蛋白质分离技术-层析

蛋白质纯化与层析技术蛋白质纯化是生物化学和生物技术领域中至关重要的过程，用于从混合物中分离和纯化目标蛋白质。

层析技术作为蛋白质纯化的关键步骤之一，它不仅可以选择性地将目标蛋白质从混合物中分离出来，还可以去除杂质，获得高纯度的蛋白质样品。

一、蛋白质纯化的基本原理蛋白质纯化的基本原理是根据不同的理化性质，如分子量、极性、电荷等特征，选择合适的纯化方法分离目标蛋白质。

常见的蛋白质纯化方法包括离心、超滤、电泳、沉淀和层析等。

离心法是通过调整离心速度和时间，根据不同蛋白质的分子量和密度差异，将目标蛋白质和非目标蛋白质分层离心，进而实现纯化。

超滤法则是利用滤膜对溶液进行筛选分离，减少蛋白质和其他分子之间的尺寸和质量差异，从而实现蛋白质的纯化。

电泳法是根据蛋白质在电场中不同的电荷和分子量特性，使其在凝胶上移动的速度不同，从而实现纯化和分离。

沉淀法则是通过添加适当的沉淀剂，使蛋白质凝聚成颗粒，经过离心后分离出来。

而层析法是根据蛋白质与层析介质之间的相互作用，通过选择性吸附和洗脱，将目标蛋白质从混合物中纯化出来。

二、层析技术的分类与原理层析技术是在纯化过程中广泛使用的方法，根据不同的工作原理和介质特性，可以将其分为几种不同的类型。

常见的层析技术包括吸附层析、凝胶层析、亲和层析和离子交换层析等。

吸附层析是通过目标蛋白质与特定层析介质之间的亲和力，使目标蛋白质被吸附在介质上，从而实现纯化。

凝胶层析则是利用介质中多孔性凝胶矩阵的分子筛效应，根据蛋白质的分子量和形状特征，通过不同的渗透效应将目标蛋白质分离出来。

亲和层析是利用目标蛋白质与特定配体（如抗体）之间的特异性结合，使目标蛋白质选择性地与介质上的配体结合，从而实现纯化。

离子交换层析则是基于蛋白质表面的电荷特性，通过电荷间的相互作用，使目标蛋白质与介质表面的离子互相吸附和洗脱，实现纯化。

三、层析技术的操作步骤和优化层析技术的操作步骤通常包括前处理、样品加载、洗脱和再生等步骤。

根据分子大小分离蛋白质的方法蛋白质是生命体中非常重要的分子，它们在细胞的结构和功能中起着关键作用。

为了研究蛋白质的特性和功能，科学家们经常需要对蛋白质进行分离和纯化。

分离蛋白质的一个重要方法是根据蛋白质的分子大小进行分离。

本文将介绍几种常用的根据分子大小分离蛋白质的方法。

一、凝胶过滤层析法凝胶过滤层析法是一种基于分子大小的常用分离技术。

其原理是利用孔径大小不同的凝胶材料，将大分子蛋白质滞留在凝胶中，而小分子溶质可以顺利通过凝胶。

常用的凝胶材料有琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶等。

根据需要选择不同的凝胶孔径，可以实现对不同分子大小的蛋白质进行分离。

二、聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离技术。

它利用电场作用将蛋白质分子按照大小进行分离。

在聚丙烯酰胺凝胶中，较大的蛋白质分子迁移速度较慢，而较小的蛋白质分子迁移速度较快。

通过调整电场强度和时间，可以实现对不同分子大小的蛋白质进行分离。

三、尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的变性凝胶电泳方法。

尿素是一种强变性剂，可以使蛋白质分子解离成单体，并且具有较好的可溶性。

在尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳中，蛋白质分子的迁移速度主要取决于它们的电荷和分子大小。

通过调整电场强度和时间，可以实现对不同分子大小的蛋白质进行分离。

四、尺寸排阻色谱尺寸排阻色谱是一种利用固定相孔径大小进行分离的色谱技术。

在尺寸排阻色谱中，较大的蛋白质分子无法进入固定相孔径，因此会以较快的速度从色谱柱中洗脱，而较小的蛋白质分子则会在固定相中发生多次扩散，从而保留更长的时间。

通过调整固定相的孔径，可以实现对不同分子大小的蛋白质进行分离。

五、离心过滤法离心过滤法是一种简便快速的蛋白质分离方法。

它利用离心力将大分子蛋白质沉淀在滤膜上，而小分子蛋白质则通过滤膜被洗脱出来。

通过选择不同孔径的滤膜，可以实现对不同分子大小的蛋白质进行分离。

根据分子大小分离蛋白质的方法有凝胶过滤层析法、聚丙烯酰胺凝胶电泳、尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳、尺寸排阻色谱和离心过滤法等。

分离纯化蛋白质的方法蛋白质是生命体内最基本的分子，它们参与了生命体内的许多重要生物学过程，如代谢、信号转导、免疫防御等。

因此，对蛋白质的研究具有重要的科学意义。

但是，蛋白质在生物体内的含量很少，且与其他成分相混合，因此需要通过分离纯化的方法来获取纯净的蛋白质样品。

本文将介绍几种常用的分离纯化蛋白质的方法。

1. 溶液层析法溶液层析法是一种常用的蛋白质分离纯化方法。

它基于蛋白质在不同的化学性质和结构特征下在固定相中的不同亲和力，通过不同的溶液组成、pH值、离子强度等条件来分离纯化蛋白质。

溶液层析法的操作简单、效果好，可以分离出高纯度的蛋白质。

但是，它需要对分离材料的性质和蛋白质的性质有深入的了解，以便选择合适的分离条件。

此外，溶液层析法需要大量的分离材料和实验室设备，成本较高。

2. 凝胶层析法凝胶层析法是一种基于蛋白质分子大小、形状和电荷等性质的分离纯化方法。

它利用凝胶作为分离材料，通过分子筛效应、凝胶孔道大小和分子电荷等因素来分离不同大小和电荷的蛋白质。

凝胶层析法具有操作简单、分离效果好、成本低等优点。

但是，它需要长时间的分离过程，而且凝胶的孔径大小和材料的性质会影响分离效果。

此外，凝胶层析法只能分离相对较小的蛋白质，对大分子蛋白质的分离效果较差。

3. 电泳法电泳法是一种通过电场作用将不同电荷的蛋白质分离的方法。

它利用电泳移动速度与蛋白质质量和电荷密度之间的关系，将蛋白质分离纯化。

电泳法具有操作简单、分离效果好、成本低等优点。

但是，它需要专业的电泳设备和实验技能，而且对蛋白质的性质和电泳条件有较高的要求。

此外，电泳法只能分离相对较小的蛋白质，对大分子蛋白质的分离效果较差。

4. 亲和层析法亲和层析法是一种基于蛋白质与其配体之间的亲和作用来分离纯化蛋白质的方法。

它利用配体与蛋白质的特异性结合来分离纯化目标蛋白质。

亲和层析法具有分离效果好、选择性高、可重复使用等优点。

但是，它需要高纯度的配体和专业的实验技能，而且对蛋白质的性质和配体的选择有较高的要求。

蛋白质层析法是一种用于分离和纯化蛋白质的技术，它基于蛋白质在不同条件下在固定相和流动相中的分配系数不同来实现分离。

层析技术的基本原理是将混合物中的各组分根据其物理或化学性质（如分子大小、电荷、亲和性等）在不同相中的不同分布和迁移速率来实现分离。

以下是一些常见的蛋白质层析技术：
1. **凝胶过滤层析（Gel Filtration Chromatography）**：
- 也称为分子筛层析，利用凝胶的多孔结构将分子按大小分离。

小分子可以进入凝胶内部的孔隙，而大分子则被排阻在外部，因此迁移速度不同。

2. **离子交换层析（Ion Exchange Chromatography）**：
- 根据蛋白质的电荷性质（如阴离子或阳离子交换树脂）来分离蛋白质。

带正电的蛋白质可以与阴离子交换树脂结合，而带负电的蛋白质则与阳离子交换树脂结合。

3. **亲和层析（Affinity Chromatography）**：
- 利用蛋白质与特定配体（如金属离子、生物大分子等）的特定相互作用来分离蛋白质。

4. **反相层析（Reverse Phase Chromatography）**：
- 基于蛋白质在不同极性溶剂中的不同保留行为来实现分离。

通常使用非极性固定相（如C-18柱）和极性流动相。

5. **尺寸排阻层析（Size Exclusion Chromatography，SEC）**：
- 也称为凝胶渗透层析，分离蛋白质混合物中的不同分子量蛋白质。

6. **疏水作用层析（Hydrophobic Interaction Chromatography，HIC）**：
- 利用蛋白质与固定相之间的疏水作用来分离蛋白质。

分离蛋白质的方法蛋白质是细胞组成的重要成分之一，具有多种功能，包括结构支持、运输物质、催化反应等。

为了研究蛋白质的结构、功能和相互作用，科学家们需要将蛋白质从混合复杂的生物样本中分离出来。

下面将介绍几种常见的蛋白质分离方法。

1. 盐析法（salting out）：盐采用其离子效应使溶液中的蛋白质凝聚沉淀，从而实现分离。

在盐析过程中，可以根据蛋白质的溶解特性选择适当的盐，并调节溶液pH值和离子强度。

最常用的盐是硫酸铵，其通过降低溶液中的溶剂活性从而促使蛋白质沉淀。

盐析方法适用于大多数蛋白质，但对于疏水性蛋白质效果较好。

2. 柱层析法（chromatography）：柱层析是一种流动相（mobile phase）和固定相（stationary phase）相互作用的分离技术，主要通过蛋白质与固定相之间的亲和性差异实现分离。

具体而言，柱层析可以根据蛋白质的大小、电荷、亲和性等特性，选择适当的柱填料和流动相，使不同的蛋白质在柱中有选择性地吸附和洗脱。

常用的柱层析方法包括凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等。

3. 电泳法（electrophoresis）：电泳是利用蛋白质在电场中的迁移率差异进行分离的技术。

根据蛋白质的电荷、质量、形状等特性，可选择不同类型的电泳方法。

常见的电泳方法有凝胶电泳、等电聚焦、二维电泳等。

其中，凝胶电泳是最常见的方法之一，可以通过调节凝胶浓度和类型，从而实现按照分子大小分离蛋白质的目的。

4. 离心法（centrifugation）：离心是通过调节离心速度和时间，利用不同蛋白质的沉降系数差异来分离蛋白质的方法。

离心可分为不同类型，如差速离心、密度梯度离心等。

差速离心适用于分离不同大小和形状的蛋白质，而密度梯度离心常用于分离不同密度的蛋白质。

此外，还有一些其他的分离方法，如过滤、萃取、固相萃取等。

这些方法可以根据研究的具体需求和样本的特性进行选择和组合，以实现高效、纯度较高的蛋白质分离。

蛋白质层析原理
蛋白质层析是一种常用的分离和纯化蛋白质的技术。

其原理基于蛋白质在不同条件下与固定相之间的相互作用差异。

层析柱内填充有具有特定性质的固定相，通常为聚合物凝胶或亲和性树脂。

当样品溶液通过层析柱时，蛋白质会根据其相互作用类型和特性与固定相发生不同程度的相互作用，从而实现分离和纯化。

根据蛋白质与固定相的相互作用类型不同，蛋白质层析可分为几种常见的类型，包括离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和性层析和逆向相层析。

离子交换层析利用蛋白质对固定相上带电离子交换作用的差异进行分离。

凝胶过滤层析则是根据蛋白质的大小选择性通过凝胶网孔的大小进行分离。

亲和性层析则利用蛋白质与特定配体之间的特异性结合作用进行分离。

逆向相层析则是根据蛋白质与固定相之间的亲水或疏水性质差异进行分离。

层析过程中，样品溶液先经过等离子体预处理以去除杂质物质，然后通过进样器加入层析柱。

通过改变流动相（即溶剂体系）、温度和pH等条件，可以调节蛋白质与固定相之间的相互作用，从而实现目标蛋白质的分离和纯化。

蛋白质可以通过梯度洗脱或者洗涤缓慢地从固定相中洗脱出来，不同分子量或特性的蛋白质被分离开来。

蛋白质层析是一种灵活、高效的蛋白质纯化技术，可以根据蛋白质的特性和需求选择不同的层析类型和条件，获得高纯度的蛋白质样品。

同时，与其他蛋白质纯化方法相比，层析技术对
蛋白质产量和质量的影响相对较小，因此广泛应用于生物医学、生物工程和生物化学等领域中的蛋白质研究和工业生产中。

根据分子大小分离蛋白质的层析技术蛋白质是生命体内重要的组成部分，在生命的各个过程中都发挥着至关重要的作用。

分离和纯化蛋白质，是开展蛋白质相关研究的前提和关键。

分子大小是影响蛋白质结构和功能的一个重要因素，因此，根据分子大小分离蛋白质的层析技术应用广泛。

胶体电泳是一种通过电场驱动带电粒子（涂层蛋白）在胶状介质中运动的技术。

随着电泳时间的推移，蛋白质会在胶体电泳中沿电场方向移动，并在不同位置出现带状。

这些带状代表了不同大小、电荷和形态的蛋白质，从而实现了蛋白质的分离和纯化。

凝胶过滤层析技术是基于蛋白质分子大小的一种分离技术。

它使用别称为Sephadex的高分子树脂作为填料，将蛋白质溶液通过柱子或柱状材料，使大分子蛋白质无法进入树脂孔隙，而小分子蛋白质则可以进入树脂孔隙内，从而实现了分离。

分子量越大的蛋白质会沿着柱子的表面流动，分子量较小的蛋白质会进入树脂颗粒内部，因此可以在凝胶孔隙中分子大小的差异进行分离。

离子交换层析技术是一种通过电荷相互作用分离蛋白质的技术。

该技术使用带正电或负电的固定颗粒，不同电荷的蛋白质会与固定颗粒进行相互作用。

通常情况下，具有相同荷负性的蛋白质将更紧密地结合于离子交换树脂中，并较难从中被洗脱出来。

使用不同盐浓度的溶液，可以通过离子交换层析进一步洗脱蛋白质。

亲和层析是一种利用蛋白质之间的特殊作用力进行分离的技术。

它是一种选择性纯化技术，通过特殊的柱子层析填料，将表面特异性结合的蛋白质吸附在固定颗粒的表面。

在分离过程中，具有特定亲和性的分子可以与填料表面固定的某些物质特异地结合。

与这些物质不结合的分子则在纯化过程中被排除。

亲和层析的优点是可以选择性纯化目标蛋白质。

总之，根据分子大小分离蛋白质的层析技术是一种重要的蛋白质分离和纯化技术。

通过不同的层析技术，可以针对不同的蛋白质特性实现利用分子大小、电荷和特殊作用力进行分离。

这些技术在学术研究、医学诊断和新药开发等领域都有广泛的应用。

分离提纯蛋白质的方法
分离和提纯蛋白质的常用方法包括蛋白质沉淀、凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析、逆向相层析、尺寸排斥层析、高效液相色谱等。

1. 蛋白质沉淀：通过加入盐、有机溶剂或酸、碱等试剂，使蛋白质沉淀，然后通过离心将沉淀与其他杂质分离。

2. 凝胶过滤：利用分子量筛选作用将蛋白质与其他小分子杂质分离。

常用的凝胶过滤介质包括聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等。

3. 离子交换层析：利用蛋白质表面的带电氨基酸残基与离子交换介质上的带电基团之间的静电吸附作用进行分离。

通过改变缓冲液的pH值和离子强度，可实现蛋白质与介质之间的亲和与解离。

4. 亲和层析：通过与特定亲和配体的结合，实现目标蛋白质与其他非特异性蛋白质分离。

常见的亲和配体包括金属离子、酶底物、抗体、受体等。

5. 逆向相层析：根据蛋白质在固定相（通常是疏水性）和移动相之间的亲疏水性差异进行分离。

通过改变溶剂的成分和温度，可以调节蛋白质的相互作用和分离程度。

6. 尺寸排斥层析：利用蛋白质的分子大小与填充剂的孔径之间的差异进行分离。

较大的蛋白质能够在填充剂孔径附近停滞，而较小的分子则可被填充剂穿过。

7. 高效液相色谱：是现代蛋白质分离和分析中最常用的技术之一。

通过改变流动相、填充剂和温度等参数，实现蛋白质的分离和纯化。

注意：在进行蛋白质的分离和提纯过程中，通常需要结合多种方法和步骤，以达到更高的纯度和纯化效果。

层析法分离蛋白质的原理你知道吗？蛋白质那可是生命的重要组成部分呢！而层析法就是分离蛋白质的一把好手。

咱先来说说层析法到底是咋回事。

想象一下，蛋白质就像是一群性格各异的小伙伴，它们都想找到自己的专属领地。

层析法呢，就像是一个神奇的大舞台，给这些小伙伴们提供了展示自己的机会。

在层析过程中，有一根柱子，这柱子就像是一个神秘的通道。

蛋白质们从通道的一端进入，开始了它们的冒险之旅。

不同的蛋白质有着不同的特点，就像不同的人有不同的性格一样。

有些蛋白质跑得快，有些跑得慢；有些喜欢往高处走，有些则喜欢在低处徘徊。

那为啥蛋白质们会有不同的表现呢？这就得说说层析法的原理啦。

就好比在一场赛跑中，有的选手身轻如燕，跑得飞快；有的选手则比较笨重，跑得慢些。

蛋白质也一样，它们的大小、形状、电荷等特性决定了它们在层析柱中的运动速度和方向。

比如说，凝胶过滤层析就像是一个筛子。

大的蛋白质过不去那些小孔，只能在外面溜达，所以跑得快；小的蛋白质则能钻进小孔里，东逛逛西逛逛，就跑得慢啦。

这不就像我们走路一样吗？走大路肯定比走小路快呀！离子交换层析呢，则是根据蛋白质的电荷来分离它们。

带正电荷的蛋白质会被吸附在带负电荷的柱子上，带负电荷的蛋白质则会被吸附在带正电荷的柱子上。

这就好像磁铁的两极，同性相斥，异性相吸。

你想想，要是两个脾气不对付的人，肯定不愿意待在一起吧？蛋白质也是这样呢。

还有亲和层析，这就更有意思啦。

它就像是一个专门为蛋白质准备的相亲大会。

柱子上有一些特定的配体，只有那些和配体“看对眼”的蛋白质才会被吸附住。

其他的蛋白质呢，就只能继续往前走啦。

这就像我们找对象一样，得有感觉才行呀！总之，层析法分离蛋白质的原理就是利用蛋白质的不同特性，让它们在不同的条件下表现出不同的行为，从而实现分离。

是不是很神奇呢？下次你再看到蛋白质的时候，会不会想起这个神奇的层析法呢？说不定你还能想象出蛋白质们在层析柱里的冒险故事呢！。

根据分子大小分离蛋白质的层析技术
层析技术（chromatography）是一种将混合物分离成单一组分的有效方法。

层析技术被广泛用于生物化学领域，特别是用于分离和纯化蛋白质。

分子大小层析技术是一种基于分子大小和形状差异分离蛋白质
的层析技术。

这种层析技术包括凝胶层析、透析、透析层析和分子筛层析等多种方法。

其中，凝胶层析是最常用的分子大小层析技术之一。

凝胶层析通过让混合物在凝胶柱中流动，根据蛋白质的分子大小和形状差异将蛋白质分离开来。

通常情况下，大分子会在凝胶柱中发现阻碍物，因此速度较慢；而小分子则可以较快地通过凝胶柱。

透析是另一种分子大小层析技术。

透析是通过半透膜将混合物分离开来。

半透膜可以过滤掉较大的蛋白质，但让较小的蛋白质通过。

因此，透析可用于分离较小的蛋白质。

透析层析结合了透析和层析技术。

这种技术既可以用于分离较小的蛋白质，也可以用于分离较大的蛋白质。

分子筛层析是根据分子的大小进行分离的技术。

这种技术使用的是具有特定孔径的分子筛材料。

大分子无法通过筛子而被留下，而小分子则可以通过筛子。

总之，分子大小层析技术是一种有效的蛋白质分离和纯化的方法。

根据需要选择合适的分子大小层析技术可以使其更加高效和准确。

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不同分子量蛋白质的分离—凝胶过滤层析法一、实验目的1. 了解凝胶柱层析的原理及应用。

2. 掌握凝胶柱层析的基本操作技术。

二、实验原理凝胶层析又称凝胶过滤，是一种按分子量大小分离物质的层析方法。

该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中，然后用缓冲液洗脱。

大分子不能进入凝胶颗粒中的静止相中，只留在凝胶颗粒之间的流动相中，因此以较快的速度首先流出层析柱，而小分子则能自由出入凝胶颗粒中，并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡，因此就要花费较长的时间流经柱床，从而使不同大小的分子得以分离。

凝胶过滤柱层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。

这种物质可以完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而对某些小分子化合物则不能排阻，但可让其在筛孔中自由扩散、渗透。

任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的程度可用分配系数Kav（被分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示。

Kav值的大小与凝胶床的总体积（Vt）、外水体积（Vo）及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关，即：Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo)在限定的层析条件下，Vt和Vo都是恒定值，而Ve值却是随着分离物分子量的变化而变化的。

分离物分子量大，Kav值小；反之，则Kav 值增大。

通常选用蓝色葡聚糖2000作为测定外水体积的物质。

该物质分子量大（为200万），呈蓝色，它在各种型号的葡聚糖凝胶中都被完全排阻，并可借助其本身颜色，采用肉眼或分光光度仪检测（210nm或260nm或620nm）洗脱体积（即Vo）。

但是，在测定激酶等蛋白质的分子量时，宜用蓝色葡聚糖2000测定外水体积，因为它对激酶有吸附作用，所以有时用巨球蛋白代替。

测定内水体积（Vi）的物质，可选用硫酸铵、N-乙酰酪氨酸乙酯，或者其它与凝胶无吸附力的小分子物质。

本实验使用血红蛋白（分子量64,500左右）和二硝基氟苯－鱼精蛋白（DNP－鱼精蛋白分子量12,000左右）的混合物，通过Sephadex G－25层析后达到分离。

蛋白质透析和分离技术蛋白质是生命的重要组成部分，其在细胞功能、代谢、信号传导等方面都具有重要作用。

因此，研究蛋白质的结构、功能、互作关系等问题是现代生命科学的热门领域。

然而，由于蛋白质具有高度复杂的分子结构和多样性，要想从混合物中分离纯化出纯的目标蛋白质是十分困难的。

为此，科学家们就发明了一些透析和分离技术，以便更好地研究蛋白质。

蛋白质透析技术是一种以蛋白质的分子大小和性质作为筛选目标的方法。

通常使用离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等技术进行透析。

其中离子交换层析是最常用的方法，主要是通过正离子或负离子的吸附作用吸附目标蛋白质，然后通过改变溶液的离子浓度或pH值以实现蛋白质分离。

凝胶过滤层析则是将混合物通过一个孔径超过蛋白质的凝胶柱，使大分子的混合物无法通过，实现分离。

亲和层析则是利用配体-受体的相互作用即蛋白质与 A相互作用，来特异性地分离目标蛋白。

蛋白质分离技术是一种将混合物中的各种成分一步步分离的技术。

常见的方法包括电泳分离、等电聚焦、二维凝胶电泳等。

其中，二维凝胶电泳是最常用的方法。

它利用凝胶电泳的分子大小筛选性和电荷不同的特性，通过两个维度的分离，实现蛋白质的高效分离。

第一维通常是以等电点为基础的等电聚焦，即利用电性来将具有不同等电点的蛋白质分离；第二维则是SDS-PAGE，即利用不同的分子量将蛋白质进一步分离。

这种方法不仅可以将蛋白质从混合物中分离出来，还能够确定其分子量和等电点，方便后续的其他实验研究工作。

总的来说，蛋白质透析和分离技术是生命科学中不可或缺的研究方法。

虽然这些技术在过去几十年中已经经历了巨大的发展，但现代的科学家们还需要不断地进行改进和完善，以更好地服务于研究蛋白质的目的，探索人类身体内各种蛋白质的结构、功能和互作关系，为保障人类的健康和生命做出贡献。

蛋白质的分离纯化技术1、根据蛋白质带电性质不同的分离技术1.1离子交换层析以离子交换剂作为柱填充物，在中性条件下，根据由于蛋白质和多肽的带电性不同而引起的离子交换亲和力的不同而得到分离。

其可分为阳离子柱和阴离子柱两大类, 还有一些新型树脂，如大孔型树脂、均孔型树脂、离子交换纤维素、葡聚糖凝胶琼脂糖凝胶树脂等。

离子交换剂有阳离子交换剂和阴离子交换剂。

当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，带有与离子交换剂可交换基团相同电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，带同种净电荷越多，吸附力越强。

随后用改变pH或离子强度的办法将吸附的蛋白质按吸附能力从小到大的顺序先后洗脱下来。

1.2电泳法电泳为带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象。

蛋白质混合样品经过电泳后，被分离的各蛋白质组分的电泳迁移率互不相同，由各蛋白质组分所带的静电荷以及分子大小和形状的不同而达到分离。

现在常用的聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），可以因不同蛋白质所带电荷的差异和大小差异高分辨率地分离或分析蛋白质。

在PAGE系统中加入十二烷基磺酸钠（SDS）,可以消除蛋白质所带电荷的差异，构成的SDS-PAGE系统是测定蛋白质的相对分子质量最常用的方法。

2、根据蛋白质溶解度不同的分离技术2.1蛋白质的盐析蛋白质在低盐浓度下的溶解度随着盐溶液浓度升高而增加，此称盐溶；当盐浓度不断上升时，蛋白质的溶解度又以不同程度下降并先后析出，此称盐析，从而达到分离纯化的效果。

2.2有机溶剂沉淀法有机溶剂能降低溶液的介电常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导致溶解度的降低；另有机溶剂与水的作用，能破坏蛋白质的水化膜，故蛋白质在一定浓度的有机溶剂中便沉淀析出。

近年来的研究认为，有机溶剂可能破坏某种键如氢键，使空间结构发生变化，致使一些原来包在内部的疏水集团暴露于表面并与有机溶剂的疏水基团结合形成疏水层，从而使蛋白质沉淀。

利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中的溶解度差异而分离的方法即为有机溶剂沉淀法。

不同分子量蛋白质的分离——凝胶柱层析法目的要求（1）了解凝胶柱层析的原理及应用。

（2）掌握凝胶柱层析的基本操作技术。

实验原理凝胶层析又称凝胶过滤，是一种按分子量大小分离物质的层析方法。

该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中，然后用缓冲液洗脱。

大分子不能进入凝胶颗粒中的静止相中，只留在凝胶颗粒之间的流动相中，因此以较快的速度首先流出层析柱，而小分子则能自由出入凝胶颗粒中，并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡，因此就要花费较长的时间流经柱床，从而使不同大小的分子得以分离。

凝胶过滤柱层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。

这种物质可以完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而对某些小分子化合物则不能排阻，但可让其在筛孔中自由扩散、渗透。

任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的程度可用分配系数Kav（被分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示。

Kav值的大小与凝胶床的总体积（Vt）、外水体积（V o）及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关，即：Kav= (Ve-V o)/(Vt-V o)在限定的层析条件下，Vt和V o都是恒定值，而Ve值却是随着分离物分子量的变化而变化的。

分离物分子量大，Kav值小；反之，则Kav值增大。

通常选用蓝色葡聚糖2000作为测定外水体积的物质。

该物质分子量大（为200万），呈蓝色，它在各种型号的葡聚糖凝胶中都被完全排阻，并可借助其本身颜色，采用肉眼或分光光度仪检测（210nm或260nm或620nm）洗脱体积（即V o）。

但是，在测定激酶等蛋白质的分子量时，宜用蓝色葡聚糖2000测定外水体积，因为它对激酶有吸附作用，所以有时用巨球蛋白代替。

测定内水体积（Vi）的物质，可选用硫酸铵、N-乙酰酪氨酸乙酯，或者其它与凝胶无吸附力的小分子物质。

本实验使用血红蛋白（分子量64,500左右）和二硝基氟苯－鱼精蛋白（DNP－鱼精蛋白分子量12,000左右）的混合物，通过Sephadex G－25层析后达到分离。