基于G-四链体-氯化血红素DNA酶比色法测定银离子和汞离子传感器的构筑

汞离子功能核酸生物传感器的建立与应用杜再慧;李相阳;田晶晶;田洪涛;许文涛【摘要】利用汞离子(Hg2+)特异性功能核酸对Hg2+识别检测,其中模板主要包括与Hg2+特异性结合的识别区、形成G四链体的富G区以及由聚六乙二醇(Spacer18)链接的隔断区;靶序列主要包括5'端配对区和3'端富T区.模板与靶序列只有在Hg2+存在的条件下才能结合并引发延伸,进而使富G序列在模板上剥离下来,但由于Spacer18的隔断作用导致富G序列以单链形式存在,在特定环境下形成具有过氧化物模拟酶活性的G-四链体,催化H2 O2与2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二胺盐(ABTS)发生肉眼可见的颜色变化,进而对Hg2+进行定量测定.利用构建的Hg2+功能核酸生物传感器,35 min内可完成检测,线性范围为20～500 nmol/L,检出限达到16.5 nmol/L(3σ).实际水样中的加标回收率为98.5％～103.5％.本方法操作简单、成本低、耗时短,在应急处理、实时环境检测等方面具有良好的应用价值.%Excessive mercury ions have negative effects on individual health. So, it is of great significance to develop a method for rapid, sensitive and specific detection of Hg2+. In this study, the method for detection of Hg2+ was developed based on specific T-Hg-T mismatche and G-quadruplex. The template sequence mainly included the recognition region which could combine with Hg2+ specifically, the rich G region which could form G-quadruplex, and the speacer 18 partition zone. The target sequence mainly included 5' ends combining area and 3' end T-rich region. Templates and targets could be combined and the elongation was triggered only in the presence of Hg2+. Furthermore, the G-rich sequences were stripped off the templates and could form a single-stranded structure,because Spacer 18 had partition function. The G-quadruplex was formed with the K+and hemin, and catalyzed H2 O2-2,2-azinobis (3-ethylbenzothiozoline)-6-sulfonic acid(ABTS) reaction with color variations. The detection could be done within 35 min, and the Hg2+ concentration exhibited a linear correlation with absorbance at 414 nm within range of 20-500 nmol/ L, with a detection limit of 16. 5 nmol/ L (3σ). The recoveries of Hg2+ spiked in tap water were 98. 5％ - 103. 5％ . The method exhibited the advantages such as simple operation, low cost and short time, and operation value in emergency treatment and real-time environmental detection.【期刊名称】《分析化学》【年(卷),期】2018(046)006【总页数】5页(P947-951)【关键词】汞离子;G四链体;间隔臂;功能核酸;生物传感器【作者】杜再慧;李相阳;田晶晶;田洪涛;许文涛【作者单位】河北农业大学,食品科技学院,保定 071000;北京农学院, 食品科学与工程学院, 北京 102206;中国农业大学,北京食品营养与人类健康高精尖创新中心,北京 100083;中国农业大学,食品科学与营养工程学院,北京 100083;河北农业大学,食品科技学院,保定 071000;中国农业大学,北京食品营养与人类健康高精尖创新中心,北京 100083;中国农业大学,食品科学与营养工程学院,北京 100083【正文语种】中文1 引言汞 (Hg)是一种分布广泛的重金属，进入环境后很难降解，可通过生物富集作用在动物或人体内积累，对人体健康具有极大的危害[1～3]。

㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀2023年12月第38卷第6期JOURNAL OF LIGHT INDUSTRY㊀Vol.38No.6Dec.2023㊀收稿日期:2023-03-16;修回日期:2023-05-01;出版日期:2023-12-15基金项目:河南省重点研发与推广专项项目(222102310140);河南省高等学校重点科研项目(21A550015);郑州轻工业大学博士启动科研基金项目(0123-135****0070)作者简介:伍永梅(1987 ),女,河南省新乡市人,郑州轻工业大学讲师,博士,主要研究方向为食品安全和疾病标志物检测㊂E-mail :wuyongmei@通信作者:白艳红(1975 ),女,辽宁省彰武县人,郑州轻工业大学教授,博士,主要研究方向为肉制品加工与安全控制㊂E-mail :baiyanhong212@163.com伍永梅,朱肖倩,方娇,等.基于改进G -四链体DNA 酶的电化学适配体传感器构建及卡那霉素高灵敏检测[J].轻工学报,2023,38(6):62-69.WU Y M,ZHU X Q,FANG J,et al.Construction of electrochemical aptasensor for highly sensitive detection of kanamycin based on the improved G-quadruplex DNAzyme[J].Journal of Light Industry,2023,38(6):62-69.DOI:10.12187/2023.06.008基于改进G -四链体DNA 酶的电化学适配体传感器构建及卡那霉素高灵敏检测伍永梅1,2,3,朱肖倩1,方娇1,白艳红1,2,31.郑州轻工业大学食品与生物工程学院,河南郑州450001;2.河南省冷链食品质量安全控制重点实验室,河南郑州450001;3.食品生产与安全河南省协同创新中心,河南郑州450001摘要:将阳离子多肽(peptide )与G -四链体DNA 酶(G4DNAzyme )共价组装得到高活性的G4DNAzyme-peptide 复合物,进一步构建新型电化学适配体传感器,研究该复合物对电化学适配体传感器响应性能的影响,并将该传感器用于牛奶中卡那霉素(KANA )的检测分析㊂结果表明:G4DNAzyme-peptide 可以显著放大电化学信号,明显提高传感器检测灵敏度;在捕获探针序列最优浓度(2.0μmol /L )下,电流信号强度变化与目标物浓度(0.06pmol /L ~20nmol /L )对数值呈良好的线性关系,检测限为0.02pmol /L ,优于其他KANA 检测方法;该传感器对KANA 具有良好的选择性,在实际牛奶样品检测中,KANA 的加标回收率为97.1%~105.5%,相对标准差为3.60%~5.74%,且检测结果与ELISA 法一致,说明该传感器能够实现牛奶中KANA 的高灵敏检测㊂关键词:G -四链体DNA 酶;电化学适配体传感器;卡那霉素;高灵敏度中图分类号:TS207.3㊀㊀文献标识码:A㊀㊀文章编号:2096-1553(2023)06-0062-080㊀引言卡那霉素(Kanamycin,KANA)是一种氨基糖苷类抗生素,可以抑制革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌蛋白质的合成,常作为兽药广泛用于畜牧业中奶牛的饲养[1]㊂但过量使用会导致牛奶中的抗生素残留,残留的KANA 通过食物链进入人体,经过长时间的体内积累对人体造成损伤㊂传统的抗生素检测技术主要包括高效液相色谱(HPLC)法[2]㊁液相色谱-质谱(LC-MS)法[3]㊁毛细管电泳(CE)法[4]㊁酶联免疫分析(ELISA)法[5]㊁气相色谱-质谱(GC-MS)法[6]㊂但这些技术均存在预处理步骤繁琐㊁操作成本高昂等问题[7]㊂因此,开发一种快速㊁可靠㊁便捷的抗生素检测方法具有重要意义㊂㊃26㊃㊀伍永梅,等:基于改进G-四链体DNA酶构建电化学适配体传感器高灵敏检测卡那霉素电化学检测技术因灵敏度高㊁设备简单㊁便携性强等优点,在生物传感器领域得到广泛应用[8-9]㊂适配体是通过指数富集的配体系统进化技术筛选的短单链DNA(ssDNA)或RNA片段,可以特异性识别DNA㊁RNA㊁抗生素㊁蛋白质等目标物㊂与抗体㊁酶等其他识别分子相比,适配体具有结合能力强㊁特异性高等优点[10]㊂因此,电化学适配体传感器可广泛应用于疾病标志物㊁金属离子和食品危害物的检测㊂M.X.Li等[11]通过目标物microRNA与适配体特异性识别,利用杂交链式反应(Hybrid Chain Reaction, HCR)和Mg2+DNA酶构建电化学适配体传感器,实现了癌症细胞中microRNA的灵敏检测㊂ C.Lei 等[12]基于金纳米粒子(AuNPs)和铀酰离子(UO2+2) DNA酶辅助的电化学适配体传感器,对水中UO2+2进行电化学检测,检测限可达6.2pmol/L㊂G-四链体(G4)是由一段富含鸟嘌呤(G)碱基的寡核苷酸序列组成[13],可以在单价阳离子(如Na+㊁K+)的作用下与卟啉铁(Hemin)结合,形成具有辣根过氧化物酶(HRP)活性的模拟酶,即Hemin/ G4DNAzyme[14]㊂Hemin/G4DNAzyme具有成本低㊁稳定性好㊁催化活能高等优点,可催化底物H2O2加速电子转移,显著增强电化学信号[15],但比天然HRP活性低㊂鉴于此,本文拟以KANA为目标物,将多肽(Peptide)与G4DNAzyme共价组装得到高活性的G4DNAzyme-peptide复合物,以Hemin为电子媒介体构建电化学适配体传感器,考查该复合物对电化学适配体传感器响应性能的影响,并将该传感器应用于牛奶中KANA的检测,以期为食品中抗生素的高灵敏检测提供新思路㊂1㊀材料与方法1.1㊀主要材料与试剂牛奶,郑州市高新区大张超市;卟啉铁(Hemin)㊁6-巯基己醇(6-Mercaptohexyl Alcohol, MCH)㊁三(2-羧乙基)膦酸盐(Tris-(2-carboxyethyl)-phosphine Hydrochloride,TCEP)㊁氯金酸(HAuCl4),均为分析纯,Sigma-Aldrich公司;组氨酸多肽(Pep-tide),上海科肽生物技术有限公司(中国);卡那霉素(KANA)㊁妥布霉素(Tobramycin,TOB)㊁链霉素(Streptomycin,STR)㊁四环素(Tetracycline,TET),均为标准品,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;5ˑTBE缓冲液,海生工生物工程有限公司;抗生素适配体序列[16](Aptamer,Apt:5ᶄ-TGGGGGTTGAGGCTA-AGCCGA-3ᶄ,解离常数为78.8nmol/L)㊁模板DNA 序列(Template,TP:5ᶄ-CCCGCCCTACCCACAGTGAT-CGGCTTAGAGGACTACCCCCA-3ᶄ)㊁辅助探针序列(Assistant Probe,AP:5ᶄ-GTCCTCTAAGCCGATCACT-GTGGGTAGGGCGGG-3ᶄ)㊁捕获探针序列(Capture Probe,CP:5ᶄ-SH-AGTGATCGGAAAAAA-SH-3ᶄ)㊁叠氮(N3)标记的含G碱基的DNA序列(N3-G4DNA:5ᶄ-N3-CCGATCACTGTGGGTAGGGCGGGTTGG-3ᶄ)㊁二苯并环辛炔(Dibenzocyclooctyne,DBCO)标记的多肽序列(DBCO-peptide:5ᶄ-HHHHHHAAA-DBCO-3ᶄ),上海生工生物工程有限公司㊂其他实验常用试剂均为分析纯㊂1ˑTE缓冲液(pH=8.0):由10mmol/L Tris-HCl与1.0mmol/L EDTA混合配制,用于溶解和保存寡核苷酸;PBS缓冲液(pH=7.4):由0.1mol/L KCl㊁0.1mol/L Na2HPO4与0.1mol/L NaH2PO4混合配制㊂1.2㊀主要仪器与设备CHI660e型电化学工作站,上海辰华仪器有限公司;三电极体系(由玻碳电极㊁铂丝电极和Ag/ AgCl电极组成),上海辰华仪器有限公司;ME204/ 02型电子分析天平,上海梅特勒-托利多仪器有限公司;KQ5200DE型超声波清洗器,昆山市超声仪器有限公司;PHS-3C型酸度计,上海仪电科学仪器股份有限公司;Sub Cell GT型核酸电泳仪,伯乐生命医学产品有限公司;Image Lab4.0型凝胶成像系统,美国Bio Rad公司㊂1.3㊀实验方法1.3.1㊀Apt+TP+N3-G4复合探针的制备㊀分别取5μL浓度均为200μmol/L的Apt㊁TP和N3-G4混合于485μL的1ˑTE缓冲液中进行退火杂交,即得Apt+TP+N3-G4复合探针㊂1.3.2㊀电化学适配体传感器的构建与工作原理㊀图1为基于改进G4DNAzyme的电化学适配体传感器的构建及其工作原理㊂由图1可知,首先设㊃36㊃㊀2023年12月第38卷第6期㊀㊀㊀㊀图1㊀基于改进G4DNAzyme电化学适配体传感器的构建及其工作原理示意图Fig.1㊀Schematic diagram of the fabrication of the electrochemical aptasensorbased on the improved G4DNAzyme and its working principle计1条包含立足点(toehold)区域的单链DNA模板(TP),使其能够部分杂交抗生素Apt和N3-G4,以形成稳定的Apt+TP+N3-G4复合探针;然后进行玻碳电极(GCE)预处理,用氧化铝抛光粉(0.5μm)对GCE进行打磨,用水和乙醇超声清洗以除去残留铝粉,于室温下晾干,备用;再将GCE置于HAuCl4中进行电化学沉积实验(沉积电位为-0.2V,时间为30s)得到AuNPs/GCE电极;于4ħ条件下用CP(2μmol/L,10μL)孵育该电极表面16h,得到CP/AuNPs/GCE电极;最后用MCH(1mmol/L,10μL)封闭电极表面剩余的活性位点,即得MCH/CP/AuNPs/GCE电极㊂传感器的工作原理如下:当目标物KANA存在时,KANA与Apt+TP+N3-G4复合探针中的Apt进行特异性结合,导致toehold区域的暴露;引入AP后,AP与toehold序列开始进行杂交,通过链置换反应置换出N3-G4;释放出的N3-G4与电极表面的CP杂交而被固定至MCH/CP/AuNPs/GCE电极上;将DBCO-peptide孵育至电极后,peptide末端修饰的DBCO与G4末端的N3发生点击化学反应,使pep-tide与G4共价组装,从而在K+和Hemin存在下形成G4DNAzyme-peptide复合物㊂Hemin具有较强的氧化还原活性,可以提供电化学信号,DNAzyme-peptide催化底物H2O2则可进一步放大电化学信号,从而实现对KANA的高灵敏检测㊂1.3.3㊀凝胶电泳实验㊀凝胶样品的制备:分别将5μL浓度为5μmol/L的Apt㊁TP㊁N3-G4㊁Apt+TP+N3-G4㊁Apt+TP㊁TP+N3-G4于95ħ水浴锅中加热5min;于25ħ金属振荡器中振荡2h;采用1ˑTBE配制12%非变性聚丙烯酰胺凝胶㊂每份样品取10μL,将其与2μL6ˑ上样缓冲液混合,之后转移到凝胶电泳系统中,在120V恒定电压下电泳70min,并用1%的Gel Red染色液染色30min;使用凝胶成像系统成像㊂1.3.4㊀电化学测量方法㊀利用循环伏安(CV)法,在含有5mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]的PBS缓冲液中对电化学适配体传感器的制备过程进行表征㊂其中,扫描速率为50mV/s,电位范围为-0.2~0.7V㊂采用差分脉冲(DPV)法测量电化学适配体传感器对卡那霉素检测的响应性能,扫描电位范围为0.1~-0.6V,振幅为0.05V,脉冲宽度为0.05s,采㊃46㊃㊀伍永梅,等:基于改进G-四链体DNA酶构建电化学适配体传感器高灵敏检测卡那霉素样宽度为0.0167s㊂采用CV法在含有5mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4 [Fe(CN)6]的PBS(pH=7.4,0.1mol/L)缓冲液中,考查不同浓度CP(0.2μmol/L㊁0.5μmol/L㊁1.0μmol/L㊁1.5μmol/L㊁2.0μmol/L㊁2.5μmol/L)对电流信号的影响㊂为了考查电化学适配体传感器的选择性,在相同条件下,将该传感器应用于同类抗生素妥布霉素(TOB,50nmol/L)和链霉素(STR,50nmol/L),非同类抗生素四环素(TET,50nmol/L)及KANK与上述抗生素的混合物(KANA+Mixture)的检测,采用差分脉冲(DPV)法考查传感器对不同抗生素的响应性能㊂1.3.5㊀KANA的检测㊀将10μL不同浓度的KA-NA目标物(0pmol/L㊁0.06pmol/L㊁0.10pmol/L㊁2.00pmol/L㊁2.00ˑ102pmol/L㊁2.00ˑ103pmol/L㊁2.00ˑ104pmol/L)与10μL Apt+TP+N3-G4(2μmol/L)复合探针进行混合,于37ħ恒温摇床中孵育90min㊂加入10μL AP(1μmol/L),继续孵育30min,得到含有N3-G4的混合溶液㊂将混合溶液孵育至MCH/CP/AuNPs/GCE电极上,接着滴涂5μL的DBCO-peptide(1μmol/L)㊂将所得电化学适配体传感器置于含有H2O2(2mmol/L)的PBS缓冲液中进行检测㊂检测限LOD的计算公式为3δ/k,其中,δ为3个空白样品的标准差,k为标准曲线的斜率㊂1.3.6㊀加标回收实验㊀为了验证电化学适配体传感器在食品中抗生素的检测能力,在牛奶样品中加入不同浓度梯度(1.0ˑ10-4nmol/L㊁2.0ˑ10-3nmol/L㊁0.2nmol/L㊁2.0nmol/L㊁5.0nmol/L)的KANA进行加标回收实验㊂1.4㊀数据处理所有实验均重复3次,通过Origin2019软件绘制图表,使用Adobe Photoshop CS6绘制传感器的工作原理图㊂2㊀结果与讨论2.1㊀凝胶电泳实验结果分析为验证Apt+TP+N3-G4复合探针的成功制备与目标物诱发的链置换反应,进行了聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)实验,结果见图2㊂其中,M为DNA标准参照物的电泳条带,泳道1㊁泳道2和泳道3分别为TP㊁Apt和N3-G4的电泳条带,泳道4是Apt+TP+ N3-G4复合探针的电泳条带,泳道5是将KANA与Apt+TP+N3-G4复合探针孵育后的电泳条带㊂由图2可知,泳道4上方有一条明亮清晰的条带,滞后于泳道1㊁泳道2和泳道3的条带,说明Apt+TP+N3-G4复合探针成功制备;泳道5上方出现一条亮带,下方出现一条暗带,证明KANA可以特异性结合Apt+TP+N3-G4复合探针中的Apt,使Apt从复合探针中释放,导致toehold区域暴露,进一步引发后续的链置换反应㊂图2㊀12%非变性PAGE图Fig.2㊀12%non-denatured polyacrylamidegel electrophoresis(PAGE)2.2㊀适配体传感器的电化学表征图3为适配体传感器的CV曲线,其中a为裸玻碳电极(GCE),b为AuNPs/GCE,c为CP/ AuNPs/GCE,d为MCH/CP/AuNPs/GCE,e为N3-G4/MCH/CP/AuNPs/GCE,f为DBCO-peptide/N3-G4/MCH/CP/AuNPs/GCE㊂由图3可知,在裸玻碳电极上可以观察到[Fe(CN)6]3-/4-电子对的特征氧化还原峰(a曲线);将AuNPs沉积于裸玻碳电极,由于AuNPs能够促进电子传输,CV响应电流值有所增加(b曲线);当CP被固定在AuNPs/GCE电极表面时,由于磷酸骨架带负电荷,对[Fe(CN)6]3-/4-起排斥作用,峰电流显著降低(c曲线);用MCH封㊃56㊃㊀2023年12月第38卷第6期㊀闭CP/AuNPs/GCE电极后,又因MCH是电惰性小分子,峰电流再次降低(d曲线);当卡那霉素目标物与Apt+TP+N3-G4复合探针中的适配体发生特异性识别后,释放的N3-G4通过碱基互补配对原则与CP进行杂交,从而被组装至MCH/CP/AuNPs/GCE电极表面,导致电极表面负电荷磷酸骨架数量的增多,使峰电流再次降低(e曲线);在N3-G4/MCH/CP/AuNPs/GCE电极上孵育DBCO-peptide后,由于探针上的磷酸骨架和多肽都会阻止电极表面的电子传递,导致峰电流进一步降低(f曲线)㊂图3㊀适配体传感器的CV曲线Fig.3㊀Cyclic voltammetry curves of thestepwise modified electrodes2.3㊀适配体传感器的电化学性能分析采用DPV法考查不同适配体传感器在含有H2O2(2mmol/L)的PBS(pH=7.4)中的电化学响应性能,以验证实验方案的可行性,结果如图4所示㊂由图4a)可知,适配体传感器在未孵育抗生素时,由于传感器界面缺乏电活性物质,因此没有观察到明显的电流信号㊂当将抗生素(5nmol/L,10μL)孵育至传感器后,产生了显著的电流信号,这是由于抗生素可以和Apt+TP+N3-G4复合探针中的适配体(Apt)进行特异性识别,导致N3-G4的释放,而释放的N3-G4通过与传感器表面的CP进行杂交,并与Hemin进一步结合,从而将电化学活性物质Hemin捕获至传感器的界面上,这也证明了传感器对抗生素具有良好的响应性能㊂由图4b)可知,传感器在无Peptide时产生的电流信号较小,与之相比,将Peptide引入传感器系统后,电流信号显著增强,证明多肽能显著增强传感器对抗生素的响应电流,大大提高抗生素检测的灵敏度㊂2.4㊀电极表面CP浓度的优化电极表面CP浓度的优化结果如图5所示㊂由图5可知,随着CP浓度的增加,AuNPs/GCE电极的电流信号先降低后逐渐趋于平稳,这是因为CP的负电荷磷酸骨架会对[Fe(CN)6]3-/4-产生电子排斥现象,从而使响应电流下降㊂当CP浓度超过2.0μmol/L时,电流信号基本保持不变,所以CP的适宜浓度为2.0μmol/L㊂2.5㊀适配体传感器对KANA的响应性能图6为适配体传感器对不同浓度KANA的电化学响应图,其中a g分别对应KANA浓度㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀图4㊀不同适配体传感器在含有H2O2的PBS中的电流响应Fig.4㊀Current responses of different aptasensorsin PBS containing H2O2图5㊀CP浓度对电流信号强度的影响Fig.5㊀Effect of capture probe concentrationon current intensity ㊃66㊃㊀伍永梅,等:基于改进G -四链体DNA 酶构建电化学适配体传感器高灵敏检测卡那霉素0pmol /L㊁0.06pmol /L㊁0.10pmol /L㊁2.00pmol /L㊁2.00ˑ102pmol /L㊁2.00ˑ103pmol /L㊁2.00ˑ104pmol /L㊂由图6可知,随着KANA 浓度的提高,峰电流强度越来越大,表明释放的N 3-G4不断增加,使电极表面Hemin 的固载量增加,电流信号不断增强㊂图7为KANA 浓度对数值与电流信号强度间的线性关系图㊂由图7可知,KANA 浓度对数值与电流信号强度具有良好的线性关系,线性回归方程㊀㊀图6㊀电化学适配体传感器对不同浓度KANA 的DPV 响应曲线Fig.6㊀DPV response curves of the aptasensorto different concentrations of KANA图7㊀KANA 浓度对数值与电流信号强度间的线性关系图Fig.7㊀The linear relationship between the logarithm of KANA concentration and the current signal strength为Ι=-1.5910lg c -13.5742,线性相关系数R 2=0.9956,检测限(LOD )为0.02pmol /L㊂表1为本文方法与其他KANA 检测方法的分析对比结果㊂由表1可知,与其他KANA 检测方法相比,本文方法的LOD 更低,这说明所构建的电化学适配体传感器有望成为一种高灵敏检测食品中抗生素残留的新方法㊂2.6㊀电化学适配体传感器的选择性图8为电化学适配体传感器对不同抗生素电化学响应结果㊂由图8可知,KANA 存在时电化学适配体传感器产生了明显的电化学信号,而在干扰物TOB㊁STR 和TET 中,电化学信号微乎其微㊂然而,当这些干扰物与KANA 共存时,与单独存在的KANA 相比,电化学信号没有明显的变化㊂以上结果表明,该适配体传感器对检测KANA 具有良好的选择性,这归因于适配体对KANA 的特异性识别作用㊂2.7㊀电化学适配体传感器在实际样品中的验证试验㊀㊀牛奶样品中KANA 的加标回收实验结果见表2㊂由表2可知,该方法在牛奶中的加标回收率为97.1%~105.5%,相对标准差(RSD )为3.60%~5.74%,表明该电化学适配体传感器适用于牛奶中KANA 的检测㊂表3为该电化学适配体传感器与ELISA 法测定牛奶样品中KANA 的对比实验结果㊂由表3可知,两种方法的相对偏差为-3.90%~2.83%,表明本方法与ELISA 法结果相一致,说明该电化学适配体传感器能够实现牛奶中KANA 的快速准确检测㊂表1㊀本文方法与其他KANA 检测方法的分析对比结果Table 1㊀The analysis performance of this method is compared with other KANA detection methods检测方法检测范围/(nmol ㊃L -1)检测限/(nmol ㊃L -1)LOD 计算方法表面等离子体共振法[17]103~1052.85ˑ105LOD =Ī0+3δ比色法[18]0.85ˑ10-3~0.0340.34ˑ10-3LOD =3δ/k 荧光法[19] 1.0~80.00.29LOD =3δ/k 光电化学法[20]0.2~250.00.2LOD =3δ/k 电化学法[8]10-3~1030.5ˑ10-3LOD =3δ/k 电化学法[21]0.01~1038.4ˑ10-3LOD =3δ/k 本文所用电化学法0.06ˑ10-3~200.02ˑ10-3LOD =3δ/k㊀注:Ī0表示空白产生的信号平均值㊂㊃76㊃㊀2023年12月第38卷第6期㊀图8㊀适配体传感器的选择性Fig.8㊀The selectivity of aptasensor表2㊀牛奶样品中KANA的加标回收实验结果Table2㊀Sample labeling recovery experiment样品号KANA的加入浓度/(nmol㊃L-1)KANA的检测浓度/(nmol㊃L-1)RSD/%加标回收率/%1 1.0ˑ10-4 1.011ˑ10-4 3.60101.12 2.0ˑ10-3 1.980ˑ10-3 4.4899.030.20.197 3.7698.54 2.0 1.942 5.7497.15 5.0 5.275 5.19105.5表3㊀电化学适配体传感器与ELISA法测定牛奶样品中KANA的对比实验结果Table3㊀Comparison experimental results of theaptasensor and ELISA method for determiningKANA in milk nmol/L样品号电化学适配体传感器ELISA法相对偏差/%1 1.011ˑ10-49.87ˑ10-5 2.432 1.980ˑ10-3 2.01ˑ10-3-1.4930.1970.205-3.904 1.942 1.992-2.515 5.275 5.130 2.833㊀结论本文将Peptide与G4DNAzyme共价组装得到高活性的DNAzyme-peptide复合物,以Hemin为电子媒介体成功构建了一种新型电化学适配体传感器,采用DPV法考查该传感器的电化学响应性能,并将其用于牛奶中KANA的检测分析㊂结果表明:与传统的G4DNAzyme相比,G4DNAzyme-peptide的催化性能明显增强,可以显著提高传感器的灵敏度;在CP最优浓度(2.0μmol/L)下,该传感器用于KANA检测时呈现较宽的检测范围(0.06pmol/L~20nmol/L)和较低的检测限(0.02pmol/L),优于其他KANA检测方法;该传感器对KANA具有良好的选择性,用于牛奶实际样品分析时,加标回收率为97.1%~105.5%,RSD为3.60%~5.74%,且检测结果与ELISA法相一致㊂因此,所构建的电化学适配体传感器在实际食品安全检测中具有良好的实用性,为抗生素残留检测提供了一种新方法㊂参考文献:[1]㊀ZHAO T T,CHEN Q,WEN Y L,et al.A competitive col-orimetric aptasensor for simple and sensitive detection ofkanamycin based on terminal deoxynucleotidyl transfer-ase-mediated signal amplification strategy[J].FoodChemistry,2022,377:132072.[2]㊀程岁寒,潘存锋,张彦.高效液相色谱法在兽用抗生素残留分析中的应用[J].国外医药(抗生素分册),2019,40(1):27-41.[3]㊀陈燕,李康柏,许均图,等.液相色谱串联质谱法检测水产品中17种抗生素残留量[J].现代食品,2021(9):201-204.[4]㊀李兴华,苗俊杰,康凯,等.固相萃取-高效毛细管电泳法同时分离测定水体和土壤中13种抗生素[J].理化检验(化学分册),2019,55(7):769-777.[5]㊀LI R,WEN Y,YANG L,et al.Development of an enzyme-linked immunosorbent assay based on viral antigen cap-ture by anti-spike glycoprotein monoclonal antibody fordetecting immunoglobulin a antibodies against porcine ep-idemic diarrhea virus in milk[J].BMC VeterinaryResearch,2023,19(1):1-11.[6]㊀杨亚琴,冯书惠,胡永建,等.气相色谱-质谱法测定绿茶中草甘膦和氨甲基膦酸残留量[J].茶叶科学,2020,40(1):125-132.[7]㊀YU M K,XIE Y,WANG X Y,et al.Highly water-stabledye@Ln-MOFs for sensitive and selective detectiontoward antibiotics in water[J].ACS Applied Materialsand Interfaces,2019,11(23):21201-21210.[8]㊀TIAN L,ZHANG Y,WANG L B,et al.Ratiometric dualsignal-enhancing-based electrochemical biosensor forultrasensitive kanamycin detection[J].ACS AppliedMaterials and Interfaces,2020,12(47):52713-52720.[9]㊀ZHOU C,ZOU H M,SUN C,et al.Recent advances inbiosensors for antibiotic detection:Selectivity and signalamplification with nanomaterials[J].Food Chemistry,2021,361(3):130109.[10]HUANG W,ZHOU Y,ZHAN D Y,et al.Homogeneousbiorecognition reaction-induced assembly of DNA nano-structures for ultrasensitive electrochemical detection of ㊃86㊃㊀伍永梅,等:基于改进G-四链体DNA酶构建电化学适配体传感器高灵敏检测卡那霉素kanamycin antibiotic[J].Analytica Chimica Acta,2021,1154:338317.[11]LI M X,CHENG J,YUAN Z Y,et al.Sensitive electro-chemical detection of microRNA based on DNA walkersand hyperbranched HCR-DNAzyme cascade signal ampli-fication strategy[J].Sensors and Actuators B:Chemical,2021,345:130348.[12]LEI C,JLABC F,CHEN C D,et al.Dual-signal amplifica-tion electrochemical sensing for the sensitive detection ofuranyl ion based on gold nanoparticles and hybridizationchain reaction-assisted synthesis of silver nanoclusters[J].Analytica Chimica Acta,2021,1184:338986. 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[21]WANG L N,ZHANG L,YU Y,et al.DNA cyclic assemb-ling control in an electrochemical strategy with MoS2@AuNPs for determination of kanamycin[J].MicrochimicaActa,2021,188(8):1-9.Construction of electrochemical aptasensor for highly sensitive detection of kanamycin based on the improved G-quadruplex DNAzymeWU Yongmei1,2,3,ZHU Xiaoqian1,FANG Jiao1,BAI Yanhong1,2,31.College of Food and Bioengineering,Zhengzhou University of Light Industry,Zhengzhou450001,China;2.Henan Key Laboratory of Cold Chain Food Quality and Safety Control,Zhengzhou450001,China;3.Collaborative Innovation Center of Food Production and Safety of Henan Province,Zhengzhou450001,China Abstract:A highly active G4DNAzyme-peptide complex obtained by covalent assembly of cationic peptide on G4 DNAzyme was used to construct a novel electrochemical aptasensor.The effect of complex on the performance of electrochemical aptasensor was investigated and the proposed aptasensor was used to detect kanamycin(KANA)in milk.The experimental results indicated that G4DNAzyme-peptide could significantly amplify the electrochemical signal and greatly improve the detection sensitivity of aptasensor.Under the optimal concentration of capture probe (CP,2.0μmol/L),the change of current intensity showed a good linear relationship with the logarithm of the target concentration in the range of0.06pmol/L~20nmol/L,and the detection limit was0.02pmol/L,which was superior to other KANA detection methods.The aptasensor showed better selectivity and lower detection limit and the recoveries obtained in milk sample were from97.1%to105.5%and the relative standard deviation were from 3.60%to5.74%.The experimental results were consistent with ELISA method,indicating the proposed aptasensor could achieve high sensitivity for the detection of KANA in milk.Key words:G-quadruplex DNAzyme;electrochemical aptasensor;kanamycin;high sensitivity㊀(责任编辑:王晓波)㊃96㊃。

构建 G4-DNAzyme 比色生物传感器检测肿瘤标志物miRNA-21的研究doi:10.3969/j.issn.1674-7100.2019.03.006收稿日期：2019-03-10基金项目：国家自然科学基金资助项目（21705043，51774128），湖南省教育厅科研基金资助项目（17A055），中国包装 联合会“绿色包装与安全”专项研究基金资助项目（2017ZBLY14）作者简介：汤 力（1988-），男，湖南张家界人，湖南工业大学博士生，主要研究方向为功能材料， E-mail ：308926207@通信作者：龚 亮（1987-），女，湖南双峰人，湖南工业大学讲师，博士，主要从事荧光探针与生物传感方面的研究， E-mail ：gl569940808@汤 力 文崇程龚 亮 汤建新湖南工业大学生命科学与化学学院湖南 株洲 412007摘　要：miRNA -21在大部分肿瘤中都存在高表达，其含量的异常可作为肿瘤发生的早期诊断标志。

基于G -四链体-hemin DNAzyme 能催化H 2O 2氧化2, 2’-联氨双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（ABTS ）生成ABTS +，利用链的竞争作用构建了G4-DNAzyme 比色生物传感器，该传感器检测miRNA -21时具有操作简单、响应快速的特点。

在优化核酸序列设计、反应温度、反应时间等实验条件的基础上，利用紫外分光光度计测量ABTS +的最大吸光度，并计算其与空白样品的信背比（SBR ），在不同浓度的miRNA -21下，绘制浓度-SBR 曲线。

结果显示：实验可检测miRNA -21的最低浓度约为0.1 µmol/L ；在miRNA -21浓度为0.1~1.2 µmol/L 时，SBR 与miRNA -21的浓度呈现出良好的线性关系，其线性方程为：y =0.834 9x +0.898 3，相关系数R 2=0.995。

基于G-四链体-氯血红素DNA酶的传感器对血清中甲胎蛋白的检测孙艳丽【摘要】建立了一种夹心式用于检测血清中甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)的新型传感器.利用微孔板表面羧基与抗体表面的氨基之间的相互作用,将AFP的单克隆抗体(monoclonal antibodies,McAbs)修饰到微孔板的表面;再利用抗体抗原的定向固定效应,将AFP键合到McAbs的表面,接着将生物素标记的AFP单克隆抗体(biotinylated McAbs)与AFP结合;最后,利用链霉亲和素(streptavidin,SA)与生物素的特异性结合作用,将G-四链体-氯血红素DNA酶键合到生物素标记的单克隆抗体上,从而制得高灵度、高特异性的AFP传感器.用2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)-H2 O2体系检测AFP的浓度,信号值与AFP的浓度在0.05 ng·mL-1至20 ng·mL-1之间成线性关系,检测限为0.02 ng· mL-1.此传感器可应用于血清中AFP的检测.【期刊名称】《科学技术与工程》【年(卷),期】2014(014)014【总页数】5页(P5-9)【关键词】G-四链体-氯血红素DNA酶;甲胎蛋白(AFP);免疫传感器【作者】孙艳丽【作者单位】菏泽学院化学化工系,荷泽274015【正文语种】中文【中图分类】O657.32甲胎蛋白(alpha-fetoprotein, AFP)是一种胚胎蛋白，主要来自胚胎的肝细胞，健康成人体内甲胎蛋白的含量一般不超过20 μg·L-1。

但在肝癌、卵巢癌、胚胎细胞肿瘤患者的血清中甲胎蛋白的含量会明显升高，因此血清中AFP的准确检测对某些癌症尤其是原发性肝癌的早期诊断、早期治疗有重要的临床意义[1—3]。

G-四链体(G-quadruplexes)是一类富含鸟嘌呤的特殊DNA二级结构，作为重要的DNA调控结构，存在于人类基因组许多重要的区域[4—6]。

血红素/Ｇ￣四链体ＤＮＡ酶的活性增强研究及其在生物传感器中的应用进展莫艳红ａꎬｂ㊀李㊀晖ｂ㊀王㊀彬ｂ㊀徐晓慧ｂ㊀刘思思ｂ㊀曾冬冬ｂ∗(ａ上海理工大学医疗器械与食品学院㊀上海２０００９３ꎻｂ上海健康医学院㊀上海２０１３１８)摘㊀要㊀血红素/Ｇ￣四链体ＤＮＡ酶是一类具有类过氧化物酶活性的ＤＮＡ分子ꎬ因其具有出色的活性㊁易修饰性和可编程性ꎬ被广泛应用于生物传感器等领域ꎮ本文先是简要介绍了Ｇ￣四链体的结构ꎬ再主要综述了增强血红素/Ｇ￣四链体ＤＮＡ酶活性的策略及基于血红素/Ｇ￣四链体ＤＮＡ酶的生物传感器在生物标志物㊁微生物与生物毒素以及金属离子检测中的应用ꎬ并展望了血红素/Ｇ￣四链体ＤＮＡ酶的未来发展趋势ꎮ关键词㊀血红素/Ｇ￣四链体ꎻＤＮＡ酶ꎻ过氧化物酶ꎻ生物传感器中图分类号:Ｏ６５７㊀㊀㊀㊀㊀文献标识码:Ａ㊀㊀㊀㊀㊀文章编号:１０００￣０５１８(２０２０)１１￣１２４９￣１３ＤＯＩ:１０.１１９４４/ｊ.ｉｓｓｎ.１０００￣０５１８.２０２０.１１.２００１５３２０２０￣０５￣２１收稿ꎬ２０２０￣０６￣１９修回ꎬ２０２０￣０７￣０８接受上海市自然科学基金(１９ＺＲ１４７４３００)和上海市分子影像学重点实验室建设(１８ＤＺ２２６０４００)项目资助通讯联系人:曾冬冬ꎬ副研究员ꎻＴｅｌ:０２１￣６５８８３１５０ꎻＦａｘ:０２１￣６５８８１７３７ꎻＥ￣ｍａｉｌ:ｚｅｎｇｄｄ＠ｓｕｍｈｓ.ｅｄｕ.ｃｎꎻ研究方向:纳米材料与生物传感器天然过氧化物酶是一种以铁卟啉血红素为辅基ꎬ参与生命体内生理代谢的生物大分子ꎮ生物传感器是一种对生物物质敏感并利用适当的理化换能器将其浓度转换为颜色㊁光㊁电等信号进行检测的新型传感器ꎬ与传统检测方法相比ꎬ具有简便㊁灵敏㊁快速等优点ꎮ天然过氧化物酶可通过催化底物氧化ꎬ如过氧化氢(Ｈ２Ｏ２)ꎬ使生物传感器产生颜色变化信号㊁电信号或化学发光信号ꎬ从而实现对分析物的检测ꎮ并因其固有的催化活性和与底物结合的特异性ꎬ与其它生物传感器相比ꎬ基于天然过氧化物酶开发的生物传感器具有灵敏度高的特性ꎬ这也使其被广泛地应用于生物传感器领域ꎮ然而天然过氧化物酶对存储条件要求苛刻㊁提取和纯化的过程复杂㊁成本昂贵ꎬ且在恶劣的实验环境下存在不稳定㊁易失活的问题ꎬ这些问题也限制了天然过氧化物酶更广泛的应用[１]ꎮ因此ꎬ研究者们开始致力于设计一种易于合成㊁价格低廉㊁性能稳定且具有过氧化物酶样活性的非蛋白质分子化合物ꎬ用作过氧化物模拟酶ꎮ血红素/Ｇ￣四链体ＤＮＡ酶(Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅ)便是其中一类过氧化物模拟酶ꎬ因具有易于合成㊁价格低廉㊁性能稳定等特性得到了研究人员们的广泛关注ꎮ１９９４年ꎬＢｒｅａｋｅｒ等[２]利用体外筛选技术首次合成了ＤＮＡ酶(ＤＮＡｚｙｍｅ)ꎬ它能催化依赖铅离子(Ｐｂ２＋)的ＲＮＡ磷酸酯裂解ꎬ从而进行快速的反应ꎮ随后ꎬＴｒａｖａｓｃｉｏ等[３]报道了ＤＮＡ适配体￣血红素复合物具有增强的过氧化物酶活性ꎮ血红素(Ｈｅｍｉｎ)是多种酶的活性辅助因子ꎬ包括过氧化物酶ꎬ具有低的内在过氧化物酶活性ꎮ在金属离子的存在下ꎬ由体外筛选技术筛选的富含鸟嘌呤(Ｇ)的单链短序ＤＮＡꎬ可通过分子内Ｇ￣四链体(Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ)的形成与血红素紧密结合ꎬ从而形成一种血红素/ＤＮＡ复合物ꎬ该复合物即Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅꎬ其过氧化物酶活性明显高于单独的血红素ꎮ也因其具有比天然过氧化物酶更好的热稳定性和生物相容性ꎬ且可编程㊁易修饰以及可通过聚合酶链式反应(ＰＣＲ)容易地合成而被广泛应用于生物传感器领域ꎮ在这篇综述中ꎬ讨论了Ｇ￣四链体的结构与特点ꎬ增强Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅ活性的策略及基于Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅ开发的生物传感器在生物标志物㊁微生物与生物毒素以及金属离子检测中的应用ꎮ１㊀Ｇ￣四链体的结构与特点Ｇ￣四链体在１９６２年由Ｇｅｌｌｅｒｔ等[４]首次发现ꎬ是富含Ｇ的ＤＮＡ链在Ｋ＋㊁Ｎａ＋或ＮＨ＋４等离子的存在第３７卷第１１期应用化学Ｖｏｌ.３７Ｉｓｓ.１１２０２０年１１月㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀ＣＨＩＮＥＳＥＪＯＵＲＮＡＬＯＦＡＰＰＬＩＥＤＣＨＥＭＩＳＴＲＹ㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀Ｎｏｖ.２０２０下折叠成的平行或反向平行的四分体结构ꎬ利用在单链间或单链内对应的Ｇ残基之间形成的Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ型碱基对堆叠排列而成ꎮＧ￣四链体由１㊁２或４个ＤＮＡ分子组成ꎬ其具有许多不同的拓扑结构ꎬ如分子间的四链四链体(图１ａ)㊁分子间的双链四链体(图１ｂ－１ｄ)和分子内的单链四链体(图１ｅ－１ｈ)ꎬ这取决于富含Ｇ的ＤＮＡ链的数量和方向ꎮＧ￣四链体可以与Ｈｅｍｉｎ嵌合形成具有类过氧化物酶活性的Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅꎬ其表现出来的类过氧化物酶活性受Ｇ￣四链体结构的影响ꎮＣｈｅｎｇ等[５]研究了平行㊁反平行和混合的反平行/平行Ｇ￣四链体结构的类过氧化物酶活性ꎬ发现分子内平行的Ｇ￣四链体结构具有很强的类过氧化物酶活性ꎬ而分子内反平行的Ｇ￣四链体结构的活性非常弱ꎬ分子间平行的Ｇ￣四链体结构也仅显示出较弱的类过氧化物酶活性ꎬ这是因为分子内平行的Ｇ￣四链体结构有利于血红素的末端堆积ꎮ随后ꎬＫｏｎｇ等[６￣７]的研究工作表明了Ｇ￣四链体的形成是决定Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅ是否具有类过氧化物酶活性的关键因素ꎬ也再次表明了血红素和平行的Ｇ￣四链体形成的复合物具有比由血红素和反平行形成的复合物高得多的类过氧化物酶活性ꎬ血红素的存在还可以促进一些Ｇ￣四链体从反平行结构向平行结构的转化ꎮＣｈｅｎｇ等[８]的研究表明ꎬ３个Ｇ￣四链环的顺序在Ｇ￣四链体的拓扑构象的形成中起着重要的作用ꎬ环是两个相邻Ｇ区域之间的序列ꎮ合适的环转位可以通过增加Ｇ￣四链体与血红素结合亲和力来增强Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅ的类过氧化物酶活性ꎮＧ￣四链体的拓扑结构还受溶液中阳离子的影响ꎬ在Ｋ＋的存在下形成的Ｇ￣四链体结构主要为平行的Ｇ￣四链体ꎬ在Ｎａ＋的存在下主要形成反平行的Ｇ￣四链体结构ꎬ而某些情况下ꎬ在ＮＨ＋４的存在下形成的Ｇ￣四链体结构表现出最强的类过氧化物酶活性ꎬ这是因为ＮＨ＋４稳定的Ｇ￣四链体具有较高的抗自由基产物降解的能力[９￣１０]ꎮ这些工作为设计出具有更高类过氧化物酶活性的新型Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅ和寻找出此类ＤＮＡｚｙｍｅ的新用途提供了巨大的帮助ꎮ图１㊀不同类型的Ｇ￣四链体的示意图ꎬ(ａ)分子间平行的四链四链体ꎻ(ｂ)分子间平行的双链四链体ꎻ(ｃ和ｄ)分子间反平行的双链四链体ꎻ(ｅ)分子内平行的单链四链体ꎻ(ｆ和ｇ)分子内反平行的单链四链体ꎻ(ｈ)分子内混合平行的四链体[６]ꎮ(箭头代表核苷酸链从５ᶄ－３ᶄ的走向)Ｆｉｇ.１㊀ＳｃｈｅｍａｔｉｃｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｙｐｅｓｏｆＧ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ.(ａ)ｉｎｔｅｒｍｏｌｅｃｕｌａｒｆｏｕｒ￣ｓｔｒａｎｄｅｄｐａｒａｌｌｅｌｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ.(ｂ)ｉｎｔｅｒｍｏｌｅｃｕｌａｒｔｗｏ￣ｓｔｒａｎｄｅｄｐａｒａｌｌｅｌｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ.(ｃａｎｄｄ)ｉｎｔｅｒｍｏｌｅｃｕｌａｒｔｗｏ￣ｓｔｒａｎｄｅｄａｎｔｉｐａｒａｌｌｅｌｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ.(ｅ)ｕｎｉｍｏｌｅｃｕｌａｒｐａｒａｌｌｅｌｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ.(ｆａｎｄｇ)ｕｎｉｍｏｌｅｃｕｌａｒａｎｔｉｐａｒａｌｌｅｌｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ.(ｈ)ｕｎｉｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｉｘｅｄ￣ｐａｒａｌｌｅｌｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ[６].(ａｒｒｏｗｓｉｎｄｉｃａｔｅ５ᶄ－３ᶄｐｏｌａｒｉｔｙ)２㊀增强血红素/Ｇ￣四链体ＤＮＡ酶活性的策略虽然开发的Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅꎬ与天然酶相比ꎬ具有稳定性好㊁对环境不敏感和制备成本低等优点ꎬ但它的催化活性仍不能令人满意ꎮ近年来ꎬ研究人员们开发了许多有效的策略来增强Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅ的活性ꎬ主要包括添加外源性酶增强剂㊁对ＤＮＡ序列进行修饰以及对血红素/Ｇ￣四链体ＤＮＡ酶进行修饰ꎮ２.１㊀添加外源性酶增强剂如上所述ꎬＨｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅ的类过氧化物酶活性受溶液中所含阳离子的影响ꎬ此外ꎬ研究人员们还发现添加某些外源性酶增强剂可增强Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅ的活性ꎮＫｏｎｇ等[１１]研究了腺嘌呤核苷三磷酸(ＡＴＰ)对Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅ所介导的反应的影响ꎬ结果表明ＡＴＰ起积极作用且抑制了ＡＢＴＳ ＋(３￣乙基苯并噻唑啉￣６￣磺酸)的歧化ꎬ添加２ｍｍｏｌ/ＬＡＴＰ后ꎬ富含Ｇ的ＤＮＡ序列对血红素的亲和力提高了近２ ５倍ꎬ随后ꎬＳｔｅｆａｎ等[１２]深入研究了ＡＴＰ增强Ｈｅｍｉｎ/０５２１应用化学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第３７卷㊀Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅ催化活性的机理ꎬ发现ＡＴＰ是作为稳定剂ꎬ稳定了血红素㊁血红素/Ｇ￣四链体复合物和氧化产生的自由基阳离子ꎬ从而提高了催化的整体效率ꎮＳｔｅｆａｎ等[１３]还发现用类似ＤＯＴＡ(１ꎬ４ꎬ７ꎬ１０￣四(羧甲基)￣１ꎬ４ꎬ７ꎬ１０￣四氮杂环十二烷)大环的模板合成的Ｇ￣四分体也对Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅ的催化活性起增强作用ꎬ将其用于检测可将检测方法的灵敏度提高８倍ꎮＱｉ等[１４]报告ꎬ生物多胺(精胺(Ｃ１０Ｈ２６Ｎ４)㊁亚精胺(Ｃ７Ｈ１９Ｎ３)和腐胺(Ｃ４Ｈ１２Ｎ２))对Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅ的类过氧化物酶活性均有积极影响ꎬ其中精胺表现出最强的增强作用ꎬ可使Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅ的催化活性增强３ ６~６倍ꎬ这是因为精胺不仅保护血红素不受过氧化氢(Ｈ２Ｏ２)的快速降解ꎬ还可以将Ｇ￣四链体浓缩成有序的微聚集体ꎬ并为催化反应提供有利的微环境ꎮ虽然添加外源性酶增强剂能一定程度上增强Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅ的催化活性ꎬ但添加的酶增强剂通常为高浓度的ꎬ且可能不适合受这些增强剂影响的催化或分析的应用ꎮ２.２㊀对ＤＮＡ序列进行修饰Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅ的催化活性还受形成Ｇ￣四链体的ＤＮＡ序列的影响ꎮＬｉ等[１５]将ＤＮＡ双链体结构掺入Ｇ￣四链体中适当的位点提高了酶的活性ꎬ这归因于该策略赋予其较高的与血红素结合的亲和力ꎬ具有四链/双链体结构的抗血栓性寡核苷酸与血红素结合的亲和力通常比没有双链体结构的Ｇ￣四链体结构高４~１０倍ꎮＫｏｎｇ等[６]发现在ＴｎＧ４Ｔｍ序列的５ᶄ末端添加胸腺嘧啶(Ｔ)核苷酸可增强所形成的ＤＮＡｚｙｍｅ的活性ꎬ但是在３ᶄ末端添加Ｔ核苷酸的作用不大ꎮＣｈａｎｇ等[１６]报道了添加在Ｇ￣四链体核心序列５ᶄ和３ᶄ末端的特定侧翼序列ｄ(ＣＣＣ)增加了Ｇ￣四链体与血红素结合的亲和力ꎬ从而显著增强了Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅ的活性ꎬ该ＤＮＡｚｙｍｅ的在含Ｋ＋的溶液中的米氏常数(Ｋｍ)为０ ７~１ １ｍｍｏｌ/Ｌꎬ远低于被首次报道的Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅ的Ｋｍ值(２ ６~２ ９ｍｍｏｌ/Ｌ)ꎮＬｉ等[１７]通过在Ｇ￣四链体的核心序列的３ᶄ末端添加３个相邻的腺嘌呤增强了Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅ的活性ꎬ与原始Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅ相比ꎬ使用该策略后的ＤＮＡｚｙｍｅ的催化活性增强了５~２０倍ꎬ腺嘌呤可能类似于天然辣根过氧化物酶(ＨＲＰ)中的远端组氨酸ꎬ起一般酸碱催化剂的作用ꎮ近期ꎬＣｈｅｎ等[１８]研究了Ｇ￣四链环和侧翼区域中的近端核苷酸(腺嘌呤(ｄＡ)或胞嘧啶(ｄＣ)核苷酸)对催化活性的作用ꎮ数据表明ꎬｄＡ/ｄＣ可以模仿在血红蛋白活性位点中发现的组氨酸的作用ꎬ当将ｄＡ/ｄＣ插入Ｇ￣四链环和侧翼区域时ꎬ催化增强是有效的ꎬ分别可使Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅ的催化活性增强４ ９和１２倍ꎬ但是必须特别注意ｄＡ/ｄＣ的定位ꎮＶｉｒｇｉｌｉｏ等[１９]在形成Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ的序列ＡＧ４Ａ和ＡＧ６Ａ的中间引入了一个５ᶄ￣５ᶄ极性位点反转ꎬ以获得ｄ(３ᶄＡＧＧ５ᶄ￣５ᶄＧＧＡ３ᶄ)(或ＡＧ２￣Ｇ２Ａ)和ｄ(３ᶄＡＧＧＧ５ᶄ￣５ᶄＧＧＧＡ３ᶄ(或ＡＧ３￣Ｇ３Ａ)ꎬ从而获得具有两个相同外部的Ｇ￣四链体ꎬ即两个３ᶄ￣末端的Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘꎬ它们对于血红素的结合至关重要ꎬ该策略使Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅ的催化活性增强７倍ꎮ这为Ｇ￣四链体形成序列对其整体催化能力的影响提供了宝贵线索ꎬ并为进一步改进提供了思路ꎮ２.３㊀对血红素/Ｇ￣四链体ＤＮＡ酶进行修饰Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅ的活性较低ꎬＧｏｌｕｂ等[２０]考虑可能是因为ＤＮＡｚｙｍｅ缺乏其底物结合的位点ꎬ于是该课题组通过将Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅ与序列特异性核酸结合位点(适体)共价缀合增强了ＤＮＡｚｙｍｅ的催化活性ꎬ最高可增强２０倍ꎮＤＮＡ适体部分结合的非核苷酸配体充当ＤＮＡｚｙｍｅ的底物ꎮ酶与适体的共价缀合将活性位点和识别位点结合成了一个完整结构的杂化结构ꎬ缩短了底物与Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅ的活性之间的距离从而提高了对底物的亲和力ꎮ但催化反应会依赖于底物的反复识别和释放ꎬ催化效率又受动力学效应的影响ꎬ所以这种动力学效应是耗时的ꎮＺｈｏｕ等[２１]开发了更简单易行的方法来提高Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅ与底物结合的亲和力ꎬ即将底物Ｌ￣半胱氨酸与血红素共价结合后ꎬ再与富含Ｇ的ＤＮＡ序列反应ꎬ构建了Ｌ￣半胱氨酸￣Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ人工自催化复合物ꎬ因为Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅ能催化Ｌ￣半胱氨酸氧化为半胱氨酸ꎬ同时生成Ｈ２Ｏ２ꎮＬ￣半胱氨酸与血红素的共价结合提高了该复合物与底物Ｌ￣半胱氨酸结合的亲和力ꎬＫｍ为２ ６１５μｍｏｌ/Ｌꎬ远低于Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ对Ｌ￣半胱氨酸的Ｋｍ值(约为８ ６４０μｍｏｌ/Ｌ)ꎬ这是因为Ｌ￣半胱氨酸￣Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ为Ｌ￣半胱氨酸在活性位点的富集提供了结合位点ꎬ还消除了底物Ｌ￣半胱氨酸的扩散动力１５２１㊀第１１期莫艳红等:血红素/Ｇ￣四链体ＤＮＡ酶的活性增强研究及其在生物传感器中的应用进展２５２１应用化学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第３７卷㊀学效应ꎬ加快了底物中间体的转移速率ꎬ防止了中间体在扩散过程中的损失ꎮ此外ꎬ该课题组还据此开发了一种新型的自催化平台用于凝血酶的灵敏检测ꎮ然而使用这些策略开发的Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅ对所检测的靶标有限制ꎮＸｉａｏ等[２２]受阳离子单体增强ＤＮＡｚｙｍｅ活性以及阳离子组蛋白对自然界中的阴离子ＤＮＡ的稳定作用的启发ꎬ将Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅ与阳离子肽结合在一起制备了ＤＮＡｚｙｍｅ￣肽共轭物(图２ａ)ꎮ共价附于ＤＮＡｚｙｍｅ的阳离子肽稳定了平行的Ｇ￣四链体结构并增强了与血红素结合的亲和力ꎬ从而增强了Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅ的催化作用ꎬ与原始ＤＮＡｚｙｍｅ相比显示出增强的类过氧化物酶活性高达４倍ꎬ且该策略开发的Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅ可用于许多应用ꎮ酶折叠成三维结构ꎬ巧妙地排列它们的活性基团ꎬ可以获得显著的催化性能ꎮＷａｎｇ等[２３]受此启发先是设计了含谷氨酰胺(Ｇｌｎ)的肽(Ｑ肽)ꎬ然后将其与Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅ一起自组装成具有类似辣根过氧化物酶活性位点和催化功能的纳米纤维ꎮ结果表明ꎬＱ肽和含有鸟嘌呤的ＤＮＡ序列(Ｇ￣ＤＮＡ)对血红素活性具有显著的协同作用ꎮ此外ꎬ引入Ｑ肽ꎬ促进了血红素与底物之间的电子转移ꎬ进一步地提高了催化活性ꎬ与ＤＮＡ/Ｈｅｍｉｎ或肽/Ｈｅｍｉｎ相比ꎬＧ￣ＤＮＡ/Ｑ肽/Ｈｅｍｉｎ复合物的催化效率提高了１０倍ꎮ近期ꎬ我们课题组[２４]提出了一种新型的基于ＤＮＡ四面体支架的ＤＮＡ酶(Ｔｅｔｒａｚｙｍｅｓ)并通过电化学方法对其催化活性进行了评价(图２ｂ)ꎮ利用ＤＮＡ纳米结构的稳定性和ＤＮＡ四面体支架良好的定向性来控制活性中心与电极表面的距离ꎬ从而调控Ｔｅｔｒａｚｙｍｅｓ的酶活性ꎮ我们发现Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅ固定在ＤＮＡ四面体内的Ｔｅｔｒａｚｙｍｅｓ表现出最强的电催化能力ꎬ比无ＤＮＡ四面体支架的Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅ的酶活性高出６~１４倍ꎮ这可能是因为ꎬＤＮＡ四面体支架使Ｇ￣四链体对血红素的亲和力增加ꎬ且可以防止Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣四链体的低聚ꎻ由于受到ＤＮＡ四面体的保护ꎬＴｅｔｒａｚｙｍｅｓ的活性中心处于更稳定的环境中ꎻＨｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅ的活性中心均匀分布在空间分离的ＤＮＡ四面体纳米结构上ꎬ从而使催化位点之间的相互作用最小化ꎬ促进了催化作用ꎮ这类Ｔｅｔｒａｚｙｍｅｓ有可能成为开发电化学酶传感器的通用酶标ꎮ图２㊀(ａ)将Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅ与阳离子肽共价结合的示意图[２２]ꎻ(ｂ)利用ＤＮＡ四面体结构固定Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅ的示意图[２４]Ｆｉｇ.２㊀(ａ)ＳｃｈｅｍａｔｉｃｄｉａｇｒａｍｆｏｒｃｏｖａｌｅｎｔｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｏｆＨｅｍｉｎ/Ｇ￣ＱｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅａｎｄｃａｔｉｏｎｉｃｐｅｐｔｉｄｅｓ[２２].(ｂ)ＳｃｈｅｍａｔｉｃｄｉａｇｒａｍｆｏｒＨｅｍｉｎ/Ｇ￣ＱｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅｆｉｘｅｄｕｓｉｎｇＤＮＡｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅ[２４]２.４㊀其它策略Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅ具有较低的催化活性ꎬ还可能是由于血红素会从复合物中解离出来ꎮ血红素基团与ＤＮＡ寡核苷酸共价结合是提高Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅ的类过氧化物酶活性较有前途的方法ꎬ合成途径有两种:胺偶联和点击反应[２５]ꎮ此外ꎬＬｉｕ等[２６]通过对血红素辅因子进行功能化修饰开发了具有卓越催化活性的Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅꎮ他们发现血红素的外围基团ꎬ两个羧基基团ꎬ对酶活性没有作用ꎬ只参与蛋白质残基的相互作用以促进辅因子的结合ꎮ可通过氨基羧酸偶联改变这两个羧基基团ꎬ生成酰胺衍生物ꎬ从而使得血红素辅助因子的末端被功能化ꎮ该课题组的实验结果表明ꎬ该策略大大提高了催化效率ꎬ对于ＡＢＴＳ￣Ｈ２Ｏ２催化系统ꎬ催化活性的增强高达１１倍ꎬ该改造后的血红素辅因子可能会取代原来的血红素ꎮＧ￣四链体的离散单元多聚化以形成多价ＤＮＡｚｙｍｅ也是增强ＤＮＡｚｙｍｅ的类过氧化物酶活性的新兴设计策略ꎮＡｄｅｏｙｅ等[２７]研究了５个形成Ｇ￣四链体结构的ＤＮＡ序列(ＡＳ１４１１㊁Ｂｃｌ￣２㊁ｃ￣ＭＹＣ㊁ＰＳ５.Ｍ和ＰＳ２.Ｍ)的多聚化的催化活性ꎮ他们的研究结果表明ꎬ形成平行Ｇ￣四链体结构的ＤＮＡ序列(ＡＳ１４１１ꎬＢｃｌ￣２ꎬｃ￣ＭＹＣ)的多聚化可通过单体单元之间的协同相互作用使催化速率显著提高ꎬ其中的Ｂｃｌ￣２ꎬ从三聚中显示出近８倍的增强效应ꎻ相反ꎬ形成非平行结构(ＰＳ５ Ｍ和ＰＳ２.Ｍ)的ＤＮＡ序列的多聚化没有显示出相似水平的协同增效活性ꎮ该研究报告的简单多聚体构建体为进一步研究如何使用这种方法构建更有效的催化ＤＮＡ纳米器件提供了基础ꎮ３㊀基于血红素/Ｇ￣四链体ＤＮＡ酶的生物传感器的应用天然过氧化物酶因具有出色的催化能力经常被用于生物传感器的信号放大ꎮ与天然过氧化物酶类似ꎬ具有类过氧化物酶活性的Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅ对特定底物具有较高的催化活性ꎬ但比天然过氧化物酶的化学性质更稳定ꎬ这使得Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅ逐渐成为天然过氧化物酶的替代物ꎬ被广泛应用于开发生物传感器ꎮ此外ꎬ由于Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅ还具有催化活性可控㊁生物相容性好㊁可编程㊁易修饰以及和能容易地与核酸放大技术结合的特性ꎬ基于Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅ开发的生物传感器具有灵敏度高㊁稳定性好以及操作简便等特点ꎬ因而被进一步应用于生物标志物㊁微生物与生物毒素以及金属离子等方面的检测ꎮ３.１㊀生物标志物的检测生物标志物是指可用于客观评估正常生物学过程㊁致病过程以及治疗干预后的药理反应的指标ꎬ其生化实体覆盖很广ꎬ如蛋白质㊁酶㊁核酸以及体内发现的肿瘤细胞等ꎬ被广泛用于疾病的识别㊁分类㊁早期诊断和预防ꎬ对临床诊断和治疗具有重要的意义[２８￣２９]ꎮ但由于存在于体内的生物标志物含量低㊁背景复杂㊁干扰大ꎬ对其进行检测通常很困难ꎮ所以ꎬ临床上急需一种可准确㊁可靠㊁灵敏且快速的检测方法对其进行检测ꎮＨｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅ所具有的较高的催化活性㊁高生物相容性㊁高热稳定性㊁可编程㊁易修饰性以及简便制备性成功地吸引了研究人员的关注ꎬ基于Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅ开发了一系列用于灵敏地检测生物标志物的生物传感器ꎮ其中用于凝血酶的检测的研究最为常见ꎬ基于Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅ的生物传感器对其以及其它的生物标志物的检测性能分别如表１[３０￣３３]㊁表２[３４￣４２]所示ꎮ表１㊀基于Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅ的生物传感器对凝血酶的检测性能[３０￣３３]Ｔａｂｌｅ１㊀ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｏｆｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓｂａｓｅｄｏｎＨｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅｆｏｒＴｈｒｏｍｂｉｎ[３０￣３３]ＳｉｇｎａｌａｍｐｌｉｆｉｅｒＭｅｔｈｏｄＤｅｔｅｃｔｉｏｎｌｉｍｉｔＬｉｎｅａｒｒａｎｇｅＲｅｆ.Ｇｏｘａ/ＨＧ￣ＤＮＡｚｙｍｅｂＥｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ０.３ｆｍｏｌ/Ｌ１ｆｍｏｌ/Ｌｔｏ１０ｎｍｏｌ/Ｌ[３０]Ｃｕ２Ｏ￣Ａｕｃ/ＨＧ￣ＤＮＡｚｙｍｅＥｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２３ｆｍｏｌ/Ｌ１００ｆｍｏｌ/Ｌｔｏ２０ｎｍｏｌ/Ｌ[３１]ＨＧ￣ＤＮＡｚｙｍｅ/Ｔ￣Ａｐｔｄ/ＳｉＯ２＠ＧＯｅ＠ＣＦｆＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ６.３ｆｍｏｌ/Ｌ１５ｆｍｏｌ/Ｌｔｏ２５ｎｍｏｌ/Ｌ[３２]ＨＧ￣ＤＮＡｚｙｍｅ/ｐｅｐｔｉｄｅ￣ＰｔＮＴｓｇ＠ｒＧＯｈＥｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１５ｆｍｏｌ/Ｌ５０ｆｍｏｌ/Ｌｔｏ６０ｎｍｏｌ/Ｌ[３３]㊀㊀ａ.Ｇｌｕｃｏｓｅｏｘｉｄａｓｅꎻｂ.Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅꎻｃ.ＣｕｐｒｏｕｓｏｘｉｄｅａｎｄＡｕｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓꎻｄ.Ｔｈｒｏｍｂｉｎａｐｔａｍｅｒꎻｅ.Ｇｒａｐｈｅｎｅｏｘｉｄｅꎻｆ.Ｃａｒｂｏｎｆｉｂｅｒꎻｇ.Ｐｌａｔｉｎｕｍｎａｎｏｔｕｂｅｓꎻｈ.Ｒｅｄｕｃｅｄｇｒａｐｈｅｎｅｏｘｉｄｅ.表２㊀基于Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅ的生物传感器对其他生物标志物的检测性能[３４￣４２]Ｔａｂｌｅ２㊀ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｏｆｂｉｏｓｅｎｓｏｒｂａｓｅｄｏｎＨｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅｆｏｒｏｔｈｅｒｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ[３４￣４２]ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｔａｒｇｅｔＭｅｔｈｏｄＤｅｔｅｃｔｉｏｎｌｉｍｉｔＬｉｎｅａｒｒａｎｇｅＲｅｆ.ＧａｓｔｒｉｃｃａｎｃｅｒｅｘｏｓｏｍｅｓＥｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ９.５４ˑ１０２ｐａｒｔｉｃｌｅｓ/ｍＬ４.８ˑ１０３ｔｏ４.８ˑ１０６ｐａｒｔｉｃｌｅｓ/ｍＬ[３４]ＨｅｐＧ２ａＥｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ５ｃｅｌｌｓ/ｍＬ１ˑ１０２ｔｏ１ˑ１０７ｃｅｌｌｓ/ｍＬ[３５]ＴａｒｇｅｔＤＮＡＥｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ５４ｆｍｏｌ/Ｌ１００ｆｍｏｌ/Ｌｔｏ１ｎｍｏｌ/Ｌ[３６]ＭｉｃｒｏＲＮＡ￣２０５Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ０.１３ｎｍｏｌ/Ｌ０.４ｔｏ６２.５ｎｍｏｌ/Ｌ[３７]ＬｙｓｏｚｙｍｅＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ１.２５ˑ１０－１１ｇ/Ｌ２.６４ˑ１０－１０ｔｏ６.６ˑ１０－８ｇ/Ｌ[３８]㊀Ｃｏｎｔｉｎｕｅｄｏｎｎｅｘｔｐａｇｅ３５２１㊀第１１期莫艳红等:血红素/Ｇ￣四链体ＤＮＡ酶的活性增强研究及其在生物传感器中的应用进展４５２１应用化学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第３７卷㊀㊀ｃｏｎｔｉｎｕｅｄｆｒｏｍｐｒｅｖｉｏｕｓｐａｇｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎｔａｒｇｅｔＭｅｔｈｏｄＤｅｔｅｃｔｉｏｎｌｉｍｉｔＬｉｎｅａｒｒａｎｇｅＲｅｆ.ＣＥＡｂＥｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３.２ｆｇ/ｍＬ１０ｆｇ/ｍＬｔｏ２００ｎｇ/ｍＬ[３９]ＣＥＡＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ６３ｐｇ/ｍＬ０.１ｔｏ１５０ｎｇ/ｍＬ[４０]ＰＤＧＦ￣ＢＢｃＣｏｌｏｒｉｍｅｔｒｙ０.０５５ｐｇ/ｍＬ０.１ｔｏ１０００ｐｇ/ｍＬ[４１]ＩＦＮ￣γｄＥｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ０.６ｆｍｏｌ/Ｌ１ｆｍｏｌ/Ｌｔｏ５０ｐｍｏｌ/Ｌ[４２]㊀㊀ａ.Ｈｕｍａｎｌｉｖｅｒｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｓꎻｂ.Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃａｎｔｉｇｅｎꎻｃ.Ｐｌａｔｅｌｅｔ￣ｄｅｒｉｖｅｄｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒꎻｄ.Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ￣ｇａｍｍａ.Ｋｏｎｇ等[３０]利用低背景信号的高效靶标活化酶级联电催化技术ꎬ即通过调节靶标诱导的Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅ和葡萄糖氧化酶(ＧＯｘ)之间的电催化效率ꎬ建立了凝血酶超灵敏检测的电化学生物传感器(图３ａ)ꎮ该系统使用刚性ＤＮＡ四面体(ＴＤＮ)支架将葡萄糖氧化酶(ＧＯｘ)锚定在远离电极表面的顶点ꎬ引入目标凝血酶和Ｈｅｍｉｎꎬ就会在电极表面附近的ＴＤＮ的另一个顶点处形成充当电化学信号探针的Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅꎬ从而激活高效酶级联电催化ꎬ产生用于目标检测的理想电化学响应ꎮ这种直接化学策略不仅可以避免在现有的两种生物酶的传统级联电催化中的高背景信号ꎬ而且可以同时提高酶级联的电催化效率ꎬ实现生物分子的超灵敏电分析检测ꎮ该电化学生物传感器对目标凝血酶的检测限低至０ ３ｆｍｏｌ/Ｌꎮ图３㊀(ａ)基于Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣ＱｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅ的生物传感器检测凝血酶的示意图[３０]ꎻ(ｂ)基于Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣ＱｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅ的生物传感器检测ＨｅｐＧ２细胞的示意图[３５]Ｆｉｇ.３㊀(ａ)ＳｃｈｅｍａｔｉｃｄｉａｇｒａｍｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＴｈｒｏｍｂｉｎｂｙｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓｂａｓｅｄｏｎＨｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅ[３０].(ｂ)ＳｃｈｅｍａｔｉｃｄｉａｇｒａｍｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＨｅｐＧ２ｃｅｌｌｓｂｙｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓｂａｓｅｄｏｎＨｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅ[３５]Ｈｕａｎｇ等[３４]报道了一种基于Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣Ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ辅助信号放大策略的灵敏传感器ꎬ用于胃癌外泌体的电化学检测ꎮ该平台包含抗ＣＤ６３抗体修饰的金电极和胃癌外泌体特异性适体ꎬ适体连接至与Ｇ￣四链体环形模板互补的引物序列ꎮ当胃癌外泌体存在时会触发滚环扩增(ＲＣＡ)并生成大量的Ｇ￣四链体单位ꎮ然后产物与血红素一起孵育形成Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅꎬ这种类似于过氧化物酶的ＤＮＡｚｙｍｅ会催化Ｈ２Ｏ２的还原并产生电化学信号ꎬ从而实现胃癌外泌体的特异性检测ꎮ该适体传感器对胃癌外泌体的检测限为９ ５４ˑ１０２ｐａｒｔｉｃｌｅｓ/ｍＬꎬ线性响应范围为４ ８ˑ１０３~４ ８ˑ１０６ｐａｒｔｉｃｌｅｓ/ｍＬꎮ该电化学适体传感器的检出限低于大多数先前报道的方法ꎬ其高灵敏度归因于Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣ＱｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅ对ＲＣＡ反应产生的过氧化氢还原和信号放大的联合作用ꎮＣｈｅｎ等[３５]基于多支杂交链反应扩增策略和ＤＮＡ纳米结构建立了一种适体传感器ꎬ用于人肝癌细胞(ＨｅｐＧ２细胞)的灵敏电化学检测(图３ｂ)ꎮ将扩展了适体的ＤＮＡ四面体修饰在金电极上ꎬ其特异性捕获ＨｅｐＧ２细胞后ꎬ借助适体和ＨｅｐＧ２细胞的特异亲和力ꎬ将由ＭＩＬ￣１０１(一种典型的Ｆｅ￣金属￣有机骨架)＠ＡｕＮＰｓ㊁ＨＲＰ以及Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣ＱｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅ合成的功能性杂合纳米探针附着到细胞上ꎬ形成三明治结构ꎮ功能性杂合纳米探针在Ｈ２Ｏ２的存在下氧化对苯二酚(ＨＱ)产生电化学信号ꎬ从而实现对ＨｅｐＧ２细胞的检测ꎮ该生物传感器由于采用了ＭＩＬ￣１０１＠ＡｕＮＰｓ㊁ＨＲＰ和Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣ＱｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅ作为三重信号放大ꎬ且引入了ＤＮＡ四面体结构ꎬ显示出高选择性㊁可接受的灵敏度和良好的可靠性ꎬ其检测下限为５个细胞/ｍＬꎮＧａｏ等[３６]基于邻近杂交触发Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅ形成ꎬ构建了一种无标记的电化学ＤＮＡ传感器ꎮ首先将硫醇化修饰的Ｇ￣ＤＮＡ１固定在Ａｕ电极表面上ꎮ在存在目标ＤＮＡ的情况下ꎬ就会通过形成Ｙ型结构三元复合物触发Ｇ￣ＤＮＡ１ꎬＨｅｍｉｎ和Ｇ￣ＤＮＡ２的邻近组装ꎬ导致Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣ＱｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅ的形成ꎬ从而生成电化学信号ꎮ该传感器观察到的信号增益实现了５４ｆｍｏｌ/Ｌ的检测极限ꎬ线性动态范围为１００ｆｍｏｌ/Ｌ~１ｎｍｏｌ/ＬꎮＳｕｎ等[３８]制备了溶菌酶适体(Ｌ￣Ａｐｔ)和Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅ修饰的石墨烯量子点＠氧化石墨烯＠碳纤维复合材料(ＤＮＡｚｙｍｅ/Ｌ￣Ａｐｔ/ＧＱＤｓ＠ＧＯ＠ＣＦ)ꎬ并利用此复合材料实现了对溶菌酶(ＬＺＭ)的灵敏化学发光检测ꎮ该课题组先是合成了ＧＱＤｓ＠ＧＯ＠ＣＦ复合材料ꎬ然后ꎬ将Ｌ￣Ａｐｔ固定在ＧＱＤｓ＠ＧＯ＠ＣＦ的表面上ꎬ提高了复合材料的特异性识别能力ꎻ随后ꎬ通过碱基互补配对作用将具有类过氧化物酶活性的Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅ与Ｌ￣Ａｐｔ结合在一起ꎮ当ＬＺＭ存在时ꎬ由于ＬＺＭ与Ｌ￣Ａｐｔ之间具有较强的特异性识别能力ꎬＤＮＡｚｙｍｅ将从Ｌ￣Ａｐｔ/ＧＱＤｓ＠ＧＯ＠ＣＦ表面被释放出来ꎬ释放的ＤＮＡｚｙｍｅ便进一步催化ＣＬ(化学发光)反应ꎬ产生ＣＬ信号ꎬ实现对ＬＺＭ的检测ꎮ由于ＧＱＤｓ＠ＧＯ＠ＣＦ为Ｌ￣Ａｐｔ提供了丰富的结合位点㊁ＬＺＭ与Ｌ￣Ａｐｔ之间具有较强的特异性识别特性以及Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅ具有较高的催化活性ꎬ该用于ＬＺＭ检测的ＣＬ生物传感器显示出较高的灵敏度ꎬ线性范围为２ ６４ˑ１０－１０~６ ６０ˑ１０－８ｇ/Ｌꎬ检测限为１ ２５ˑ１０－１１ｇ/ＬꎮＨｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅ所具有的比天然过氧化物酶更高的稳定性以及较高的催化活性ꎬ使得基于其开发的用于生物标志物检测的生物传感器与传统生物传感相比ꎬ具有稳定性㊁灵敏度和准确度更高的特性ꎮ除此之外ꎬ基于Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅ的电化学生物传感器还具有检测装置轻便㊁廉价㊁响应时间短以及易于微型化和集成化的优点ꎬ但附加的电子介质会使电化学生物传感器的化学背景信号较高ꎬ检测限较高ꎮ基于Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅ的化学发光生物传感器是一类以高灵敏的ＣＬ反应为换能反应且用来确定某些生物组分含量的生物传感器ꎬ具有检测限低㊁线性工作范围广㊁信燥比高等特点ꎬ但其特异性较差ꎬ未来可通过引入一些特定的识别材料来改善ꎮ尽管目前基于Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅ开发的用于生物标志物检测的生物传感器已具有较好的灵敏度和准确度ꎬ但它仍有改进的可能性ꎬ这一点可从提高Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅ的稳定性和催化活性出发ꎬ也可结合具有优异性能的纳米材料ꎮ３.２㊀微生物与生物毒素的检测食源性致病微生物ꎬ如单核细胞增生性李斯特菌㊁沙门氏菌㊁金黄色葡萄球菌㊁大肠杆菌Ｏ１５７:Ｈ７ꎬ可通过污染食物而导致人类或动物食物中毒甚至患上威胁生命的食源性疾病[４３]ꎮ生物毒素是微生物的次生代谢产物ꎬ对人类和动物具有肾毒性㊁致畸性和致癌性ꎬ且一旦进入食物链便很难去除[４４]ꎮ生物毒素中最常见且毒性较强的是黄曲霉素和赭曲霉素ꎬ广泛存在于谷类和豆类等农产品中ꎮ因此ꎬ对食品中的微生物与生物毒素进行检测具有重要意义ꎬ然而ꎬ传统检测方法大多需要使用较为复杂的设备且不能实现快速的现场检测ꎮＨｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅ的出现为开发快速㊁简便㊁灵敏的用于微生物与生物毒素的检测的生物传感器提供了可能性ꎬ对于微生物ꎬ通常是利用其自身的ＤＮＡ序列实现对其的检测ꎬ而生物毒素ꎬ通常可简便地基于适体实现检测ꎮ近年来ꎬ基于Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅ的生物传感器对微生物与生物毒素的检测性能如表３[４５￣５１]所示ꎮＬｉｕ等[４５]开发了基于Ｈｅｍｉｎ/Ｇ￣ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘＤＮＡｚｙｍｅ的环介导等温扩增(ＬＡＭＰ)生物传感平台ꎬ用于单核细胞增生李斯特菌的比色检测(图４ａ)ꎮ该课题组设计了４种引物以与目标ＤＮＡ中的６个不同序列杂交ꎬ从而在ＬＡＭＰ步骤中进行了高度特异性的扩增ꎮ在添加Ｈｅｍｉｎ的情况下ꎬ在ＬＡＭＰ中同时扩增的Ｇ￣四链体序列会形成ＤＮＡｚｙｍｅꎮ具有类过氧化物酶活性的ＤＮＡｚｙｍｅ将无色的ＡＢＴＳ氧化为绿色的ＡＢＴＳ ＋ꎬ从而实现单核细胞增生李斯特氏菌的比色检测ꎬ该测定法每次反应可特异性检测出低至５５２１㊀第１１期莫艳红等:血红素/Ｇ￣四链体ＤＮＡ酶的活性增强研究及其在生物传感器中的应用进展。

第38卷第7期205年7月分析测试学报FENXI CESHI XUEBAO (Joumal of Instmmectal Analysis )Vol. 37 No 7840-844I 实验技术与方法?doi : 10. 3966/j. issn. 1004 -4957. 2019. 07. 017基于G ■四链体-氯化血红素DNA 酶比色法测定银离子和汞离子传感器的构筑肖志友**，司恒丹，邓兰清，龙 丽，居荣梅，张 鑫，刘益飞收稿日期：2019 -03 -17；修回日期：255-04-25基金项目：国家自然科学基金资助项目(4176302)；贵州省科学技术基金资助项目(黔科合J 字［2015］ 2263号)；贵州理工学院高层次人才科研启动经费项目(XGC2018125)；贵州理工学院大学生创新训练项目(201814440229)*通讯作者：肖志友，博士，副教授，研究方向：光谱分析、纳米生物分析，E - mail : zyxiao@ gio edu. 3k(贵州理工学院 化学工程学院，贵州 贵阳554003)摘 要：利用G-四链体DNAQWTGGGAGGGAGGGAGGGA 氨)与氯化血红素结合形成G-四链体-Hemin DNA 酶，其能高效催化比。

5氧化反应底物由无色变为绿色，当溶液中有Ag +或Hg 5+存在时会阻碍该DNA 酶的形成，导致绿色溶液变浅。

基于此，建立了比色法测定Ag +和Hg 5+的传感器。

在最佳实验条件下，溶 液的吸光度与Ay +和Hg 5 +浓度分别在50. 0 - 9 000. 0 nmol/L 和80. 0 - 800. 0 nmol/L 范围内具有良好的线性 关系，检岀限(32/210X0)分别为55. 0 nmol/L 和64. 3 nmg/L 。

该方法具有较好的选择性，采用该方法对实际 样品进行测试，结果满意。

关键词：G-四链体-氯化血红素DNA 酶；比色法测定；银离子；汞离子；传感器 中图分类号：O657. 63； 065. 22 文献标识码：A 文章编号：504 - 4957(202 ) 07 - 0840 - 05Fan/cotiou of a Sensor for Colorimetric Determination of Silver and Mercnry IonyBased on G-ptadruplea - Hemin DNAzymooXIAO Zhi-you * , SI Heqg-Sad , DENG Lgt-ping , LONG Li , JURong-mei , ZHANG XV , LID Yi-fei(School of Chemical Engiuee/ng , Guizhou IusPtutc of Techuology, Guiyang 554003, China)Abstract ： A sensor for coU/vetuc Ueteunination of silver and m —cog Vus based on G 乙uPrupUa - hemin DNAzymat was gp/cat —. The GqudtupUa - hemin DNAzymat was form — bf the combina- tiou of G-quPupma(5'-CTGGGAGGGAGGGAGGGA-3') with hemin , which could catalyea HO 2 to oxide the suUstrata eUiciectlf , and made the colorle s t solution become green. The pus —a of Ay +or Hg 0+ V the solution would hindef the founatiou of the DNAzyme , and the solution color became lighter. Under the optimal expe/v —ul coudiCout , there were good /near uUtUnships for the P- sorbanco of the solution with Ay + and Hg 2 + V the cone —VPUu ranges of 170. 0 - 1 000. 0 nmoUL and 80. 0 - 890. 0 nmoUL , with detection /mCt(32/Smpe ) of 55. 0 nmol/L and 69. 3 nmoUL , u- spectivvlf. This method was of good selectivitf , and was applied it the detection of real samples with satisfactou usu/t.Key worbs : G —uPrupUa - hemin DNAzymet : coU/vetric determination , silver ion ; merchg nog ； segsoo银离子在制药、化工、制镜、电子工业中有较多应用［1］，其对人体的潜在危害逐渐受到人们的重 视，如导致人体疏基酶失活，引起肝肾损害，结合代谢分子中氨基、n 基等［0-9］。

矿产资源开发利用方案编写内容要求及审查大纲
矿产资源开发利用方案编写内容要求及《矿产资源开发利用方案》审查大纲一、概述
㈠矿区位置、隶属关系和企业性质。

如为改扩建矿山, 应说明矿山现状、
特点及存在的主要问题。

㈡编制依据
(1简述项目前期工作进展情况及与有关方面对项目的意向性协议情况。

(2 列出开发利用方案编制所依据的主要基础性资料的名称。

如经储量管理部门认定的矿区地质勘探报告、选矿试验报告、加工利用试验报告、工程地质初评资料、矿区水文资料和供水资料等。

对改、扩建矿山应有生产实际资料, 如矿山总平面现状图、矿床开拓系统图、采场现状图和主要采选设备清单等。

二、矿产品需求现状和预测
㈠该矿产在国内需求情况和市场供应情况
1、矿产品现状及加工利用趋向。

2、国内近、远期的需求量及主要销向预测。

㈡产品价格分析
1、国内矿产品价格现状。

2、矿产品价格稳定性及变化趋势。

三、矿产资源概况
㈠矿区总体概况
1、矿区总体规划情况。

2、矿区矿产资源概况。

3、该设计与矿区总体开发的关系。

㈡该设计项目的资源概况
1、矿床地质及构造特征。

2、矿床开采技术条件及水文地质条件。

矿产资源开发利用方案编写内容要求及审查大纲
矿产资源开发利用方案编写内容要求及《矿产资源开发利用方案》审查大纲一、概述
㈠矿区位置、隶属关系和企业性质。

如为改扩建矿山, 应说明矿山现状、
特点及存在的主要问题。

㈡编制依据
(1简述项目前期工作进展情况及与有关方面对项目的意向性协议情况。

(2 列出开发利用方案编制所依据的主要基础性资料的名称。

如经储量管理部门认定的矿区地质勘探报告、选矿试验报告、加工利用试验报告、工程地质初评资料、矿区水文资料和供水资料等。

对改、扩建矿山应有生产实际资料, 如矿山总平面现状图、矿床开拓系统图、采场现状图和主要采选设备清单等。

二、矿产品需求现状和预测
㈠该矿产在国内需求情况和市场供应情况
1、矿产品现状及加工利用趋向。

2、国内近、远期的需求量及主要销向预测。

㈡产品价格分析
1、国内矿产品价格现状。

2、矿产品价格稳定性及变化趋势。

三、矿产资源概况
㈠矿区总体概况
1、矿区总体规划情况。

2、矿区矿产资源概况。

3、该设计与矿区总体开发的关系。

㈡该设计项目的资源概况
1、矿床地质及构造特征。

2、矿床开采技术条件及水文地质条件。

矿产资源开发利用方案编写内容要求及审查大纲
矿产资源开发利用方案编写内容要求及《矿产资源开发利用方案》审查大纲一、概述
㈠矿区位置、隶属关系和企业性质。

如为改扩建矿山, 应说明矿山现状、
特点及存在的主要问题。

㈡编制依据
(1简述项目前期工作进展情况及与有关方面对项目的意向性协议情况。

(2 列出开发利用方案编制所依据的主要基础性资料的名称。

如经储量管理部门认定的矿区地质勘探报告、选矿试验报告、加工利用试验报告、工程地质初评资料、矿区水文资料和供水资料等。

对改、扩建矿山应有生产实际资料, 如矿山总平面现状图、矿床开拓系统图、采场现状图和主要采选设备清单等。

二、矿产品需求现状和预测
㈠该矿产在国内需求情况和市场供应情况
1、矿产品现状及加工利用趋向。

2、国内近、远期的需求量及主要销向预测。

㈡产品价格分析
1、国内矿产品价格现状。

2、矿产品价格稳定性及变化趋势。

三、矿产资源概况
㈠矿区总体概况
1、矿区总体规划情况。

2、矿区矿产资源概况。

3、该设计与矿区总体开发的关系。

㈡该设计项目的资源概况
1、矿床地质及构造特征。

2、矿床开采技术条件及水文地质条件。