蛋白质分离技术(全)

生物蛋白质分离知识点归纳总结蛋白质分离是生物化学和分子生物学研究中的重要技术。

它涉及到从复杂的生物样本中提取、纯化和分析蛋白质。

以下是对蛋白质分离技术的一些关键知识点的归纳总结：1. 蛋白质分离的原理：- 分子大小：利用不同蛋白质的分子量差异，通过凝胶过滤层析进行分离。

- 电荷差异：通过离子交换层析，根据蛋白质在不同pH值下的电荷差异进行分离。

- 疏水性：利用疏水相互作用层析，根据蛋白质的疏水性强弱进行分离。

- 亲和力：通过亲和层析，利用特定配体与目标蛋白质的亲和力进行分离。

2. 常用的蛋白质分离技术：- 凝胶过滤层析（Size Exclusion Chromatography, SEC）：根据蛋白质的大小进行分离，大分子先流出，小分子后流出。

- 离子交换层析（Ion Exchange Chromatography, IEC）：根据蛋白质的电荷差异进行分离，正电荷的蛋白质在低pH下吸附，负电荷的蛋白质在高pH下吸附。

- 疏水相互作用层析（Hydrophobic Interaction Chromatography, HIC）：根据蛋白质的疏水性进行分离，疏水性较强的蛋白质先被吸附。

- 亲和层析（Affinity Chromatography）：利用特定的配体与目标蛋白质的高亲和力进行特异性分离。

- 电泳技术：如SDS-PAGE，根据蛋白质的分子量进行分离。

3. 蛋白质分离的策略：- 预处理：包括细胞破碎、蛋白质提取和初步纯化。

- 多步骤纯化：通常需要通过多种层析技术组合，逐步提高蛋白质的纯度。

- 分析与鉴定：利用质谱等技术对纯化后的蛋白质进行鉴定和定量分析。

4. 蛋白质分离的影响因素：- 蛋白质的稳定性：在分离过程中需要考虑蛋白质的稳定性，避免变性或降解。

- 缓冲液的选择：缓冲液的pH值、离子强度和组成都会影响蛋白质的分离效果。

- 温度和压力：温度和压力的变化会影响蛋白质的折叠状态和相互作用，进而影响分离效果。

蛋白质的分离纯化蛋白质是生命体中最基本的分子之一，它在细胞内发挥着重要的功能。

由于蛋白质的复杂性和多样性，研究人员通常需要从复杂的混合物中分离和纯化蛋白质。

蛋白质的分离纯化是生物化学和生物技术领域中非常重要的一项工作，它为我们深入研究蛋白质的结构和功能提供了必要的条件。

蛋白质的分离纯化可以通过多种不同的方法实现，这些方法包括离心法、凝胶过滤法、电泳法、层析法等。

在选择合适的方法时，研究人员需要考虑到蛋白质的特性以及实验的要求。

离心法是最常用的分离方法之一，在离心过程中，通过调整离心力和离心时间，可以实现不同密度的蛋白质的分层。

这种方法适用于分离大分子量的蛋白质。

凝胶过滤法是利用孔径不同的凝胶将蛋白质分离开来。

通常使用的凝胶有琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶，这些凝胶具有不同的孔径，可以根据蛋白质的分子量选择合适的凝胶进行分离。

电泳法是基于蛋白质的电荷和分子量差异而进行分离的方法。

最常用的电泳方法是SDS-PAGE电泳，通过使用SDS（十二烷基硫酸钠）对蛋白质进行解性和蛋白质间的形成复合物，使得蛋白质在电泳过程中仅仅受到电场力的影响，从而实现蛋白质的分离。

层析法是一种利用物质在载体上的分配和吸附性质进行分离的方法。

常见的层析方法有凝胶层析、亲和层析、离子交换层析等。

凝胶层析是通过利用载体颗粒的孔径进行分离，亲和层析是将特定配体固定在载体上，与目标蛋白质结合，从而实现分离，而离子交换层析是利用载体表面电荷与目标蛋白质的电荷相互作用进行分离。

在进行蛋白质的分离纯化时，需要注意以下几个关键步骤。

首先是样品制备，通常样品要经过细胞破碎、蛋白质提取等步骤，使得目标蛋白质从复杂的混合物中提取出来。

其次是样品的处理，包括去除杂质、调整蛋白质的溶液环境等。

然后是选择合适的分离方法，根据蛋白质的特性和实验要求来确定最适合的方法。

最后是纯化过程中的监测和分析，通过使用各种蛋白质分析方法，如SDS-PAGE、Western blot等，来确定目标蛋白质的纯化程度和鉴定其存在。

蛋白质分离纯化的技术前言蛋白质是生物体内非常重要的大分子有机物质，具有各种生物学功能，如结构支持、催化反应、传递信息、运输物质及免疫防御。

而蛋白质的研究和应用，早已成为生命科学的热门领域。

然而，大多数生物体中的蛋白质都混杂着众多的其他大分子物质，为了研究或应用某种特定蛋白质，就需要将它从其它物质中分离纯化出来。

今天我们就要来讲一讲蛋白质分离纯化的技术。

一、蛋白质分离的基本原理蛋白质分离的基本原理是利用不同的性质来分离具有不同特性的蛋白质。

蛋白质的各种性质包括分子大小、分子形状、电荷、亲疏水性、氨基酸序列等。

根据这些不同的性质，分别选择不同的分离纯化方法，可以实现不同程度的分离纯化效果。

二、蛋白质分离纯化技术的分类根据分离方式的不同，蛋白质分离纯化技术可以分为以下几类：1. 分子筛层析：分子筛层析是根据蛋白质的分子大小、形状来进行分离，其原理是在一定的缓冲液中，将特定孔径大小的陶瓷或聚合物微球填充进层析柱，根据蛋白质的分子大小，从层析柱中流出不同的蛋白质。

这种方法可以使蛋白质得到较好的分离纯化，但需要考虑蛋白质的保护。

2. 表面等电聚焦（IEF）：表面等电聚焦是根据蛋白质的等电点来进行分离，其原理是在聚丙烯酰胺凝胶电泳板上加上一组垂直于电泳方向的电场，在酸性一端放置一种酸性缓冲液，碱性一端放置一种碱性缓冲液，中间分别加入样品，蛋白质会在等电点处停留，使得不同等电点的蛋白质得到了分离和收获。

这种方法可以进行多品种、高分辨率的蛋白质分离。

3. 亲和层析：亲和层析是根据蛋白质与其他化合物的特异性相互作用进行分离，其原理是特定的化合物置于层析柱中，当特定的蛋白质与化合物结合时，蛋白质就可以纯化出来。

如在层析柱中放入钙离子，就可以纯化出骨钙蛋白，并且可以通过控制钙离子浓度来实现蛋白质的分离。

4. 透析：透析是将样品分子分离于透析膜之内或之外的方法。

通常将混合物放置于透析袋内，在培养基、缓冲液等适当环境中，透析袋内的小分子会从透析膜渗透出去，而较大的蛋白质则被留在透析袋内。

蛋白质分离和纯化技术的研究和应用蛋白质是生物体内最基本的分子，其担负着细胞结构与功能、物质转运、信号传递等重要生理功能。

由于生物样品中蛋白质种类众多、含量差异较大，为了深入揭示蛋白质的生物学功能和结构特性，必须对蛋白质进行精确分离和纯化。

本文将介绍蛋白质分离和纯化技术的研究和应用。

一、蛋白质分离技术蛋白质分离是指将复杂的蛋白质混合物进行分离，得到不同种类的纯化蛋白质的过程。

在蛋白质分离的基础上，再进行进一步纯化，能够更好地揭示蛋白质的生物学特性。

（一）凝胶电泳凝胶电泳是当前最常用的蛋白质分离技术之一。

它基于蛋白质的电荷、大小、形状和亲疏水性等性质，利用电场将蛋白质分子沿着凝胶移动，实现分子大小的分离。

凝胶电泳具有分离效果好、操作简单易行、样品消耗量小以及可视化等优点。

（二）液相色谱液相色谱（Liquid chromatography）是一种通过化学亲和性、分子大小、极性与非极性等属性分离物质的分离技术。

常用的液相色谱有透析液相色谱、醚基、硅烷基、反相、离子交换、凝胶过滤等类型。

其中反相色谱在蛋白质分离中尤为重要，它基于不同蛋白质在疏水性基质表面的分配系数不同，以蛋白质的亲水性为基础进行分离。

二、蛋白质纯化技术蛋白质纯化是指在获得蛋白质的基础上，通过不同的纯化技术去除其中的杂质，得到纯度高的蛋白质分子。

蛋白质的纯化技术主要分为两类：非特异性纯化和特异性纯化。

（一）非特异性纯化非特异性纯化是指利用物理化学性质对样品进行分步纯化，将目标分子与混杂物质逐步分离开来的方法。

常用的非特异性纯化技术有盐析、凝胶过滤和透析等。

其中，盐析技术是常用的一种非特异性纯化技术，它利用富集目标蛋白质对盐的结合能力高于混杂蛋白质的特性，将混杂蛋白质和目标蛋白质分离。

（二）特异性纯化特异性纯化是指通过蛋白质与配体、抗体等生物学活性团之间的特异作用进行分离纯化的方法。

常用的特异性纯化技术包括亲和层析、免疫亲和层析等。

其中，亲和层析是一种重要的特异性纯化技术，它通过识别目标蛋白质与固定于固相材料上的亲和基团之间的特异性互作来分离纯化蛋白质。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白技术SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)是对蛋白质进行量化,比较及特性鉴定的一种经济,快捷,而且可重复的方法,该法主要依据蛋白质的分子量对其进行分离.【实验目的】掌握用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离不同蛋白质的方法.【实验原理】SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是蛋白分析中最经常使用的一种方法.它是将蛋白样品同离子型去垢剂十二烷基硫酸钠(SDS）及巯基乙醇一起加热，使蛋白变性，多肽链内部及肽键之间的二硫键被还原，肽键被打开，打开的肽键靠疏水作用与SDS结合而带负电荷，电泳时在电场作用下，肽链在凝胶中向正极迁移。

不同大小的肽链由于在迁移时受到的阻力不同，在迁移过程中逐渐分开，其相对迁移率与分子量的对数间成线形关系。

【实验器材与试剂】一,仪器垂直板电泳槽及配套的玻璃板,梳子,电泳仪,干式恒温培养器,微波炉等.二,材料蛋白样品,蛋白标准品,EP管三，试剂1,1.5mol/L Tris-HCL Ph8.8（已加SDS）2,0.5mol/L Tris-HCL pH6.8（已加SDS）3,10％SDS4,30％丙烯酰胺（Acr/Bis）溶液：29.2g丙烯酰胺（Acr）+0.8g甲叉双丙烯酰胺(Bis)，用双蒸水定容至100ml，过滤备用，4℃下存放。

5,10％过硫酸铵（AP）（-20℃存放）6, 2×样品缓冲液0.5mol/L Tris-HCL Ph6.8 2ml甘油 2ml20％SDS 2ml0.1％溴酚蓝 0.5mlβ-巯基乙醇 2~1.0ml双蒸水 2.5ml7, 5×电泳缓冲液T ris 7.5gGly 36gSDS 2.5g双蒸水溶解，定容至500ml，使用时稀释5倍。

8，染色液：0.2考马斯亮蓝R250+84ml95％乙醇+20ml 冰醋酸，定容至200ml，过滤备用9，脱色液：V（乙醇）:V(冰醋酸)：V（水）=7.5:7.5:85【实验内容】一，聚丙烯酰胺凝胶的配制1，分离胶（10％）的配制：双蒸水 4.0ml30％Acr/Bis 3.3ml1.5mol/LTris-HCL2.5ml10％SDS 0.1ml10％AP 0.1ml取1ml上述混合液，加TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)10μL封底，余加TEMED 4μL，混匀后灌入玻璃板间，以水封顶，注意使液面齐平，凝胶完全聚合需30~60min2，浓缩胶（4％）的配制：双蒸水 1.4ml30％Acr /Bis 0.33ml1mol/L Tris-HCL 0.25ml10％SDS 0.02ml10％AP 0.02mlTEMED 2μL将分离胶上的水倒去，加入上述混合液，立即将梳子插入玻璃板间，完全聚合15~30min。

分离纯化蛋白质的方法及原理（二）利用溶解度差别影响蛋白质溶解度的外部因素有：1、溶液的pH；2、离子强度；3、介电常数；4、温度。

但在同一的特定外部条件下，不同蛋白质具有不同的溶解度。

1、等电点沉淀：原理：蛋白质处于等电点时，其净电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀。

因此在其他条件相同时，他的溶解度达到最低点。

在等电点之上或者之下时，蛋白质分子携带同种符号的净电荷而互相排斥，阻止了单个分子聚集成沉淀，因此溶解度较大。

不同蛋白质具有不同的等电点，利用蛋白质在等电点时的溶解度最低的原理，可以把蛋白质混合物分开。

当pH被调到蛋白质混合物中其中一种蛋白质的等电点时，这种蛋白质大部分和全部被沉淀下来，那些等电点高于或低于该pH的蛋白质则仍留在溶液中。

这样沉淀出来的蛋白质保持着天然的构象，能重新溶解于适当的pH和一定浓度的盐溶液中。

5、盐析与盐溶：原理：低浓度时，中性盐可以增加蛋白质溶解度这种现象称为盐溶.盐溶作用主要是由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质与水分子之间的相互作用却加强，因而溶解度增高。

球蛋白溶液在透析过程中往往沉淀析出，这就是因为透析除去了盐类离子，使蛋白质分子之间的相互吸引增加，引起蛋白质分子的凝集并沉淀。

当溶液的离子强度增加到一定程度时，蛋白质溶解程度开始下降。

当离子强度增加到足够高时，例如饱和或半饱和程度，很多蛋白质可以从水中沉淀出来，这种现象称为盐析。

盐析作用主要是由于大量中性盐的加入使水的活度降低，原来溶液中的大部分甚至全部的自由水转变为盐离子的水化水。

此时那些被迫与蛋白质表面的疏水集团接触并掩盖他们的水分子成为下一步最自由的可利用的水分子，因此被移去以溶剂化盐离子，留下暴露出来的疏水基团。

蛋白质疏水表面进一步暴露，由于疏水作用蛋白质聚集而沉淀。

盐析沉淀的蛋白质保持着他的天然构象，能再溶解。

盐析的中性盐以硫酸铵为最佳，在水中的溶解度很高，而溶解度的温度系数较低。

蛋白质色谱分离技术
蛋白质色谱分离技术是一种常用的蛋白质分离纯化技术，主要依据蛋白质的特定位点的差异进行分离。

该技术主要包括以下几种：
1. 凝胶过滤色谱（Gel filtration chromatography，GFC）：也称为尺寸排阻色谱（size exclusion chromatography，SEC）。

这种技术根据分子的流体动力学体积或大小差异来进行分离，适用于分离纯化蛋白质（包括酶类）、核酸、多糖、激素、氨基酸和抗生素等物质。

同时，这种技术也可以用于测定蛋白质的分子量。

通过单一凝胶床可以将分子大小相差25％的样品完全分开。

此外，凝胶过滤色谱还可以用于样品的浓缩和脱盐去热源和脱色等。

2. 亲和色谱：这是蛋白质检测中最专一的分离技术，可以从复杂的混合物中直接分离出目标蛋白质分子。

3. 疏水相互作用色谱（Hydrophobic Interaction Chromatography，HIC）：这种技术利用样品中各组份与色谱填料上配基相互作用力的差异，在洗脱时由于各组份移动速度的不同而达到分离的目的。

其分离机制类似于反相液相色谱，只是用水性缓冲液代替了有机溶剂。

每种蛋白质色谱分离技术都有其独特的应用和限制，因此在选择和应用时需要根据具体情况进行考虑。