实验六 蛋白质的水解和氨基酸的纸层析法分离
一、目的
1．学习水解蛋白质的方式。
2．把握纸层析的大体技术。
3．学习用纸层析分离、鉴定氨基酸的方式。
二、原理
1．蛋白质的水解
蛋白质能够用酸、碱或酶如胃蛋白酶，胰蛋白酶，糜蛋白酶水解成最终产物氨基酸。实验室中常利用酸解法水解蛋白质。当在6 mo叭。盐酸溶液中将蛋白质在110t加热大约20
h，肽键断裂，现在蛋白质完全分解为氨基酸。
酸法水解蛋白质的优势是在水解进程中不发生外消旋作用，所取得的氨基酸均为L一氨基酸。大多数氨基酸在煮沸酸中是稳固的，但色氨酸那么完全被破坏。丝氨酸和苏氨酸在酸解进程中或多或少地也有破坏。色氨酸的水解产物已知是一种棕黑色的物质——腐黑质，因此，用酸法水解蛋白质取得的水解液为棕黑色的。
2．纸层析法分离氨基酸
纸层析是以滤纸作为支持物的分派层析法。它利用不同物质在同一推动剂中具有不同的分派系数，经层析而达到分离的目的。在必然条件下，一种物质在某溶剂系统中的分派系数是一个常数，假设以K表示分派系数
层析溶剂（又称推动剂），是选用有机溶剂和水组成的。滤纸纤维素与水有较强的亲和力（纤维素分子的葡萄糖基上的-OH基与水通过氢键相作用）能吸附很多水分，一样达滤纸重的22％左右（其中约有6％的水与纤维素结合成复合物），由于这部份水扩散作用降低形成固定相；而推动剂中的有机溶剂与滤纸的亲和力很弱，可在滤纸的毛细管中自由流动，形成流动相。层析时，点有样品的滤纸一端浸入推动剂中，有机溶剂持续不断地通过点有样品的原点处，使其上的溶质依据本身的分派系数在两相间进行分派。随着有机溶剂不断向前移动，溶质被携带到新的无溶质区并继续在两相间发生可逆的从头分派，同时溶质离开原点不断向前移动，溶质中各组分的分派系数不同，前进中显现了移动速度不同，通过一按时刻的层析，不同组分便实现了分离。物质的移动速度以Rf值表示：
各类化合物在恒定条件下，层析后都有其必然的Rf值，借此能够达到定性、辨别的目的。
常用的蛋白质纯化方法和原理
蛋白质的纯化是生物化学研究中非常重要的一步，纯化蛋白质可以用于结构解析、功能研究、动态过程研究等各种生物学实验。常用的蛋白质纯化方法有盐析法、凝胶过滤法、离子交换色谱法、亲和色谱法、逆渗透法和层析法等。下面将对这些方法的原理和步骤进行详细阐述。
1. 盐析法
盐析法是根据蛋白质在溶液中的溶解性随盐浓度的变化而变化的原理进行蛋白质的纯化。该方法是利用蛋白质在高盐浓度下与水结合能力降低，使其从溶液中沉淀出来。应用盐析法时，需要先调节溶液的盐浓度使蛋白质溶解，然后逐渐加入盐使其过饱和，蛋白质便会析出。最后通过离心将蛋白质的沉淀物分离，得到纯化的蛋白质。
2. 凝胶过滤法
凝胶过滤法是利用凝胶的 pores 来分离蛋白质的一种方法。凝胶通常是聚丙烯酰胺（也称作 Polyacrylamide）或琼脂糖。研究者将蛋白质样品加入到过滤膜上，较小的蛋白质能够通过 pores，较大的分子则被排出。通过选择不同大小的凝胶孔径，可以根据蛋白质的大小来选择合适数目的过滤膜。凝胶过滤法需要进行缓冲液体积的连续换流，将蛋白质与其他杂质分离开来。
3. 离子交换色谱法
离子交换色谱法是利用蛋白质与离子交换基质之间静电吸引力的不同而分离的方法。离子交换基质通常是富含正离子或负离子的高分子材料。在离子交换色谱法中，样品溶液在特定的 pH 下流经离子交换基质，带有不同电荷的蛋白质能够与基质发生反应，吸附在基质上。为了获得纯化蛋白质，需要通过梯度洗脱，逐渐改变缓冲液 pH 或离子浓度，使吸附在离子交换基质上的蛋白质逐渐释放出来。
4. 亲和色谱法
亲和色谱法是利用蛋白质与特定的配体相互作用特异性进行分离的方法。配体可以是天然物质，如金属离子、辅酶或抗体，也可以是人工合成的结构。在亲和色谱法中，样品溶液经过含有配体的固定相，与配体发生特异性相互作用，蛋白质与其它组分分离。然后可以通过改变某些条件（如 pH、温度或离子浓度）来洗脱纯化的蛋白质。
一.分子筛（凝胶层析）
原理：用一般的柱层析方法使相对分子质量不同的溶质通过具有分子筛性质的固定相（凝胶），从而使蛋白质分离。
优点： 1.洗脱条件简单，往往只需要一种缓冲溶液，可以使用任何缓冲液。
2.实验操作相对简单
3.条件温和，对蛋白活性保持率高
4.既可以对标签蛋白纯化也可以对非标签蛋白纯化。
缺点：1. 工艺放大困难：分子筛层析无法遵循线性放大原则，即使遵循柱床高度不变的原则，工艺流速如何进行调整，也是需要面临的问题。
2. 层析柱装填困难
3.对上样量有要求
4. 测定柱效困难
5.反复使用层析柱困难
二.亲和层析
原理：亲和层析是一种吸附层析，亲和层析利用固相介质中的配基与混合生物分子之间亲和能力不同而进行分离，当蛋白混合液通过层析柱时，与配基能够特异性结合的蛋白质就会被吸附固定在层析柱中，其他的蛋白质对配体不具有特异性的结合能力，将通过柱子洗脱下来，这种结合在一定条件下是可逆的，选用适当的洗脱液，改变缓冲液的离子强度和pH值或者选择更强的配体结合溶液将结合的蛋白质洗脱下来，而无亲和力的蛋白质最先流出层析柱。
优点: 1. 亲和层析法是分离蛋白质的一种极为有效的方法，它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。
2. 是最有效的生物活性物质纯化方法，它对生物分子选择性的吸附和分离，可以取得很高的纯化倍数。此外蛋白在纯化过程中得到浓缩，结合到亲和配基后，性质更加稳定，其结果提高了活性回收率。此外它可以减少纯化步骤，缩短纯化时间，对不稳定蛋白的纯化十分有利。
缺点：1.除特异性的吸附外，仍然会因分子的错误认别和分子间非选择性的作用力而吸附一些杂蛋白质，另洗脱过程中的配体不可避免的脱落进入分离体系。
2. 载体较昂贵，机械强度低，配基制备困难，有的配基本身要经过分离纯化，配基与载体耦联条件激烈等。
三.离子交换层析
原理：离子交换层析根据样品表面电荷不同进行分离纯化的技术，根据不同蛋白样品在同一Ph条件下所带电荷正负以及带电荷量不同而将不同蛋白样品分离。
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实验一氨基酸的别离鉴定——纸层析法
实验目的
1.学习氨基酸纸层析的根本原理。
2.掌握氨基酸纸层析的操作技术。
实验原理
纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。层析溶剂由有机溶剂和水组成，滤纸和水的亲和力强，与有机溶剂的亲和和弱，因此在展层时，水是固定相，有机溶剂是流动相。将样品点在滤纸上〔原点〕，进展展层，样品中的各种AA在两相溶剂中不断进展分配，由于它们的分配系数不同，不同AA随流动相移动速率就不同，于是将这些AA别离开来，形成距原点距离不等的层析点。
溶质在滤纸上的移动速率用比移〔rate of flow ,Rf〕来表示
Rf= 原点到层析点中心的距离〔*〕/原点到溶剂前沿的距离(Y)
只要条件〔如温度、展层剂的组成〕不变，*种物质的Rf值是常数。可根据Rf作为定性依据。 Rf值的大小与物质的构造、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。
样品中如有多种AA，其中有些AA的Rf值一样或相近，此时只用一种溶剂展层，就不能将它们分开，为此，当用一种溶剂展层后，将滤纸转90度再用另一种溶剂展层，从而到达别离的目的，这种方法叫双向层析。
仪器、试剂
1、扩展剂：是水饱和的正丁醇和醋酸以体积比4：1进展混合得混合液。将20 ml正丁醇和5 ml冰醋酸放入分液漏斗中，与15 ml水混合，充分振荡，静置后分层，放出下层水层，漏斗内即为扩展剂。取漏斗内的扩展剂约5 ml置于小烧杯中做平衡溶剂，其余的倒入培养皿中备用。
2、氨基酸溶液
⑴.单一氨基酸：5%赖氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、
⑵.混合氨基酸：各5 ml混合。
3、显色剂：0.1%水合茚三酮正丁醇溶液。
4、层析缸、滤纸〔14*17〕、喷雾器、电吹风
实验步骤
1.放置平衡溶剂：用量筒量取约5 ml平衡溶剂，放入培养皿中，然后置于密闭的层析缸中。
2.准备滤纸：取层析滤纸〔长17㎝、宽14㎝〕一*。在纸的一端距边缘2㎝处用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔1.5㎝作一记号——点样线。
