糖化酶的固定化试验

糖化酶的固定化试验

一、目的要求

本实验为酶工程综合实验，由学生自行设计实验方案，培养学生独立实验的能力；并掌握酶活测定方法，米氏常数测定，学习固定化酶的常用方法及固定化酶的表征。

二、基本原理

糖化酶是一种用途广泛的酶，粮食工业、食品工业、发酵工业都经常使用。随着生物技术的迅速发展,糖化酶的生产和使用水平也有了进一步的提高。

固定化技术是近年来迅速发展的一种崭新技术，固定化酶同游离酶相比有很多优点,它开辟了酶的许多新用途。游离酶可通过各种固定化方法，增加其稳定性并且有利于连续化生产和重复使用。酶固定化后可用各种理化性质的变化来表征其效果。

酶的固定化方法：通常的固定化方法可以概括为四种：a、吸附法 b、共价偶联法 c、交联法 d、包埋法 4、包埋法

包埋法是借助于聚合促进剂的作用进行聚合，将酶包埋于聚合物中以达到固定化目的的一种方法。反应条件温和，很少改变酶的结构，此方法对大多数酶制剂甚至完整的微生物细胞都是适用的，其局限性是 ①、对底物和产物是大分子的采用此种方法固定化酶是不适用的 ②、高聚物网络或半透性膜对小分子物质扩散的阻力导致固定化酶的动力学行为偏离游离酶的动力学行为，活力减低。 凝胶包埋是将酶包埋在交联的水不溶性凝胶的空隙中的方法，把酶固定于聚合材料的格子结构中，这样可以防止酶蛋白游离释放，但底物仍能渗入格子内与酶接触，进行酶催化反应。

糖化酶活力的测定采用次碘酸钠法。糖化酶能从淀粉分子非还原性末端开始，分解α-1, 4葡萄糖苷键生成葡萄糖。葡萄糖分子中含有醛基，能被次碘酸钠氧化，过量的次碘酸钠酸化后析出碘，再用硫代硫酸钠标准溶液滴定，由此可计算酶活力。次碘酸钠法的原理为在碱性介质（NaOH）中，碘歧化为次碘酸钠和碘化钠，次碘酸钠氧化溶液中游离的醛基为酸基。适当酸化，剩余的次碘酸钠与碘酸钠又生成碘，以淀粉为指示剂，用硫代硫酸钠标准溶液滴定。根据总碘量和硫代硫酸钠的用量，可对应获得甲醛的量。反应为：

I2+2OH-=OI-+I-+H2O

HCHO+OI-+OH-=HCOO-+I-+H2O

OI-+I-+2H+= I2+H2O I2+2S2O32-=S4O62-+2I-

米氏常数Km为当酶促反应速度是最大反应速度一半时的底物浓度。将米氏方程 ，两边取倒数得公式： ，此式即为Lineweaver-Burk方程，这一线性方程，用 对 作图即得一条直线，直线的斜率为Km/Vmax，1/v的截距为1/Vmax。当1/v=0时，1/〔S〕的截距为-1/Km。即根据直线在横轴上的截距(-1/Km)可求出米氏常数Km。

三、仪器设备与试剂

仪器设备：实验用乳化机WL500CY、注射用筒50mL 6 号针头、微量滴定管、试剂瓶、电子天平、试管、玻璃棒、容量瓶、纱布、比色管、恒温水浴锅玻璃仪器、

试剂：（1）乙酸－乙酸钠缓冲溶液（pH 为4.6）。

称取乙酸钠（CH3COONa·3H2O）6.7g，溶于水中，加冰乙酸（CH3COOH）

2.6ml，用水定容至1000ml。配好后用pH 计校正。

（2）硫代硫酸钠标准溶液（Na2S2O3，0.05mol/L）。

（3）碘溶液（1/2I2，0.1mol/L）。

（4）氢氧化钠溶液（NaOH，0.1mol/L）。

（5）200g/L 可溶性氢氧化钠溶液。

（6）硫酸溶液（2mol/L）。

（7）20g/L 可溶性淀粉溶液。

（8）10g/L 淀粉指示液。

（9）糖化酶试剂

四、实验内容

1、糖化酶的酶活测定

2、糖化酶的米氏常数测定

3、根据所学知识设计糖化酶的固定化方法（重点为包埋法）

4、设计试验对固定化后的糖化酶进行表征。(固定化酶的活力,活力回收测定,固定化

酶的半衰期,固定化酶的Km 测定)

五、实验步骤

1、 酶活测定

酶活定义：1g固体酶粉（或1ml液体酶），于40℃、pH值为4.6的条件下，1h分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖，即为1个酶活力单位，以u/g（u/ml）表示。

原理：糖化酶有催化淀粉水解的作用，能从淀粉分子非还原性末端开始，分解α-1,4-葡萄糖苷键生成葡萄糖。葡萄糖分子中含有醛基，能被次碘酸钠氧化，过量的次碘酸钠酸化后析出碘，再用硫代硫酸钠标准溶液滴定，计算酶活力。

糖化酶固定化机理：海藻酸钠是糖醛酸的钠盐聚合物在酸性条件下可形成凝胶,明胶是一种多肽聚合物,在一定pH条件下,带正电荷的明胶与海藻酸根阴离子形成聚合物,同时海藻酸钠与钙离子在一定条件下结合形成不溶于水的微球从水中分离出来。戊二醛含有二个醛基,可与蛋白质中的氨基、酚基、巯基发生Schiff反应,相互交联而使固定化酶硬化,由于正电荷的明胶与海藻酸根阴离子形成聚合物已将绝大部分游离酶包埋起来,因此这种交联主要发生在明胶与戊二醛之间,实验也证明这种交联对酶活力的损失并不大,但却能达到使固定化酶的使用时间延长、机械强度增大、稳定性提高的效果

（1）待测酶液的制备称取酶粉1～2g，精确至0.0002g（或吸取液体酶1.00ml），先用少量的乙酸缓冲液溶解，并用玻璃棒捣研，将上清液小心倾入容量瓶中。沉渣部分再加入少量缓冲液，如此捣研3～4 次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度（估计酶活力在100～250u/ml

范围内），摇匀。通过4 层纱布过滤，滤液供测定用。

（2）测定于甲、乙两支50ml 比色管中，分别加入可溶性淀粉25ml 及缓冲液5ml，摇匀后，40℃恒温水浴中预热5min。在甲管（样品）中加入待测酶液2ml，立刻摇匀，在此温度下准确反应30min，立刻各加入氢氧化钠溶液0.2ml，摇匀，将两管取出迅速冷却，并于乙管（空白）中补加待测酶液2ml，吸取上述反应液与空白液5ml，分别置于碘量瓶中，准确加入碘溶液10ml，再加氢氧化钠溶液15ml，摇匀，密塞，于暗处反应15min。取出，加硫酸溶液2ml，立即用硫代硫酸钠标准溶液滴定，直至蓝色刚好消失为其终点。

（3）计算

X＝（A－B）c×90.05×32.2/5×1/2×n×2＝579.9×（A－B）c×n

式中X——样品的酶活力（u/g 或u/ml）

A——空白消耗硫代硫酸钠溶液的体积（ml）

B——样品消耗硫代硫酸钠溶液的体积（ml）

c——硫代硫酸钠溶液的浓度（mol/L）

90.05——与1ml 硫代硫酸钠标准溶液（1mol/L）相当的以克表示的葡 萄糖的质量

32.2——反应液的总体积（ml）

5——吸取反应液的体积（ml）

1/2——吸取酶液2ml，换算为1ml

n——稀释倍数

2——反应30min，换算成1h 的酶活力系数所得的结果表示至整数

2、米氏常数测定

配制2%浓度的可溶性淀粉溶液，用5 支试管分别加入2,4,6,8,10mL，不足的补

加蒸馏水至10mL。分别加入相同的酶液，测酶活。

3、固定化方法

将酶液15mL 与3%的海藻酸钠溶液150mL 混合搅拌，然后加入3%的明胶溶

液150mL 混合乳化约10min，调pH4，慢速搅拌并降温至5~10 度，通过6 号

注射器的针头将上述冷却液以5cm 的高度注进1%氯化钙溶液中，立刻形成光

滑的微球，然后保持温度为4 度，硬化30min。

六、实验结果记录

游离酶的酶活力测定

表1：游离酶活力测定记录表

空白 1 2

2%可溶性淀粉/mL 10 10 10

pH4.6醋酸缓冲液/mL 5 5 5

操作 40℃预热10min

酶液/mL 1（灭活酶） 1 1

操作 40℃反应10min，立即转入100℃灭活

上述反应液/mL 5 5 5

0.1mol/L碘液/mL 5 5 5

0.1mol/L NaOH/mL 5 5 5

操作 摇匀，暗处放置15min

2mol/L H2SO4/mL 2 2 2

0.5%淀粉指示剂/滴 3 3 3

0.025mol/L Na2S2O3滴定至终点消耗体积/mL

游离酶米氏常数的测定

表2：游离酶米氏常数测定记录

空白组试剂添加除“酶液”采用的是灭活酶外，其他的操作与上述表格一致，得到记录表如下：

表3：游离酶米氏常数空白组测定记录表

1 2 3 4 5

1%可溶性淀粉/mL 2 4 6 8 10

蒸馏水/mL 8 6 4 2 0

pH4.6醋酸缓冲液/mL 5 5 5 5 5

酶液/mL 1 1 1 1 1

操作 40℃反应10min后，100℃灭活

上述反应液/mL 5 5 5 5 5

0.1mol/L碘液/mL 5 5 5 5 5

0.1mol/L NaOH/mL 5 5 5 5 5

操作 摇匀，暗处放置15min

2mol/L H2SO4/mL 2 2 2 2 2

0.5%淀粉指示剂/滴 3 3 3 3 3

0.025mol/L Na2S2O3滴定至终点消耗体积/mL

1 2 3 4 5

0.025mol/L 滴定至终点消耗体积/mL