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糖化酶的固定化及其在葡萄糖 生产中的应用工艺

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广 州 大 学

实 验 报 告

实验名称：糖化酶的固定化及其在葡萄糖

生产中的应用工艺

学 院：生命科学学院

专业年级：

学 号：

姓 名：

组 员：

指导老师：王小兰、柯德森

摘要：利用有关固定化酶的理论和方法，研究固定化糖化酶的效率与固定时间的关系。本实验中测定固定化糖化酶偶联率、相对活力、活力回收来衡量其生产工艺的优劣，并探讨糖化酶的浓度对固定化效果及结合牢固程度的影响和验证固定化糖化酶催化生产葡萄糖的重复使用能力及其效率。制备固定化糖化酶的方法为离子吸附法，并且使用DNS法测定固定化酶的活力。结果显示：在该次实验中，固定化60min时，固定化糖化酶的效率最好；固定化10min时，固定化酶的活力回收为3.47％，偶联率为48.10％，相对活力为7.23％；固定化20min时，固定化酶的活力回收为4.74％，偶联率为54.76％，相对活力为8.66％；固定化30min时，固定化酶的活力回收为4.71％，偶联率为53.42％，相对活力为8.82％；固定化40min时，固定化酶的活力回收为3.84％，偶联率为58.13％，相对活力为6.62％；固定化50min时，固定化酶的活力回收为4.04％，偶联率为60.59％，相对活力为6.67％；

固定化60min时，固定化酶的活力回收为6.34％，偶联率为70.00％，相对活力为9.06％。重复使用葡萄糖固定化酶的过程中，固定化酶的利用效率降低。酶与载体的浓度比例较高固定化酶葡萄糖生产效率高。

关键词：固定化酶 效率 时间 酶活力

1、前言：

糖化酶，又称葡萄糖淀粉酶，糖化酶的底物专一性较低，它除了能从淀粉链的非还原性未端切开a-1.4键处，也能缓慢切开a-1.6。因此，它能很快的把直链淀粉从非还原性未端依次切下葡萄单位，在遇到1.6键分割，先将a-1.6键分割，再将a-1.4键分割，从而使支链淀粉水解成葡萄糖。糖化酶用于以葡萄糖作发酵培养基的各种抗生素、有机酸、氨基酸、维生素的发酵；本品还大量用于生产各种规格的葡萄糖。总之，凡对淀粉、糊精必需进行酶水解的工业上，都可适用。

酶固定化后一般稳定性增加，易从反应系统中分离，且易于控制，能反复多次使用。便于运输和贮存，有利于自动化生产，但是活性降低，使用范围减小，技术还有发展空间。固定化酶是近十余年发展起来的酶应用技术，在工业生产、化学分析和医药等方面有诱人的应用前景。

酶的固定化方法通常按照用于结合的化学反应的类型进行分类，大致有三种：非共价结合法、化学结合法、包埋法。本实验利用离子结合法制备固定化糖化酶。离子结合法就是酶通过离子键结合于具有离子交换基的不溶性载体的固定化方法，常用的载体有：DEAE-纤维素，DEAE-葡萄糖凝胶,CM-纤维素等。本实验采用:GF-201大孔强碱阴离子交换树脂，应用离子交换结合法制备固定化酶，该法操作简单，条件温和，酶活性中心和高级结构不易受到破坏，酶活回收率比较高。其缺点是：结合力弱，容易脱落，受溶液离子强度和pH影响较大。使用共价结合法不会使酶容易脱落，国外研究者已研究出用氧化锆涂层多孔玻璃或多孔陶瓷，然后硅烷化，最后用重氮基、醛基和异硫氰基衍生物偶联糖化酶，结果使酶活较高，并且能连续生产3个酶半衰期。在此次实验中还使用用DNS法测定固定化酶、残留酶、原酶的活力。

2、材料与方法：

2.1材料

（1）糖化酶液，GF-201大孔强碱阴离子交换剂，葡萄糖，可溶性淀粉(20g/L)，CuSO4.5H2O，次甲基兰，酒石酸钾钠，氢氧化钠，亚铁氰化钾，乙酸，乙酸钠(配制pH4.6缓冲液)，无水乙醇，盐酸。硫代硫酸钠（0.05M），碘溶液（次碘酸钠，0.1M）。硫酸2M。

（2）酶液、固定化酶及固定化后的残留酶液。

2.2实验仪器

恒温水浴锅（可达99℃，5个），酸度计（3个），容量瓶，量筒，烧杯，移液管，比色管，漏斗，玻璃棒，锥形瓶，试管架，吸耳球，pH试纸，滤纸，离心机，离心管，分光光度计等。

2.3试剂

（1）标准葡萄糖溶液（1mg/mL）：精确称取100mg葡萄糖，用蒸馏水溶解并定容至100mL。

（2）3,5-二硝基水杨酸试剂：精确称取3,5-二硝基水杨酸1g，溶于20mL 2mol/L NaOH溶液中，加入50mL蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水定容至100mL。盖紧瓶塞，勿使CO2进入。若溶液混浊可过滤后使用。

（3）0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液

A液：（0.1mol/L 柠檬酸）：称取C6H8O7·H2O 21.01g，用蒸馏水溶解并定容至1L。

B液：（0.1mol/L柠檬酸钠）：称取Na3C6H5O7·2H2O 29.41g，用蒸馏水溶解并定容至1L。

取A液55mL与B液145mL混匀，既为0.1mol/LpH5.6的柠檬酸缓冲液。

（4）1%淀粉溶液：称取1g淀粉溶于100mL 0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液中。

2.4操作步骤

2.4.1试剂的配制

（1）糖化酶液：市售商品化糖化酶,去离子pH7的磷酸缓冲液配制，根据标称的活力单位配制为1万单位/ml的溶液，离心去除不溶性杂质，共配4000ml, 4℃备用。 （2）2mol/L氢氧化钠：8gNaOH-----100ml，共配3000ml。

（3）2mol/LHCL:17ml浓盐酸------100ml，共配3000ml。

2.4.2固定化酶实验步骤

（1）载体的预处理

A：乙醇处理：15克湿离子交换剂---50ml烧杯加入30ml去离子水，搅拌，倒去水。注入2倍体积无水乙醇，乙醇浸泡过夜（12h），然后用去离子水连续冲洗以除去乙醇。

B：碱处理：2倍体积（50ml）的2mol/lNaOH浸泡并充分搅拌，再以去离子水冲至pH6.0-7.0

C：酸处理:用2倍体积的2mol/L HCl溶液处理阴离子交换树脂，然后用去离子水洗至pH6.0。

D：重复B

（2）酶的固定化

取4份糖化酶液，每份30ml，分别倒入4个贮液槽中，并各加入预处理的离子交换剂15g，不断轻轻搅拌，开始进行酶的固定化。分别在10min、20min、30min、60min后过滤去未固定的酶液，测量每份固定化酶及反应后残留酶液活性。保存固定化后的酶于冰箱以备下一实验。

2.4.3葡萄糖标准曲线的制作

取7支干净的具塞刻度试管（可用封口胶代替），编号，按表1加入试剂：

表1 葡萄糖标准曲线制作

试 剂 管 号

1 2 3 4 5 6 7

葡萄糖标准液（mL） 0 0.2 0.6 1.0 1.4 1.8 2.0

蒸馏水（mL） 2.0 1.8 1.4 1.0 0.6 0.2 0

葡萄糖含量（mg） 0 0.2 0.6 1.0 1.4 1.8 2.0

3,5-二硝基水杨酸（mL） 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0

2.0

摇匀，置沸水浴中煮沸5min。取出后流水冷却，加蒸馏水定容至20mL。以1号管作为空白调零点，在540nm波长下比色测定光密度。以葡萄糖含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。

（2）酶活力的测定：取6支干净的试管，编号，按表3-2进行操作。

表3-2 酶活力测定取样表 操作项目 淀粉酶活力测定 固定化酶活力测定

1%淀粉溶液/ml 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

预保温 将各试管和淀粉酶溶液置于40℃恒温水溶液中保温10min

淀粉酶原液/ml 0.1 0.1 0.1 0.2g 0.2g 0.2g

保温 （空白管的酶预先煮沸失活）

在40℃恒温水溶液中准确保温5min

取反应液0.1ml，加入去1.9ml水，迅速加入以下DNS

3,5-二硝基水杨酸/ml 2.0 2.0 2.0 0 2.0

2.0

将各试管摇匀，显色后进行比色测定光密度，记录测定结果，操作同标准曲线（煮沸，定容）。，

2.4.5 装柱模拟葡萄糖的生产

将上周保存于冰箱的固定化酶全部装柱，加足够量的淀粉溶液进行洗脱操作，每隔5min取样一次，共取16次。同样处理后在540nm波长下比色测定每个样品的光密度。

（3）实验结果处理

① 在标准曲线上查出相应的葡萄糖含量（mg）,按下列公式计算酶活力。

② 酶活力单位（U）=1μmol葡萄糖产生量/min

③ 计算每毫升酶液及每克固定化酶的活力，计算残留酶活力，从而计算酶偶联率

及相对活力，评价固定化的效果。

3．实验结果及数据分析

3.1葡萄糖标准曲线

表3 葡萄糖标准曲线制作（葡萄糖含量/mg）

试管号 1 2 3 4 5 6 7

葡萄糖含量/mg 0 0.2 0.6 1.0 1.4 1.8 2.0

A540 0 0.037 0.171 0.315 0.454 0.601 0.655

表4 原酶吸光值

原酶 1 2

A540 0.244 0.272

A540平均值 0.258

酶活力单位 0.8199

总活力单位 819.9

表5 固定化酶与残留酶吸光值

固定化时间（min） A540 含量

残留酶 平均值 固定化酶 平均值 残留液体积（mL） 固定化酶含量（g）

10 0.289 0.297 0.293 0.151 0.140 0.1455 45 17.1

20 0.298 0.342 0.32 0.243 0.259 0.251 47 15.6

30 0.269 0.253 0.261 0.239 0.227 0.233 46 16.1

40 0.239 0.271 0.255 0.248 0.258 0.253 48 14

50 0.237 0.219 0.228 0.286 0.248 0.267 43 14

60 0.183 0.189 0.186 0.292 0.286 0.289 48 16.9

y = 0.3387x -0.0197R2= 0.99800.10.20.30.40.50.60.700.511.52A540nm葡萄糖含量/mg图1 葡萄糖标准曲线

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酶的应用

酶的应用

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酶的应用

绪论

酶”对于大多数人来说，还是比较陌生的，还不知酶为何物，要么不知所云，要么误认为“煤”等等名词。然而，随着生物技术的飞速发展，酶迅速的深入应用于人们息息相关的各工业部门及日常生活中来。当你幸福的享受生活的时候，您可能已经在使用许多用酶制剂生产出来的产品，比如：爽口的果汁、香甜面包、清洁能力出众的洗衣粉、舒适的服装，以及昨天刚在超市买的调味品、化妆品、减肥品，今天朋友聚会喝的白酒、红酒、啤酒等等等等。

酶是自然的产物，是生物为了生存而适应自然的产物。自古以来，酶就被应用于日常生活，远在人类游牧时代，人民已经利用动物胃液来凝固牛奶，制造奶酪。尤其在我国远古时代，四千年前，已经掌握了酿酒技术，秦汉以前，已经利用麦芽制取饴糖，古人还用粪便供兽皮脱毛、制造皮革，用动物胰脏软化皮革等等，都是酶的作用。酶的作用还被用于治病；两千五百年年前人民已懂得酒曲可治肠胃病，古代还用鸡内金（鸡胃膜）治消化不良。说明了古代我们的祖先，在那时即使还不知道什么是酶，已凭着实践所积累的丰富经验，广泛应用动物、植物与微生物的酶的催化作用，来生产生活资料和治病。

目前，随着现代生物工程技术的快速发展，尤其是基因工程、蛋白质工程在酶制剂方面的深入应用，进一步拓宽了酶制剂应用的广度和深度。使得酶制剂广泛应用于食品、洗涤剂、饲料、纺织、造纸、制药、制革、发酵、石油化工、环境保护等与国民经济息息相关的各个行业。酶和微生物是能够在人类居住的地球上的自然资源和人类不断增长的消费需求之间建立一种良好平衡的要素之一。而且伴随着科学技术，尤其是生物技术的发展，酶制剂将在许多行业发挥巨大作用，是现代众多行业进步的推动力之一，（三大技术：信息、生物、膜，生物工程技术包括四大工程技术，酶工程、发酵工程成熟）。

梅奥生物目标成为中国市场已经接受的酶制剂应用领域中的第一，并不断开拓酶制剂应用的新领域。为实现这一目标，我们须把更多的精力放在酶制剂的应用研究与开发上，积极开发各方面的新的酶制剂应用工艺（中草药、保健品、能源、可再生资源）。因此我们将致力于酶制剂应用的开发，不断开发出合适的酶制剂应用工艺，为我们的客户、乃至客户的客户提供最富创新和高效

食品酶学文献综述酶在食品加工中的应用

食品酶学文献综述酶在食品加工中的应用

食品酶学文献综述

论文题目 酶在食品加工中的应用

学生姓名 许超 班级 ****** 学号 ********

学 院 生物与农业工程学院

专 业 食品科学与工程

指导教师 周亚军

文献综述

2 摘要:介绍了现代酶工程、酶制剂在食品加工中的应用现状，以及最新研究近况。现

代酶学将为食品工业的发展起重要推动作用。

关键词：酶；食品工业；应用

Application and Prospect of Development of Enzymatic Technology in the Food Industry

Abstracts：This paper introduces important effect of enzyme in food industry，summarizes

the application of enzyme in the production of flesh，fish，eggs，milk，vegetable，beverage，

vintage，toast food and refine suger，and gives development prospectof enzyme in food

industry.

Key words：enzyme；food industry；application；

1. 前言

酶是一类具有生物催化特性的蛋白质，是一类生物催化剂，一切生物的新陈代谢

都是在各种各样酶的作用下进行的[1]

。

由于酶反应温和，专一性强，催化效率高，反应容易控制，因此十分适宜食品加

工应用[2]

。酶用于食品加工中具有以下优点：改进食品加工方法；改进食品加工条件，

降低成本；提高食品质量；改善食品风味、颜色等。目前酶工程、酶制剂已在食品加

工多个领域得到了广泛应用。

2.酶在食品加工中的应用

几千年前，人们就在不知不觉中将酶应用于制作发酵饮料等生产中，我国早在夏

禹时代酿酒就已出现。近年来，随着食品工业科学技术的不断提高，酶已广泛应用于

食用葡萄糖生产工艺

食用葡萄糖生产工艺

食用葡萄糖生产工艺

食用葡萄糖(浆)生产工艺

A、生产工艺流程图：

玉米淀粉（或精制淀粉乳)

↓

调浆计量

↓

蒸汽→ 喷射液化←淀粉酶

↓

糖化←复合糖化酶

↓

蒸汽→ 灭酶脱色←活性炭

↓

板框过滤 → 旧活性炭弃去

↓

离子交换

↓ ↙冷却水

蒸汽→ 蒸发浓缩 ——→ 葡萄糖浆

↓

降温结晶 ← 冷却水

↓

糖膏分离

↓ 食用葡萄糖生产工艺

蒸汽→ 气流干燥

葡萄糖生产工艺

葡萄糖生产工艺

葡萄的应用

结晶葡萄糖主要以玉米淀粉或大米为原料，经过一系列的加工而成。水解淀粉常用的生产工艺有三种；酸法、酸酶法、双酶法。分为工业级、口服级、注射级三种。它是可以不经过人体消化而直接被人体吸收的，适用于病人食用，也可以注射到血液中，葡萄糖是发酵行业的基础原料。同时也是食品及糕点加工中蔗糖的替代品。葡萄糖甜度是蔗糖的70%左右。

液化、糖化、脱渣、一次脱色（板框）、二次脱色(板框)、离交、蒸发、结晶、分离、干燥。辅助设备有冷却塔、反渗透、空压机。

液化糖化生产操作规程

一． 工艺操作过程

开车时先启动液化真空泵和打开板式换热器循环水进出手阀，启动液化PH调节罐搅拌，并启动10%碳酸钠溶解液计量泵向PH调节罐加入，同时淀粉车间来料通过调节阀把流量控制15立方，淀粉乳进入PH调节罐同时启动甜水泵，等淀粉乳溢流后在溢流管上取样检测淀粉乳波美控制在17.5左右。在溢流管上取样检测PH值5.5-5.7同时在溢流管上加入一次耐高温淀粉酶，加入量按干基淀粉0.35公斤平均加入。开启淀粉乳缓冲罐搅拌，等液化缓冲罐液位达到40%时.液化一次喷射开始走水。走水流量10立方，将一次喷射温度通过蒸汽调节阀迅速调到100℃。等一次闪蒸罐液位达到20%时。启动一次闪蒸出料泵，调节二次喷射流量10立方，将二次喷射温度控制在100℃。等淀粉乳缓冲罐液位达到50%时。先开启缓冲罐底出料阀并迅速关闭走水阀，并迅速调整一次喷射温度106℃，将液化流量控制在17立方，喷射后的料液，通过高压维持柱和U型维持管进入一次闪蒸罐，同时向一次闪蒸罐內加入二次耐高温淀粉酶。控制一次闪蒸罐液位，料逐渐进入二次喷射，并将二次喷射温度控制到125℃，料通过高压维持柱和U型维持管进入二次闪蒸罐。走料平稳后逐渐将一次、二次闪蒸罐液位控制到30%。启动二次闪蒸出料泵，控制一次、二次闪蒸真空调节阀，把进液化柱物料温度控制在95-98度。料先进入液化柱1#所有进柱方式是底部进料顶部出料，依次进入到第18个液化柱，料液在液化柱停留时间为90-120分钟。进满时取样检测典试是否合格。典试以棕红色为合格，典试紫色为不合格。如果不合格料液通过液化柱出料泵降温后打向淀粉乳缓冲罐重新喷射。如果料液合格通过换热器降温到61℃。料准备进入糖化工序前先启动10%稀酸计量泵、和糖化酶计量泵、PH控制到4.2-4.5、糖化酶加入量按吨干基淀粉0.45公斤。等PH调节罐满后启动糖化进料泵开启1#糖化罐进料阀，依次进满其余糖化罐。等每一个糖化罐进满后开启气动搅拌（岗位工操作）气动搅拌时间30分钟。必须保证搅拌均匀，糖化60小时DE值应达到98%以上。