杂草抗（耐）药性检测技术
1. 1 整株水平测定整株植物测定法。一般所使用的方法为Ryan法(1970) , 该法简便易行。具体方法为: 首先从怀疑有抗药性杂草生物型和从未使用过除草剂的田块采集杂草种子, 按小区大田播种或温室盆栽, 在播后芽前或苗后进行常规施药处理。药剂设置不同浓度梯度,通过测定不同剂量下杂草的出苗率、死亡率、叶面积、鲜重、干重等指标, 与对照比较, 以确定抗药性水平。盆栽试验能够提供杂草交互抗性或多抗性方面的信息, 可以指导轮换用药,但是这种方法无法确定抗药性产生的原因和机理等问题, 且费时长, 但技术简单易行, 大批量植株可同时进行, 且重复性较好, 因而是抗药性检测的常用方法。
幼苗检测法。具体方法是: 在玻璃试管中放置湿润的滤纸, 把种子摆放在滤纸上, 然后将试管放到盛有营养液( 不含药剂) 的培养皿中, 通过滤纸吸取营养液, 种子在滤纸上发芽,一段时间后, 把带根(长3～5mm) 的种子转移到封闭的瓶中滤纸上, 将不同浓度的药剂溶液加到瓶中, 在一定条件下培养, 通过测量芽长或胚芽鞘的长度测定杂草的抗药性水平。
1. 2 器官或组织水平测定根据杂草对除草剂产生的局部反应, 抗药性杂草往往会在组织或器官的形态结构上表现出差异性, 测定这种差异便可以鉴定抗药性。
培养皿种子检测法。这种方法是把催芽的杂草种子放在加入药剂的琼脂平面或浸药的滤纸上培养, 通过测定发芽率、主根长、鲜重或干重等指标鉴定抗药性。此法相对快速、廉价、可靠, 尤其是对大量杂草种群的常规抗药性检测非常重要。如, Letouze A等( 1997) 、MossSR等( 1999) 建立的用以检测禾本科杂草抗药性的方法。
分蘖检测法。把种子种植在粗沙和泥炭( 体积之比1︰3) 的混合物中, 在温室内培养。选取3叶期( 第3叶未充分展开) 正生长的分蘖,小心地除去根, 把分蘖放在高浓度的药剂溶液中, 一段时间后, 通过比较第3叶坏死程度来评价杂草的抗药性水平。
叶圆片浸渍技术测定法。首先将健康的叶片用打孔器打取相同面积的叶圆片, 将叶圆片浸渍在含有一定浓度除草剂的磷酸缓冲溶液的试管中, 抽真空, 小圆片下沉至试管底部, 解除真空, 加入少量NaHCO3溶液, 照光, 对除草剂不敏感或产生抗药性的生物型, 光合作用未被抑制, 组织间产生足够多的O2, 叶圆片上浮;而对除草剂敏感的生物型, 光合作用受抑制,不能产生足够多的O2, 圆片仍沉在
试管底部。此法可鉴定对抑制光合作用的除草剂产生抗性的生物型。
花粉粒萌发法。按分蘖检测法所示种植杂草。剪取具花药的刚从颖片抽出的穗,转移到盛水的烧杯中, 放在距冷光20cm的地方,诱导释放花粉, 把花粉震落到0.25%含系列浓度药剂的固体琼脂培养基上。一定条件下培养一段时间后, 用显微镜(200倍) 观察花粉萌发情况。萌发花粉计数以花粉管长度至少达半个花粉粒长度为准。该法可对田间正在生长的杂草实现快速抗药性检测。
茎切面再生苗测定法。温室或者大田常规处理, 一般采用盆栽法, 当杂草生长至3叶1心期, 用一定剂量的除草剂茎叶处理, 一定时间后( 视除草剂吸收情况) 沿第2叶部位切除上部植株, 通过测定再生的茎段长度检测杂草抗药性。此法可用于禾本科杂草对内吸传导型除草剂的抗性检测鉴定。此外, 切片、压片技术结合电镜技术, 通过观察形态学变化亦可检测鉴定除草剂抗性生物型, 常用组织的石蜡切片、根尖、茎尖、花粉母细胞的压片等。
1. 3 细胞或细胞器水平测定
叶片叶绿素荧光测定法。荧光反应被称为光合作用的探针。当用光合作用抑制剂, 如取代脲类、三氮苯类或脲嘧啶类, 处理植物叶片时, 光合作用抑制剂阻断电子由QA到QB的传递, 光系统II的还原端被中断, 捕获的光能不能往下传递, 叶绿素a处于激发态, 以荧光的方式释放能量, 通过测定叶绿素a发射荧光的强弱可以检测抗药性。方法有Tucruet、Gasguea 氏法和Ahrens 法。Tucruet、Gasguea氏法是在清晨采取植物幼叶, 黑暗条件下浸于除草剂水溶液中, 2h后取出, 用短波光照射叶片背面, 测定叶片发出的荧光强度;Ahrens法是从清晨采取的幼叶上切取叶圆片, 光照的条件下悬浮于去离子水20～60min, 取出并吸干上面的水, 正面朝上放在黑布上, 黑暗条件下测定其荧光强度, 后将叶圆片面朝下, 放入含有表面活性剂和除草剂的溶液中, 照光后测定荧光强度。
离体叶绿体测定技术。光合作用抑制剂抗性生物型的类囊体膜上的光系统II 组分发生了改变, 导致电子传递的变化, 从而造成叶绿体的光还原反应能力下降, 通过测定希尔反应或荧光反应, 可以检测杂草的抗药性。酶解法提取叶绿体。希尔反应测定技术是将提取的叶绿体放入含有氧化剂( DCPIC) 的希尔反应介质中,叶绿体在光照下放出氧气, 并将氧化剂还原。荧光反应测定技术是通过测定叶片中荧光强度来鉴定光系统II的功能。叶绿体荧光测定须在黑暗中进行。用蓝色闪光照射叶绿体悬浮液, 叶绿素发射荧光, 用光电极管测定发射的荧光。此外, 还
可以通过测定叶绿素含量的变化检测抗药性。
光合速率测定法。光合作用抑制剂杂草抗性生物型在处理后其光合速率变化不大, 而敏感生物型的则受到严重抑制。通过测定光合速率的诱导变化研究光合作用抑制剂对植物或叶片的影响, 可以检测鉴定杂草抗药性, 主要方法有: 红外线CO2测定法、氧电极测定法、pH比色法、气流测定法、改进的干重测定法和半叶法等。
呼吸速率测定法。抑制呼吸作用的除草剂不多, 如五氯酚钠、二硝酚、二乐酚、碘苯腈、溴苯腈、敌稗、氯苯胺等。测定方法可参照光合速率测定法。
1. 4 分子水平测定对于作用靶标已明确的除草剂, 可通过测定靶标酶或与靶标酶催化的反应存在密切关联的酶的活性差异或某些代谢物质量的差异判断杂草抗药性; 对于已经获知编码基因的除草剂靶标酶, 可使用DNA分析技术判断杂草的抗药性。通过测定ALS ( 乙酰乳酸合成酶) 的活性判断杂草对ALS抑制剂的抗性, 测定ACCase ( 乙酰辅酶A羧化酶) 的活性判断杂草对ACCase抑制剂的抗性, 内野彰根建立了通过测定ALS蓄积量判断母草属等水田杂草对磺酰脲类除草剂抗性的快速鉴定方法。
叶圆片亚硝酸还原酶活性测定法。抑制光合作用的除草剂能导致植物绿色组织中亚硝酸还原酶的活性下降, 亚硝酸浓度增加, 同时还使光系统II中的电子载体部位受到抑制, 根据组织中亚硝酸还原酶的活性可鉴定抑制光合作用的除草剂抗性生物型。
酶联免疫测定( ELISA) 法和DNA分析技术。酶联免疫法酶联免疫法( enzyme －linked immunosorbent assay，ELISA) 始于20 世纪70年代，是把抗原或抗体在不损坏其免疫活性的条件下预先结合到某种固相载体表面。测定时，将受检样品和酶标抗原或抗体按一定程序与结合在固相载体上的抗原或抗体起反应形成抗原或抗体复合物。反应终止时，固相载体上酶标抗原或抗体被结合，其量与标本中待检抗体或抗原的量成一定比例。经洗涤去除反应液中其他物质，加入酶反应底物后，底物被固相载体上的酶催化变为有色产物，最后通过定性或定量分析有色产物量即可确定样品中待测物质含量。2002 年Reade 等建立了田间酶联免疫测定看麦娘谷胱甘肽－S －转移酶( GSTs) 丰度检测看麦娘对绿麦隆、异丙隆和精口恶唑禾草灵抗药性的技术。
1．4．2 DNA( 或RNA) 分析法对于已经获知编码基因的除草剂靶标酶，可使用DNA( 或RNA) 分析方法判断杂草的抗药性。该法通常先提取基因组总
