骨髓间充质干细胞的生物学特性及其临床应用_陆晓茜

骨髓间充质干细胞的生物学特性及其临床应用陆晓茜 综述,刘 霆 审校(四川大学华西医院,四川成都610041)关键词 间充质干细胞;干细胞移植;基因治疗中图分类号 Q813 文献标识码 B 文章编号 1004 0501(2005)12 1490 04自从Friendenstein发现并证实骨髓中存在一种可贴壁生长的纺锤形的成纤维细胞集落形成后,各国研究室对此展开了大量的实验,证实了这些细胞具有高度自我更新和多向分化潜能,可促进造血细胞克隆形成,分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞甚至成肌细胞。

直到1991年,Caphan把这些具有一致粘附能力,在体外能高度扩增、并可多向分化的细胞群命名为骨髓间充质干细胞(bone marro w mesenchymal stem cells, MSCs)。

正常人骨髓中间充质干细胞的含量很低(1/ 105单个核细胞),在体外,间充质干细胞具有很强的自我扩增能力,扩增107倍后仍保持干细胞特性和正常表型[1]。

可以通过体外贴壁培养法分离纯化,分化为基质及多种造血以外的组织,特别是中胚层来源细胞,而且易于外源基因的转染与表达,成为细胞治疗及基因治疗的理想靶细胞。

1 间充质干细胞的生物学特征MSCs具有多向分化潜能,但对于这类细胞本身而言,仍有许多尚未完全了解的生物学特性,其独特的表面标记还不肯定。

MSCs的表面标记往往具有间质细胞、内皮细胞和肌细胞的特点,而不表达造血细胞的标志,如CD45、CD11、CD34、CD14等。

间充质干细胞分泌多种细胞因子,包括一些造血和非造血生长因子、趋化因子、粘附分子、细胞外基质分子等,并通过这些因子诱导造血干细胞表达归巢受体、调节骨髓微环境,促进造血细胞及间质干细胞的增殖分化,见表1[2~4]。

体外研究已证实,造血细胞的正常功能有赖于与骨髓基质细胞间的相互作用。

MSCs表面受体对它与造血干细胞间相互粘附至关重要。

其中CD164是造血干细胞的归巢相关抗原。

造血干细胞与细胞外基质或MSCs粘附可被二价的阳离子鳌合物或RGD多肽复合物部分阻断,提示存在整合素依赖性的粘附。

抗CD44抗体可以阻断MSCs支持的造血作用,提示CD34造血需要CD44介导的信号通路。

MSCs通过表达趋化因子受体CXCR4,增强与配体SDF 1(stromal derived factor 1)的信号,促进CD34造血干细胞归巢。

MSCs长期培养(long term bone marro w culture)作为饲养层细胞,支持C D34细胞造血。

Yanai[5]等认为,通过增加SCF (stem cell factor)、VCAM 1、I L 6的表达来增强MSCs与外周血干细胞共同移植,造血功能恢复较外周血干细胞明显提前。

表1 人间充质干细胞的表面分子标记标记物类型名 称表面抗原SH2、SH3、SH4、STR O 1、 SMA( 平滑肌肌动蛋白)、MAB1470生长因子IL 6、IL 7、IL 8、IL 11、IL 12、IL 14、IL15、LIF、M CSF、SCF、Flt 3ligand粘附分子ALACAM、ICA M 1、ICAM 2、ICAM 3、E selectin、L selec tin、P selectin、LFA 3、Cadherin5、PECA M 1、NCAM、HCA M、VCA M、Hyaluronate receptor生长因子与细胞因子受体IL 1R( / )、IL 2R、IL 3R、IL 4R、IL 6R、IL 7R、TNF1R、TNF 2R、FGFR、PDGFR、Transferrin receptor、Inteferon R整合素VLA 1、VA L 2、VLA 3、VAL 4、VLA 5、VLA 6、VLA chain、 4integrin、LFA 1 chai n、LFA 1 chain、Vitronectin R chai n、Vitronectin R c hai n、CR4chain、M ac1细胞外基质、 、 、 类胶原、纤维结合素 、层粘连蛋白、透明质酸酶、蛋白多糖其他标记T6、CD3complex、T4、T8、Tetraspan、LPS receptor、Le wisX、Leukocyte、common antigen、5 terminal nucleotidase、B7 1、HB 15、B7 2、Thy 1、M UC18、BST 12 间充质干细胞的多向分化潜能最先注意到间充质干细胞分化潜能的报道是在HLA相合的异基因骨髓移植动物模型中,受体狗在获造血重建后死于呼吸衰竭,尸解发现其双肺有广泛骨化。

此后,许多研究小组发现,体外培养的间充质干细胞最终可在动物模型中分化为间质组织,如,骨、软骨、肌腱、肌肉、神经或造血微环境等。

Kopen[6]等将纯化后的间充质干细胞注射到新生小鼠侧脑室,间充质干细胞在脑内发生转移,在海马、嗅球、纹状体等部位均有间充质干细胞来源的神经干细胞和神经元的表达,这一结果显示间充质干细胞可能超越传统上只能分化为间质组织的概念,具有更加广泛的多向分化潜能。

Brazelton[7]等通过不同方法观察到外源性间充质干细胞在小鼠脑内可转化为神经元,提示可以用间充质干细胞治疗神经退行性疾病和中枢神经系统损伤的可能性。

但是,总体来说,间充质干细胞体外分化的条件比较复杂,同一诱导物对不同物种的间充质干细胞的诱导反应、敏感程度并不相同[8]。

例如,地塞米松可诱导人间充质干细胞分化为成骨细胞,而小鼠间充质干细胞在地塞米松存在的条件下却分化为脂肪细胞;低剂量的重组人骨形成蛋白 2(rhB MP 2)诱导小鼠间充质干细胞分化为成骨细胞,而人的间充质干细胞分化为成骨细胞却需要高剂量的rhB MP 2。

此外,培养基的营养状况、细胞接种密度、操作过程等都可影响间充质干细胞的体外分化。

3 间充质干细胞在造血干细胞移植中的应用3.1 促进造血干细胞移植后造血重建:目前,许多旨在确定间充质干细胞输注与外周血造血干细胞移植后造血重建关系的临床研究已大量展开。

Koc[9]等将骨髓来源体外扩增的自体间充质干细胞输注给大剂量化疗后造血干细胞拯救的28例进展期乳腺癌患者,自体间充质干细胞静脉输注量为1.0~ 2.2 106/kg,未见明显不良反应。

输注后1h内,在外周血中能检测到间充质干细胞。

患者造血重建的速度加快,中性粒细胞达0.5 109/L的中位时间是8d(范围6~11d),血小板达20 109/L的中位时间是8.5d(范围4~19d)。

Bachier[10]等的研究中,转移性乳腺癌患者大剂量化疗后回输经体外MSCs支持下扩增的造血祖细胞(剂量1.6~2.5 108单个核细胞/kg),中性粒细胞0.5 109/L的中位时间是18d(范围15~22d),血小板20 109/L的中位时间是23d(范围19~39d)。

表明大剂量化疗后,单纯输注造血祖细胞与同时输注造血祖细胞和间充质干细胞相比,中性粒细胞、血小板恢复时间明显延长,提示大剂量化疗后输注MSCs可以缩短骨髓抑制时间,有利于尽快恢复患者的自主造血功能。

基因修饰的MSCs移植在大剂量化疗后的造血重建作用值得进一步研究。

因为一方面可直接从数量上补充MSCs,另一方面可通过基因修饰从功能上改善MSCs,从而刺激造血细胞的增殖和分化,达到重建造血和免疫功能的目的。

3.2 减轻移植物抗宿主疾病(graft versus host disease, GVHD):GVHD的预防方法通常有3种,从移植物中去除供者T淋巴细胞(体外T细胞清除术),给予抗T细胞抗体(体内T细胞清除术),以及给予氨甲蝶呤、环孢素等免疫抑制药物,最新的GVHD预防方法包括输注体外扩增的间充质干细胞以及下调宿主的抗原提呈细胞[11]。

间充质干细胞的免疫原性较弱,使正常供者异基因间充质干细胞联合异基因造血干细胞移植成为可能。

Bartholome w等[12]发现,在一个狒狒皮肤的移植模型中,输注体外扩增的供者狒狒的间充质干细胞(剂量为2 107/kg)可使皮肤移植物被排斥时间延长,使用第三者狒狒的间充质干细胞,仍可抑制受者体内的异基因免疫反应性。

日本科学家尝试一种新的骨髓采集方法,目的是最低程度减少外周血T淋巴细胞的污染。

采集的细胞不仅含有骨髓细胞还含有大量的间充质干细胞,并直接注射入受者的骨髓腔中。

在小鼠、大鼠甚至猴子体内的移植模型中,既没出现GVHD,也没有出现骨髓衰竭[13]。

瑞典研究小组利用与患者半相合的间充质干细胞,对1例患有 度aGVHD,并发有肠道和肝脏的严重损伤的患者进行输注,该病人于治疗后1年仍维持良好的生活状态。

因此他们推论间充质干细胞在体内具有强大的免疫抑制作用[14]。

为了确定同时输注异基因间充质干细胞能否提高异基因造血干细胞的成功率,减少GVHD的发生,许多多中心的临床研究正在进行,见表2[9]。

表2 间充质干细胞移植的临床应用研究阶段MSC来源病例选择目的研究单位 自体血液、肿瘤患者移植可行性、安全性CWR U/ICC*~ 自体乳腺癌、自体外周血干细胞移植移植安全性、造血重建速度CWR U/ICC自体乳腺癌、自体外周血干细胞移植造血重建速度美国,多中心异基因遗传性代谢病患者移值安全性、免疫耐受情况CWR U/ICC异基因HLA相合亲缘异基因骨髓/外周干细胞移植安全性、造血重建速度、GVHD美国,欧洲多中心异基因第三者脐带血移植移植安全性、血液学植入速度美国,明尼苏达大学~ 异基因第三者淋巴瘤,自体外周血干细胞移植造血重建速度CWR U/ICC异基因第三者HLA相合非亲缘异基因骨髓移植安全性、造血重建速度、GVHD美国,多中心注:*CWR U/ICC:Cast Western Reserve University和爱尔兰癌症中心4 间充质干细胞在基因治疗及细胞治疗中的应用前景 MSCs不仅有多向分化潜能,还易于外源基因的转染和表达,MSCs生长和分化潜能并不受逆转录病毒转染的影响。

MSCs在体内有较强的辐射耐受性,说明其是一个相对静止、更新率低的群体,如果用于基因治疗,遗传物质纠正或外源基因的表达可以持续较长时间。

对于基因突变或缺失所致的遗传,可分离自体MSCs进行体外改造,敲除突变基因,导入正常基因,将改造后的细胞重新输回体内,既纠正了遗传缺陷,又避免移植反应的发生。

骨髓MSCs具有自身多向分化潜能和易于导入外源目的基因的特点,故可将细胞治疗与基因治疗相结合而广泛应用于临床前期研究。

研究小组通过将含有CTLA4Ig基因的重组腺病毒转入大鼠MSCs,结果显示将F344大鼠的骨髓细胞和脾细胞共移植入受致死照射剂量的SD大鼠制成GVHD模型,转染有C TLA4Ig基因的MSCs输注组中GVHD的发生明显减轻[15]。