人源性嗜酸乳杆菌的分离及分子鉴定_孟岳成

文献标识码： Ａ
文章编号： １００１－ ２２３０（ ２００８） ０１－ ００１３－ ０３
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍ ａｎ
ＭＥＮＧ Ｙｕｅ－ ｃｈｅｎｇ， ＦＡＮ Ｘｉｎｇ－ ｙｉ
（ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｇｏｎｇｓｈａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｈａｎｇｚｈｏｕ ３１００３５，Ｃｈｉｎａ）
ｗｗｗ．ｃｈｉｎａｄａｉｒｙ．ｎｅｔ ｒｐｇｙ＠ｃｈｉｎａｊｏｕｒｎａｌ．ｎｅｔ．ｃｎ
中国乳品工业
人源性嗜酸乳杆菌的分离及分子鉴定
孟岳成， 范兴艺
（ 浙江工商大学 食品与生物工程学院， 杭州 ３１００３５）
பைடு நூலகம்
摘 要： 从健康婴儿的新鲜粪便中分离纯化的１０株乳杆菌， 用 嗜 酸 乳 杆 菌ｌ６Ｓ ｒＤＮＡ 的 特 异 性 引 物 和 建 立 的ＰＣＲ 方 法 对 乳 杆 菌 分 离 株
Ｔ Ｔ ＡＴ ＧＡＣ Ｃ Ｔ ＧＧＧＣ Ｔ ＡＣ ＡＣ ＡＣ ＧＴ ＧＣ Ｔ ＡＣ ＡＡＴ ＧＧ ＡＣ ＡＧＴ ＡＣ ＡＡＣ ＧＡＧＧＡＧＣ ＡＡＧＣ Ｃ Ｔ ＧＣ ＧＡＡＧＧＣ Ａ ＡＧＣ ＧＡＡＴ Ｃ
②２号菌株 ＧＣ ＧＧＧＮ Ｃ ＧＧＧＧＴ Ｔ Ｃ Ｃ Ｎ Ｔ Ｔ Ｃ ＧＧＧＧＡＣ Ｎ Ｎ － Ｔ ＡＡＧＡＣ ＡＧＧＴ ＧＧＴ ＧＣ ＡＴ ＧＧＣ Ｔ ＧＴ Ｃ ＧＴ Ｃ ＡＧＣ Ｔ Ｃ ＧＴ ＧＴ Ｃ ＧＴ ＧＡＧＡＴ ＧＴ Ｔ ＧＧＧＴ Ｔ ＡＡＧＴ Ｃ Ｃ Ｃ ＧＣ Ａ ＡＣ ＧＡＧＣ ＧＣ ＡＡＣ Ｃ Ｃ Ｔ Ｔ ＧＴ Ｃ ＡＴ Ｔ ＡＧＴ Ｔ ＧＣ Ｃ ＡＧＣ ＡＴ Ｔ ＡＡＧＴ Ｔ ＧＧＧＣ ＡＣ Ｔ Ｃ Ｔ ＡＡＴ ＧＡＧＡＣ Ｔ ＧＣ Ｃ ＧＧ Ｔ ＧＡＣ ＡＡＡＣ Ｃ ＧＧＡＧＧＡＡＧＧＴ ＧＧＧＧＡＴ ＧＡＣ ＧＴ Ｃ ＡＡＧＴ Ｃ ＡＴ Ｃ ＡＴ ＧＣ Ｃ Ｃ Ｃ Ｔ Ｔ ＡＴ ＧＡＣ Ｃ Ｔ ＧＧＧＣ Ｔ ＡＣ ＡＣ ＡＣ ＧＴ ＧＣ Ｔ ＡＣ ＡＡＴ ＧＧＡＣ ＡＧＴ ＡＣ ＡＡＣ ＧＡＧＧＡ ＧＣ ＡＡＧＣ Ｃ Ｔ ＧＣ ＧＡＡＧＧＧＡＡＧＣ ＧＡＡＴ Ｃ Ｃ Ｔ Ａ ③５号菌株 ＧＡＧＣ Ｔ ＡＣ ＧＧＡＣ Ｎ Ｔ Ｃ Ｃ Ｃ Ｔ Ｔ Ｃ ＧＮ ＧＡＡＣ ＡＣ Ｔ ＧＡＧＡＣ ＡＧＧＴ ＧＧＴ ＧＣ ＡＴ ＧＧＣ Ｔ ＧＴ Ｃ ＧＴ Ｃ ＡＧＣ Ｔ Ｃ ＧＴ ＧＴ Ｃ ＧＴ ＧＡＧＡＴ ＧＴ Ｔ ＧＧＧＴ Ｔ ＡＡＧＴ Ｃ Ｃ Ｔ ＧＣ ＡＡ Ｃ ＧＡＧＣ ＧＣ ＡＧＣ Ｃ Ｃ Ｔ Ｔ ＧＴ Ｃ ＡＴ ＧＡＧＴ Ｔ ＧＣ Ｃ ＡＧＣ Ａ Ｔ Ｔ ＡＡＧＴ Ｔ ＧＧＧＣ ＡＣ Ｔ Ｃ Ｔ ＡＡＴ ＧＡＧＡＣ Ｔ ＧＣ Ｃ ＧＧＴ ＧＡＣ ＡＡＡＣ Ｃ ＧＧＡＧＧＡＡＧＧＴ ＧＧＧＧＡＴ ＧＡＣ ＧＴ Ｃ Ａ ＡＧＴ ＡＡＴ Ｃ ＡＴ ＧＣ Ｃ Ｃ Ｃ Ｔ Ｔ ＡＴ ＧＡＣ Ｃ Ｔ ＧＧＧＣ Ｔ ＡＣ Ａ Ｃ ＡＣ ＧＴ ＧＣ Ｔ ＡＣ ＡＡＴ ＧＣ ＡＣ ＡＧＴ ＡＣ ＡＡＣ ＧＡＧＧＡＧ Ｃ ＡＡＧＣ Ｃ Ｔ ＧＣ ＧＡＣ ＧＧＣ ＡＡＣ Ｔ ＧＡＡＴ Ｃ ④７号菌株 Ｔ ＡＣ ＧＧＧＣ ＧＧＡＴ Ｔ ＡＣ Ｔ Ｔ Ｃ ＧＧＧＧＡＣ Ｔ ＡＡＧＡＣ ＡＧＧＴ ＧＧＴ ＧＣ ＡＴ ＧＧＣ Ｔ ＧＴ Ｃ ＧＴ Ｃ ＡＧＣ Ｔ Ｃ ＧＴ ＧＴ Ｃ Ｇ Ｔ ＧＡＡＡＴ ＧＴ Ｔ ＧＧＧＴ Ｔ ＡＡＧＴ Ｃ Ｃ Ｃ ＧＣ ＡＡＣ ＧＡＧＣ ＧＣ ＡＡＣ Ｃ Ｃ Ｔ Ｔ ＧＴ Ｃ ＡＴ Ｔ ＡＧＴ Ｔ ＧＣ Ｃ ＡＧＣ ＡＴ Ｔ ＡＡＧＴ Ｔ Ｇ ＧＧＣ ＡＣ Ｔ Ｃ Ｔ ＡＡＴ ＧＡＧＡＣ Ｔ ＧＣ Ｃ ＧＧＴ ＧＡＣ ＡＡＡＣ Ｃ Ｇ ＧＡＡＧＡＡＧＧＴ ＧＧＧＧＡＴ ＧＡＣ ＧＴ Ｃ ＡＡＧＴ Ｃ ＡＴ Ｃ ＡＴ Ｇ Ｃ Ｃ Ｃ Ｃ Ｔ Ｔ ＡＴ ＧＡＣ Ｃ Ｔ ＧＧＧＣ Ｔ ＡＣ ＡＣ ＡＣ ＧＴ ＧＣ Ｔ ＡＣ Ａ ＡＴ ＧＧＡＣ ＡＧＴ ＡＣ ＡＡＣ ＧＡＧＧＡＧＣ ＡＡＧＣ Ｃ Ｔ ＧＣ ＧＡ 比对结果表明， 与标准菌株的同源性分别为： ２号 菌９５．６％， ５号菌９４．８％， ７号菌９６．１％。可见３株菌与标准 菌株的同源性均较高， 进一步说明了２号、５号和７号菌 株为嗜酸乳杆菌。
１３ Ｖｏｌ．３６， Ｎｏ．１ ２００８（ｔｏｔａｌ ２０６）
研究报告 Ｒ ｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｐｅｒｓ
ｌｕｍ ＩＮ Ｃ．Ｐａｒａｍｏｕｎｔ ＣＡ凝胶成像系统。 １．２ 方法 １．２．１ 样品的采集
采集出生１～７ ｄ的健康婴儿的新鲜粪便， 与ＬＢＳ液 体培养基混合置于厌氧培养盒中， 立即运回实验室， 于３７ ℃条件下厌氧富集培养２４ ｈ。 １．２．２ 乳杆菌的分离和纯化
用质量分数为０．８５％灭菌 生 理 盐 水 将 富 集 培 养 液 进行１０倍递减稀释， 取适当的稀释度０．５ ｍＬ于灭菌培 养 皿 中 ， 用 浸 注 平 板 法 倒 入ＬＢＳ琼 脂 培 养 基 ， 摇 匀 ， 待 凝固后， 于３７ ℃厌氧培养４８ ｈ。挑取ＬＢＳ琼脂平板上具 有乳酸菌典型特征的菌落， 进行革兰氏染色镜检。将 革兰氏阳性的较长杆菌转接至ＭＲ Ｓ琼脂培养基， 纯化 培养２～３次， 将得到的纯培养物作为疑似菌株。 １．２．３ 乳杆菌小剂量基因组ＤＮ Ａ的制备
制备质量分数为１％琼脂糖凝胶， 取ＰＣＲ 扩增产物 ５ μＬ和２ μＬ ６×Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ混 匀 后 点 样 ， １００Ｖ电 泳 ４０ ｍｉｎ ， 用凝胶成像系统观察电泳结果。 １．２．７ ＰＣＲ 产物的测序
将 按 １．２．５方 法 扩 增 得 到 的 产 物 交 由 杭 州 华 大 基 因 研 发 中 心 进 行ＤＮ Ａ测 序 。从 美 国 国 立 生 物 技 术 信 息 中 心 （ Ｎ ＣＢＩ） 查 询 编 号 为 ＡＹ７７３９４７标 准 菌 株 的 １６Ｓ ｒＤＮ Ａ 序列 ， 将 测 序 结 果 用Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ比 对 软 件 与 标准菌株的序列进行对照， 得出分离株与标准菌株的
主 要 仪 器 ： ＤＫ－ ８Ｄ 型 电 热 恒 温 水 槽 ， Ｏ ＬＹＭＰＵＳ ＣＨ２０型光学显 微 镜 ， 珠 江ＬＲ Ｈ － ２５０Ａ型 生 化 培 养 箱 ， ＳＷ－ ＣＪ－ １ＦＤ型单人单面净化工作台， ＴＯ ＭＹ ＳＳ－ ３２５ 型 全 自 动 高 压 灭 菌 锅 ， Ｒ ｅｃｔａｎｇｕｌａｒ Ｊａｒ 方 形 厌 氧 培 养 盒 ， ＡｎａｅｒｏＰａｃｋ － Ａｎａｅｒｏ 厌 氧 培 养 产 气 袋 ， ＳＩＧＡＭ ３Ｋ３０ 型 台 式 高 速 冷 冻 离 心 机 ， Ｂｉｏｍｅｔｒａ Ｔｐｅｒｓｏｎａｌ ＰＣＲ 扩增仪， Ｐｈａｒｍａｃｉａ型琼脂糖电泳全套装置， Ｕｌｔｒａ－
按照文献［６］中的乳酸菌引物和检测方法进行。乳酸 菌通用前引物： ５＇ － ＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧＧＡ－ ３＇ ， 后引物： ５＇ － ＣＧＧＴＡＴＴＡＧＣＡＴＣＴＧＴＴＴＣＣＡ－ ３＇ ， 扩增片断大小为２００ ｂｐ。ＰＣＲ 反应体系为２５ μＬ： 三蒸 水１５．８ μＬ， １０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ２．５ μＬ， Ｍｇ（２５ ｍｍｏｌ／ Ｌ）２ μＬ， ｄＮ ＴＰ（各２ ｍｍｏｌ／ Ｌ）２．５ μＬ， 引 物 各０．５ μＬ， ＤＮ Ａ模 板 １ μＬ ， Ｔａｑ酶０．２ μＬ。扩增条件为： ９５ ℃预变性５ ｍｉｎ， ９５ ℃变性３０ Ｓ， ５０ ℃退火３０ Ｓ， ７２ ℃延伸１ ｍｉｎ， 循环３５ 次， 最后７２ ℃后延伸１０ ｍｉｎ。 １．２．５ 嗜酸乳杆菌的ＰＣＲ 鉴定
将 疑 似 菌 株 和Ｌａ－ ５菌 株 用ＭＲ Ｓ液 体 培 养 基 培 养 至对数生长期， 用质量浓度为５ ｇ／ Ｌ溶菌酶的ＴＥ缓冲 液破壁， 然后用ＵＮ ＩＱ － １０柱式细菌基因组ＤＮ Ａ抽提 试剂盒提取基因组ＤＮ Ａ， 并用质量分 数 为１％琼 脂 糖 凝胶电泳检测抽提结果。 １．２．４ 乳杆菌的ＰＣＲ 鉴定
Ｍ为ｍａｒｋ， ＤＮＡ １００ ｂｐ ｌａｄｄｅｒ； Ｌａ５为科汉森标准菌株； １￣１０号为菌株 图２ 嗜酸乳杆菌特异性引物ＰＣＲ 扩增片段的电泳结果 ２．４ ＰＣＲ 产物测序结果及分析 各菌株的部分ＤＮ Ａ序列及对比结果如下： ①ＡＹ７７３９４７标准菌株 Ｔ Ｃ Ｔ Ｔ ＧＡＣ ＡＴ Ｃ Ｔ ＡＧＴ ＧＣ ＡＡＴ Ｃ Ｃ ＧＴ ＡＧＡＧＡＴ ＡＣ ＧＧＡＧＴ Ｔ Ｃ Ｃ Ｃ Ｔ Ｔ Ｃ ＧＧＧＧＡＣ ＡＣ Ｔ ＡＡＧＡＣ ＡＧＧＴ ＧＧＴ ＧＣ ＡＴ ＧＧＣ Ｔ ＧＴ Ｃ ＧＴ Ｃ ＡＧＣ Ｔ Ｃ ＧＴ ＧＴ Ｃ ＧＴ ＧＡＧ ＡＴ ＧＴ Ｔ ＧＧＧＴ Ｔ ＡＡＧＴ Ｃ Ｃ Ｃ ＧＣ ＡＡＣ ＧＡＧＣ ＧＣ ＡＡＣ Ｃ Ｃ Ｔ Ｔ ＧＴ Ｃ ＡＴ Ｔ ＡＧＴ Ｔ ＧＣ Ｃ ＡＧＣ ＡＴ Ｔ ＡＡＧＴ Ｔ ＧＧＧＣ Ａ Ｃ Ｔ Ｃ Ｔ ＡＡＴ ＧＡＧＡＣ Ｔ ＧＣ Ｃ ＧＧＴ ＧＡＣ ＡＡＡＣ Ｃ ＧＧＡＧＧ ＡＡＧＧＴ ＧＧＧＧＡＴ ＧＡＣ ＧＴ Ｃ ＡＡＧＴ Ｃ ＡＴ Ｃ ＡＴ ＧＣ Ｃ Ｃ Ｃ
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｅｎ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｆｒｅｓｈ ｉｎｆａｎｔ ｆｅｃｅｓ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ． Ｔｈｒｅｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ｂｙ ｍｅａｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆｏｕｎｄ ＰＣＲ ｗｉｔｈ ｓｐｅｃｉａｌ ｐｒｉｍｅｒ ｏｆ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ． Ｔｈｅｎ ｔｈｅ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｗｅｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｓｔｒａｉｎｓ ａｒｅ ｈｉｇｈｌｙ ｓｉｍｉｌａｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｓｔｒａｉｎ． Ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｔｌｙ，ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ｍｏｌｅｃｕｌａｒｌｙ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ； １６Ｓ ｒＤＮＡ； ＰＣＲ ； ｓｅｑｕｅｎｃｅ