量移液器。
⑧3mm×50mm无菌试管。
⑨10mm×75mm无菌试管。
⑩500mL无菌锥形瓶。
⑾250mL无菌锥形瓶。
⑿直径90mm无菌培养皿。
⒀超净工作台。
⒁酒精灯。
⒂可调式万用电炉。
⒃水浴锅。
⒄接种环。
⒅接种针。
⒆无菌生理盐水。
⒇安培瓶架。
㈣化验试剂及配制(预处理)：
①沙门氏菌生化鉴定试剂盒。
②缓冲蛋白胨水（BPW）。
③四硫磺酸钠煌绿(TTB)增菌液。
④亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液。
⑤亚硫酸铋(BS)琼脂(使用时，用水浴锅加热溶化，倒入无菌培养皿，贴上配制标签，彻底降温后即成BS琼脂培养基平板)。
⑥木糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD)琼脂(使用时，用水浴锅加热溶化，倒入无菌培养皿，贴上配制标签，彻底降温后即成XLD 琼脂培养基平板)。
⑦三糖铁(TSI)琼脂培养基(试管)。
⑧赖氨酸脱羧酶试验培养基。
⑨营养琼脂(使用时，加20倍蒸馏水用可调式万用电炉加热溶化，倒入无菌培养皿，贴上配制标签，彻底降温后即成营养琼脂培养基平板)。
⑩蒸馏水。
⑾生理盐水。
㈤试样处理：无
㈥检测流程
①检测工艺：样品抽样→前增菌→第二次增菌→首次接种琼脂(四个)平板→鉴别可疑菌落→初步生化试验接种→判定非沙门氏菌或可疑沙门氏菌→进一步使用生化试剂盒判定是否为沙门氏菌→检验结论
②检测方法步骤：
★先用250mL无菌锥形瓶量取225mL缓冲蛋白胨水（BPW）倒入无菌均质杯中。
再用电子天平称量取样纸，用取样匙取样品放在电子天平托盘上称量25g，然后加入均质杯中，打开均质器电源，设定均质转速：8000r/min -10000r/min，均质时间：1min-2min。
★将均质好的液体在超净工作台内倒入500mL无菌锥形瓶中，盖好盖后放入恒温培养箱，设定温度36℃±1，培养8h~18h。
★用1-5mL微量移液器吸取10mL四硫磺酸钠煌绿(TTB)增菌液加入无菌试管内。
将培养好的样品混合物从恒温培养箱中取出，用1-5mL微量移液器吸取1mL样品混合物注入四硫磺酸钠煌绿(TTB)增菌液无菌试管内，盖好盖，放入恒温培养箱，设定温度42℃±1，培养18h-24h。
★另用1-5mL微量移液器吸取10mL亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液加入无菌试管内。
用1-5mL 微量移液器吸取1mL样品混合物注入亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液无菌试管内，盖好盖，放入恒温培养箱，设定温度36℃±1，培养18h-24h。
★在超净工作台内，左手持木糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD)琼脂培养基皿(平板)用拇指、食指和中指将皿盖揭开约20-30度左右,角度越小遭空气污染的可能性越小,并靠近酒精灯附近操作。
右手持接种环，先用酒精灯灭菌，将接种环置火焰上灭菌，待冷（可接触平板试之，如不融化琼脂，即已冷却），然后，取培养好的四硫磺酸钠煌绿(TTB)样品增菌液1环，将沾菌接种环在BS培养基的边缘划原始线（划线时接种环与培养基表面呈45度角），而后使接种环在指力作用下作轻快的滑移动作，从培养皿的一个边缘滑向另一个边缘，滑动时用力要均匀，切勿将接种环嵌入培养基内划破琼脂。
划完后将接种环在酒精灯火燃烧灭菌，放于原处，然后，将接种好的培养皿盖好平皿盖，倒置（平板底部向上）放入恒温培养箱，设定温度36℃±1，培养18h-24h。
取出后观察平皿(平板)生长
的菌落，如果菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心，或呈现全部黑色的菌落；有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心。
可判定为可疑沙门氏菌菌落。
★在超净工作台内，左手持木糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD)琼脂培养基皿(平板)用拇指、食指和中指将皿盖揭开约20-30度左右,角度越小遭空气污染的可能性越小,并靠近酒精灯附近操作。
右手持接种环，先用酒精灯灭菌，将接种环置火焰上灭菌，待冷（可接触平板试之，如不融化琼脂，即已冷却），然后，取培养好的亚硒酸盐胱氨酸(SC)样品增菌液1环，将沾菌接种环在BS培养基的边缘划原始线（划线时接种环与培养基表面呈45度角），而后使接种环在指力作用下作轻快的滑移动作，从培养皿的一个边缘滑向另一个边缘，滑动时用力要均匀，切勿将接种环嵌入培养基内划破琼脂。
划完后将接种环在酒精灯火燃烧灭菌，放于原处，然后，将接种好的培养皿盖好平皿盖，倒置（平板底部向上）放入恒温培养箱，设定温度36℃±1，培养18h-24h。
取出后观察平皿(平板)生长的菌落，如果菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心，或呈现全部黑色的菌落；有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心。
可判定为可疑沙门氏菌菌落。
★在超净工作台内，左手持培亚硫酸铋(BS)琼脂养基皿(平板)用拇指、食指和中指将皿盖揭开约20-30度左右,角度越小遭空气污染的可能性越小,并靠近酒精灯附近操作。
右手持接种环，先用酒精灯灭菌，将接种环置火焰上灭菌，待冷（可接触平板试之，如不融化琼脂，即已冷却），然后，取培养好的四硫磺酸钠煌绿(TTB)样品增菌液1环，将沾菌接种环在BS培养基的边缘划原始线（划线时接种环与培养基表面呈45度角），而后使接种环在指力作用下作轻快的滑移动作，从培养皿的一个边缘滑向另一个边缘，滑动时用力要均匀，切勿将接种环嵌入培养基内划破琼脂。
划完后将接种环在酒精灯火燃烧灭菌，放于原处，然后，将接种好的培养皿盖好平皿盖，倒置（平板底部向上）放入恒温培养箱，设定温度36℃±1，培养40h-48h。
取出后观察平皿(平板)生长的菌落，如果菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰绿色的菌落，周围培养基不变。
可判定为可疑沙门氏菌菌落。
★在超净工作台内，左手持亚硫酸铋(BS)琼脂培养基皿(平板)用拇指、食指和中指将皿盖揭开约20-30度左右,角度越小遭空气污染的可能性越小,并靠近酒精灯附近操作。
右手持接种环，先用酒精灯灭菌，将接种环置火焰上灭菌，待冷（可接触平板试之，如不融化琼脂，即已冷却），然后，取培养好的亚硒酸盐胱氨酸(SC)样品增菌液1环，将沾菌接种环在BS培养基的边缘划原始线（划线时接种环与培养基表面呈45度角），而后使接种环在指力作用下作轻快的滑移动作，从培养皿的一个边缘滑向另一个边缘，滑动时用力要均匀，切勿将接种环嵌入培养基内划破琼脂。
划完后将接种环在酒精灯火燃烧灭菌，放于原处，然后，将接种好的培养皿盖好平皿盖，倒置（平板底部向上）放入恒温培养箱，设定温度36℃±1，培养40h-48h。
取出后观察平皿(平板)生长的菌落，如果菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰绿色的菌落，周围培养基不变。
可判定为可疑沙门氏菌菌落。
★在超净工作台内，将接种针置于酒精灯火焰上灭菌，待冷，在持木糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD)琼脂培养基皿(平板) 或亚硫酸铋(BS)琼脂培养基皿(平板)内选择2个以上典型或可疑菌落，接种到三糖铁(TSI)琼脂试管内,先在斜面划线，再于底层穿刺(请勿穿到底部，否则会影响到底层培养基颜色变化的观察)；接种针不要灭菌，直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，然后放入恒温培养箱，设定温度36℃±1，培养18h-24h，必要时可延长48小时。
取出后观察反应结果，根据(见表1)可以判定“非沙门氏菌”或仍存在“可疑沙门氏菌”。
表1.沙门氏菌在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果
成浊度适当的菌悬液，使用沙门氏菌生化鉴定试剂盒进一步鉴定是否为沙门氏菌。
③注意事项
化验工作人员应做好充分的劳保措施，包括：隔离衣、鞋套、手套、帽子、防护镜、口罩等。
备有充足的水源，完善的排水措施。
化验前打开化验室内及超净工作台紫外线杀菌灯进行灭菌30分钟。
㈦检测结果打印
㈧收尾工作
①将未用完的试剂溶液放到指定位置。
②将废液倒入废液专用桶按规定处理。
③用完的玻璃仪器清洗干净，放入10%硝酸溶液浸泡一夜，再用玻璃棒挑出，用纯净水冲
洗干净，晾干后备用。
④关掉电脑和打印机。
关掉所有电源。
