肝气郁结证, 肝火上炎证与5-HTT, TPH 基因多态性相关研究[J

２００４年第ｌ０卷第３期　２００４．Ｖｏ１．１０．Ｎｏ．３　中国中医基础医学杂志　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎ　ａｌ　０ｆ　Ｂａｓｉｃ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ｉｎ　Ｔｍｄｉｔｉ。ｎａ１　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　４９　（总第２０９页）　

【实验研究】　

肝气郁结证、肝火上炎证与５－ＨＴＴ、ＴＰＨ基因　

多态性相关研究　

胡随瑜　，尤劲松　，张宏耕　

（１．中南大学湘雅医院中西医结合研究所，湖南长沙４１０００８；　

２．湖南省脑科医院神经症科，湖南长沙４１０００７）　

摘要：目的：探讨肝气郁结证、肝火上炎证与五羟色胺转运体（５一Ｈ１Ｔｒ）、色氨酸羟化酶（ＴＰＨ）基　

因三种多态性的相关性。方法：运用多聚酶链式反应技术（ＰＣＲ）检测５０例肝气郁结证、５０例肝火　

上炎证患者与９０例健康对照者三种基因多态性的分布频率。结果：肝火上炎证患者５．Ⅲｆ］ｒ启动子　

区多态性（５一ＨＴＹＬＰＲ）的ＳＳ（ｓｈｏｒｔ／ｓｈｏｒｔ）基因型和Ｓ（ｓｈｏｒｔ）等位基因频率分别为７２％和８５％，健康对　

照者ＳＳ基因型和Ｓ等位基因频率分别为４９％和７ｌ％，两组之间比较差异有显著性（Ｐ＜０．０５）。肝　

气郁结证患者５－ＨＴＹＬＰＲ的ｓｓ基因型和ｓ等位基因频率分别为５８％和７４％，与健康组比较差异无　

显著性。５一｝Ｉ］ｆ］ｒ内含子２可变数串联重复序列（ＶＮＴＲ）多态性和ＴＰＨ基因Ａ２１８Ｃ多态性各基因型　

和等位基因频率在肝气郁结证、肝火上炎证患者组与健康人组中均差异无显著性（Ｐ＞０．０５）。结　

论：５－ＨＴＹＬＰＲ多态性ＳＳ型个体可能是肝火上炎证的易感人群。　

关键词：中医肝证；基因；多态性；五羟色胺转运体；色氨酸羟化酶　

中图分类号：Ｒ２．０３１　文献标识码：Ｂ　文章编号：１００６—３２５０（２００４）０３—００４９．０４　

Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　Ｓｔｕｄｙ　ｆｏｒ　Ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ　Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ　ａｎｄ　

Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ　Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ　Ｇｅｎｅ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ　ａｎｄ　Ｈｅｐａｔｉｃ　Ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ　

Ｓｙｎｄｒｏｍｅ　ａｎｄ　Ｈｙｐｅｒｐｙｒｅｘｉａ　ｏｆ　Ｌｉｖｅｒ　Ｓｙｎｄｒｏｍｅ　Ｄｉｓｏｒｄｅｒ　

ＨＵ　Ｓｕｉ—ｙｕ，ＹＯＵ　Ｊｉｎ—ｓｏｎｇ　，ＺＨＡＮＧ　Ｈｏｎｇ—ｇｅｎｇ　

（＊Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆＣｏｍｂｉｎｅｄ　Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ａｎｄ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｍｅｄｗｉｎｅ，Ｘｉａｎｇｙａ　Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，　

Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｓｏｕｔｈ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｓｈａ　４１０００８，Ｃｈｉｎａ）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ　ｅｘｐｌｏｒｅ　ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｈｅｐａｔｉｃ　ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ　ａｎｄ　ｈｙｐｅｒｐｙｒｅｘｉａ　ｏｆ　ｌｉｖｅｒ　

ｓｙｎｄｒｏｍｅ　ｄｉｓｏｒｄｅｒ　ａｎｄ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ（５一Ｈ１Ｔｒ）ａｎｄ　ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ　ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ（ＴＰＨ）．Ｍｅｔｈｏｄｓ：　

Ｕｓｉｎｇ　ａ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ—ｂａｓｅｄ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ｔｈｅ　ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ　ｏｆ　５－ＨＴＹＬＰＲ，５－Ｈ１Ｔｒ　ｉｎｔｒｏｎ２　ＶＮＴＲ，ａｎｄ　１＇ＰＨ　ｉｎｔｒｏｎ７　

Ａ２１８Ｃ　ｐｏｌｙｍｏ￣ｈｉｓｍｓ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｉｎ　ｐａｔｉｅｎｔ　ｇｒｏｕｐｓ　ａｎｄ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｓｕｂｊｅｃｔｓ．Ｇｅｎｏｔｙｐｅ　ａｎｄ　ａｌｌｅｌｅ　ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ　

ｂｅｔｗｅｅｎ　ｐａｔｉｅｎｔ　ｇｒｏｕｐｓ　ａｎｄ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｓｕｂｊｅｃｔｓ　ｗｅｒｅ　ｃａｒｒｉｅｄ　ｏｕｔ　ｗｉｔｈ　ｃｈｉ．ｓｑｕａｒｅ　ｔｅｓｔｓ　ｏｒ　Ｆｉｓｈｅｒ’Ｓ　ｅｘａｃｔ　ｔｅｓｔｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：　ｅ　

ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ　ｏｆ　５・ＨＴＹＬＰＲ　ｓｈｏｒｔ／ｓｈｏｒ（ＳＳ）ｇｅｎｏｔｙｐｅ　ｗｅｒｅ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｈｉｇｈｅｒ　ｉｎ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｈｙｐｅｒｐｙｒｅｘｉａ　ｏｆ　ｌｉｖｅｒ　

ｓｙｎｄｒｏｍｅ　ｔｈａｎ　ｉｎ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｓｕｂｊｅｃｔｓ（７２％ＶＳ　４９％，Ｐ＝０．０２６），ａｎｄ　ｔｈｅ　Ｓ　ａｌｌｅｌｅ　ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ　ｗｅｒｅ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｈｉｇｈｅｒ　ｉｎ　

ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｈｙｐｅｒｐｙｒｅｘｉａ　ｏｆ　ｌｉｖｅｒ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ　ｔｈａｎ　ｉｎ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｓｕｂｊｅｃｔｓ（８５％ＶＳ　７１％，Ｐ＝０．００９）．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅｒｅ　ｗｅｒｅ　ｎｏ　

ｄｉｆｅｒｅｎｃｅｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｏｆ　５－ＨＴＹＬＰＲ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｏｆ　ｈｅｐａｔｉｃ　Ｑｉ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ　ａｎｄ　ｃｏｎｔｒｏｌｓ．Ｎｏ　

ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｇｅｎｏｔｙｐｅ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｏｒ　ｔｈｅ　ａｌｌｅｌｅ　ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ　ｏｆ　５－Ｈ１Ｔｒ　ｉｎｔｒｏｎ２　ＶＮＴＲ　ａｎｄ　ＴＰＨ　ｉｎｔｒｏｎ７　

Ａ２　１　８Ｃ，ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ　ｗｅｒｅ　ｒｅｖｅａｌｅｄ　ｗｈｅｎ　ｃｏｍｐａｒｉｎｇ　ｃｏｎｔｒｏｌｓ　ａｎｄ　ａｌｌ　ｐａｔｉｅｎｔ　ｇｒｏｕｐｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｉｓ　ｆｉｎｄｉｎｇ　ｓｕｐｐｏｒｔ　ｔｈｅ　

ｐｒｅｓｅｎｃｅ　ｏｆ　５－ＨＴＹＬＰＲ　ＳＳ　ｇｅｎｏｔｙｐｅ　ｍａｙ　ｉｎｃｒｅａｓｅ　ｔｈｅ　ｒｉｓｋ　ｏｆ　ｈｙｐｅｒｐｙｒｅｘｉａ　ｏｆ　ｌｉｖｅｒ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｌｉｖｅｒ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ　ｏｆ　Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ；ｇｅｎｅ；ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ；ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ　

ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ　

＊基金项目：国家自然科学基金资助项目（３００７０９５３）

　５０　（总第２１０页）　中同中医基础医学杂志　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｓｉｃ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ｉｎ　Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　２００４年第ｌ０卷第３期　２００４．Ｖ０１．１０．Ｎｏ．３　

中医证候是一种相对稳定的病理生理状态，形　

成这种病理生理状态的原因可能与个体基因所决定　

的遗传易感素质有关。本文检测了三种与情绪关系　

密切的基因多态性各基因型和等位基因在肝气郁结　

证和肝火上炎证中的分布频率，探讨与中医肝病证　

候相关的分子遗传机理。　

１资料与方法　

１．１　研究对象　

按照中医辨证与西医诊断相结合的方法选择研　

究对象。　

１．１．１　中医辨证　按本所研究并经鉴定的标准　。　

１．１．２　西医诊断　神经症按中国精神疾病分类方　

案与诊断标准第２版修订版　，偏头痛按１９９８年国　

际头痛分类委员会标准　，原发性高血压按１９９９年　

ＷＨＯ／ＩＳＨ高血压指南诊断标准　ｊ。　

１．１．３　分组　肝气郁结证５０例（西医病种包括神　

经症２５例，偏头痛２５例），肝火上炎证５０例（西医　

病种包括神经症２５例，偏头痛１例，原发性高血压　

２４例）。　

１．１．４　研究对象来源　研究对象均为湖南汉族人　

群，对本研究知情并同意。患者组共１００例，为２００１　

年３月～２００２年３月湖南省脑科医院、中南大学湘　

雅医院门诊及住院患者，男５１例，女４９例，平均年　

龄３９．７岁±１３．０３岁。对照组共９０例，按与患者组　

性别、年龄大致相当的条件选取，其中男４２例，女４８　

例，年龄３８．２岁±１　１．０５岁，来自本校学生、本院职　

工，经病史调查、体检、血常规、肝功能、胸透、心电图　

等检查，排除精神及重大躯体疾病，本人及家庭无精　

神病史。　

１．２　方法　

１．２．１　血标本采集及ＤＮＡ抽提　取肘静脉血５ｍｌ，　

０．２％ＥＤＴＡ．Ｎａ　抗凝，用淋巴细胞分离液分离单个　

核细胞，常规酚、氯仿法抽提基因组ＤＮＡ。　

１．２．２　ＰＣＲ条件及产物检测　五羟色胺转运体启　

动子区多态性（５－ＨＴｒＬＰＲ）基因Ｓ／Ｌ型多态性检测，　ＰＣＲ反应液共２Ｏｒａｌ，含有５０ｎｇ～１００ｎｇ基因组ＤＮＡ，　

１０ｐｍｏｌ引物，１ｕ　ＬＡ．Ｔａｑ酶，ＩＯｔＡ　２×ＧＣ缓冲液，　

２５０ｔｘｍｏｌ／Ｌ　ｄＮＴＰｓ。ＰＣＲ条件：９４℃５ｍｉｎ预变性，继　

以９４℃变性６０ｓ，６１℃退火３０ｓ，７２℃延伸６０ｓ．共３０　

个循环，７２℃延伸１０ｍｉｎ。将ＰＣＲ产物干６％非变性　

聚丙烯酰胺凝胶电泳分离４ｈ，以硝酸银染色法检棍　

各区带。５．Ｈ１Ｔｒ基因内含子２可变数目串联重复序　

列（ＶＮＴＲ）多态性检测，ＰＣＲ反应液共２Ｏｒａｌ，含有　

５０ｎｇ～１００ｒｉｇ基因组ＤＮＡ，１０ｐｍｏｌ引物，１ｕ　Ｔａｑ酶，　

７５ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ．ＨＣ１（ｐＨ８．８），２０ｍｍｏｌ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４，　

０．０１％Ｔｗｅｅｎ，２００￣．ｍｏｌ／Ｌ　ｄＮＴＰｓ，１．２５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＣ１，。　

ＰＣＲ条件：９４℃５ｍｉｎ预变性，继以９４℃变性６０ｓ，　

５８℃退火３０ｓ，７２℃延伸６０ｓ，共３０个循环，７２℃延伸　

１０ｍｉｎ。将ＰＣＲ产物干２％琼脂糖凝胶电泳分离。　

ＴＰＨ基因内含子７　Ａ２１８Ｃ多态性检测，ＰＣＲ反应液　

共２０／￣１，含有５０ｎｇ～１００ｎｇ基因组ＤＮＡ，１０ｐｍｏｌ引　

物，１Ｕ　Ｔａｑ酶，７５ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｆｉｓ．ＨＣ１（ｐＨ８．８），２０ｍｍｏｌ／Ｌ　

（Ｎ｝｛４）２Ｓ０Ｊ，０。０１％Ｔｗｅｅｎ，２００￣．ｍｏｌ／Ｌ　ｄＮＴＰｓ，　

１．５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＣ１，。ＰＣＲ条件：９４℃５ｍｉｎ预变性，继　

以９４℃变性６０ｓ，５８℃退火３０ｓ，７２℃延伸６０ｓ，共３０　

个循环，７２ｃＩ＝延伸１０ｍｉｎ。将ＰＣＲ产物中加入５Ｕ限　

制性内切酶Ｎｈｅ　ｌ于３７℃温箱中消化１２ｈ，１．５％琼　

脂糖凝胶电泳分离。　

１．２．３　统计学方法　各基因型、等位基因频率比较　

用Ｘ　检验或Ｆｉｓｈ’Ｓ精确检验。　

２　结果　

２．１　肝气郁结证、肝火上炎证与健康人对照组５．　

ＨＴｒＬＰＲ基因多态性检验结果（见表１及图１）　

由表１可见，肝火上炎证患者组与健康人组５．　

Ｈ１ＴｒＬＰＲ基因型及等位基因分布频率差异有显著性　

（Ｐ＝０．０２６，Ｐ＝０．００９），肝火上炎证患者ＳＳ基因型　

频率和Ｓ等位基因频率明显高于健康人组（７２％ｖｓ　

４９％，８５％ＶＳ　７１％）；肝气郁结证组与健康人组比较　

各基因型和等位基因频率均差异无显著性。　

表１　各组５－ＨＴＴＬＰＲ基因型和等位基因频率比较（％）　

注：括号内数据为百分比，Ｐ值项为各证型组与健康人对照组比较