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蛋白质纯化与层析技术蛋白质纯化是生物化学和生物技术领域中至关重要的过程，用于从混合物中分离和纯化目标蛋白质。
层析技术作为蛋白质纯化的关键步骤之一，它不仅可以选择性地将目标蛋白质从混合物中分离出来，还可以去除杂质，获得高纯度的蛋白质样品。
一、蛋白质纯化的基本原理蛋白质纯化的基本原理是根据不同的理化性质，如分子量、极性、电荷等特征，选择合适的纯化方法分离目标蛋白质。
常见的蛋白质纯化方法包括离心、超滤、电泳、沉淀和层析等。
离心法是通过调整离心速度和时间，根据不同蛋白质的分子量和密度差异，将目标蛋白质和非目标蛋白质分层离心，进而实现纯化。
超滤法则是利用滤膜对溶液进行筛选分离，减少蛋白质和其他分子之间的尺寸和质量差异，从而实现蛋白质的纯化。
电泳法是根据蛋白质在电场中不同的电荷和分子量特性，使其在凝胶上移动的速度不同，从而实现纯化和分离。
沉淀法则是通过添加适当的沉淀剂，使蛋白质凝聚成颗粒，经过离心后分离出来。
而层析法是根据蛋白质与层析介质之间的相互作用，通过选择性吸附和洗脱，将目标蛋白质从混合物中纯化出来。
二、层析技术的分类与原理层析技术是在纯化过程中广泛使用的方法，根据不同的工作原理和介质特性，可以将其分为几种不同的类型。
常见的层析技术包括吸附层析、凝胶层析、亲和层析和离子交换层析等。
吸附层析是通过目标蛋白质与特定层析介质之间的亲和力，使目标蛋白质被吸附在介质上，从而实现纯化。
凝胶层析则是利用介质中多孔性凝胶矩阵的分子筛效应，根据蛋白质的分子量和形状特征，通过不同的渗透效应将目标蛋白质分离出来。
亲和层析是利用目标蛋白质与特定配体（如抗体）之间的特异性结合，使目标蛋白质选择性地与介质上的配体结合，从而实现纯化。
离子交换层析则是基于蛋白质表面的电荷特性，通过电荷间的相互作用，使目标蛋白质与介质表面的离子互相吸附和洗脱，实现纯化。
三、层析技术的操作步骤和优化层析技术的操作步骤通常包括前处理、样品加载、洗脱和再生等步骤。
第五节层析技术简介蛋白质分离纯化中的层析技术是基本工具⏹层析（chromatography）是最有效的分离手段，也是最重要的蛋白质纯化工具。
层析主要是物理方法，是混合熵减少的过程，必然消耗自由能。
⏹基因工程下游的核心是层析。
⏹层析技术的理论与实践已高度发展和完善。
层析的概念在把微细分散的固体或是附着于固体表面的液体作为固定相，把液体（与上述液体不相混合的）或气体作为移动相的系统中，使样品中的各成分边保持向两相分布的平衡状态边移动，利用各成分对固定相亲和力不同所引起的移动速度差，将它们彼此分离开的定性与定量分析方法，称为层析，亦称色谱法。
根据移动相种类的不同，分为液体层析、气体层析二种。
层析的类型◆分配层析：固定相与流动相之间对待分离组分溶解度的差异来实现分离。
◆吸附层系：利用被分离组分对固定相表面吸附中心吸附的能力的差别即吸附系数的差别而实现分离。
如亲和、疏水、金属螯合、离子交换等相关杂质◆目标产物相关杂质：聚集体（抗体）、片段◆过程相关杂质和污染物：宿主细胞蛋白：免疫测定宿主细胞DNA：DNA杂交、QPCR、DNA结合预知分析、荧光测定-picogneen细胞培养基蛋白质：病毒：QPCR、电子显微镜、体内体外分析（逆转录酶）微生物：生菌数实验、内毒素实验◆其他种类杂质或污染物：层析柱、容器的沥出物；可抽提物；细胞培养基组分；纯化中使用的试剂；蛋白质层析介质基体须具备的特性◆生物兼容性：亲水性，大孔径不会使生物大分子失活，没有生物化学毒性--过强吸附，泄漏.◆化学稳定性：在生物大分子存在的化学条件下是稳定的。
pH,络合物,氧化还原性,巯基化合物……◆必要的机械性能: 流体中的耐压性，弹性化学组成: 亲水多孔高聚物等◆天然高分子多糖:纤维素、交联葡聚糖、琼脂糖及其共聚物----孔径分布宽、较软◆合成高聚物:聚丙烯酰胺类、聚丙烯酸脂类、聚乙二醇聚、丙烯酸脂共聚物、亲水性处理的聚苯乙烯类（都是交联大孔高聚物）◆无机化合物: 硅胶、羟基磷灰石、氧化锆聚合物基体(matrix)孔的结构◆多孔结构：内表面占整个表面积的95% 以上◆孔径分布: 分配层析要求分布宽、均匀，相应于低交联度◆高交联度导致孔径分布偏向高，介质本身微观不均匀性变大，适合大孔径高硬度吸附层析孔的结构可分为三种类型标志产品:◆SepharoseHP,ToyopearlSepharoseHP,Toyopearl;MacroPrep,UNOSphere,FractogelEMD,SourceMacroPrep,Source ◆UNOQUNOQ，POROSBeads 结构：典型层析介质的放大观察Confocal Microscopy ImagesMonolith 结构示意图方案的特点◆捕获（Capture）：离子交换、疏水、金属螯合、亲和、分配层析◆中间纯化：离子交换、疏水、金属螯合、亲和、分配层析◆精制：离子交换、疏水、金属螯合、亲和、分配层析◆样品中的污染物：核酸、胆固醇、甘油三脂、磷脂、脂肪酸、小分子络合物、金属离子◆层析步骤间的过渡方式：如离子交换接疏水动物组织中蛋白质的例子◆组织匀浆1:4（w/v）◆匀浆后蛋白浓度：5mg/ml （如植物要低）◆目标蛋白浓度：0.001mg/mlE.Coli表达例子◆E.Coli表达蛋白：10菌体/1培养基◆抽提蛋白中目标蛋白为10%◆1:4（w/v）抽提蛋白为30mg/ml◆产量为150mg/ml◆目标蛋白浓度：3mg/ml细胞培养上清的例子◆蛋白质浓度（含血清培养基）：4mg/ml ◆IgG总浓度：0.8mg/ml◆目标IgG浓度：0.03mg/ml电泳分析的样品制备原则◆电泳检测贯穿整个纯化过程◆上样缓冲液对蛋白质的溶解性要高于抽提液，否则拖尾。
蛋白质层析法是一种用于分离和纯化蛋白质的技术，它基于蛋白质在不同条件下在固定相和流动相中的分配系数不同来实现分离。
层析技术的基本原理是将混合物中的各组分根据其物理或化学性质（如分子大小、电荷、亲和性等）在不同相中的不同分布和迁移速率来实现分离。
以下是一些常见的蛋白质层析技术：
1. **凝胶过滤层析（Gel Filtration Chromatography）**：
- 也称为分子筛层析，利用凝胶的多孔结构将分子按大小分离。
小分子可以进入凝胶内部的孔隙，而大分子则被排阻在外部，因此迁移速度不同。
2. **离子交换层析（Ion Exchange Chromatography）**：
- 根据蛋白质的电荷性质（如阴离子或阳离子交换树脂）来分离蛋白质。
带正电的蛋白质可以与阴离子交换树脂结合，而带负电的蛋白质则与阳离子交换树脂结合。
3. **亲和层析（Affinity Chromatography）**：
- 利用蛋白质与特定配体（如金属离子、生物大分子等）的特定相互作用来分离蛋白质。
4. **反相层析（Reverse Phase Chromatography）**：
- 基于蛋白质在不同极性溶剂中的不同保留行为来实现分离。
通常使用非极性固定相（如C-18柱）和极性流动相。
5. **尺寸排阻层析（Size Exclusion Chromatography，SEC）**：
- 也称为凝胶渗透层析，分离蛋白质混合物中的不同分子量蛋白质。
6. **疏水作用层析（Hydrophobic Interaction Chromatography，HIC）**：
- 利用蛋白质与固定相之间的疏水作用来分离蛋白质。
