PCV1和PCV2在原代猪肝细胞和肾细胞培养中的感染力
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PCV1和PCV2在原代猪肝细胞和肾细胞培养中的感染力
摘要：通过与PCV在初代肾细胞培养中的感染力的对比，检测PCV2和PCV1在猪肝脏细胞的感染力。感染了PCV2的肝脏细胞培养物的病毒滴度比PCV1感染的肝脏细胞的病毒滴度和PCV感染的肾脏细胞病毒滴度要高。用免疫组织化学和原位杂交检测可得PCV2感染的肝脏细胞培养物的病毒阳性细胞数量最多。我们的数据结果表明PCV2更可能感染培养的肝脏细胞正如在患有PMWS猪的肝脏中观察到的那样。
关键词：感染性，猪圆环病毒，初级肝脏细胞培养物
PCV在1974年被认作是一种PK-15猪肾细胞系污染物被第一次发现。PCV现在被认做是PCV1型而且对猪是没有致病性的。相反地，PCV2从天然发生的和在实验上的PMWS猪中被分离。在很多例PMWS中，临床症状在地5-12周出现，以渐进性体重下降，呼吸困难，明显的淋巴细结病，和少数的苍白，下泄，黄疸。与PCV2感染相关的病变包括肉芽肿淋巴结炎，间质性肺炎，肝炎，肾炎，肠炎和胰腺炎。在很多PMWS病例中，淋巴结炎和肝炎是最行间的病变。因为在患有PMWS的肝脏病变中，肝坏死和肝细胞凋亡已经被发现，肝细胞看起来像是PCV2感染的靶细胞。在胎儿时期，心肌细胞，肝脏细胞，和巨噬细胞是PCV2的主要靶细胞。在我们目前的研究中，通过对小猪接种患有PMWS猪的匀浆物重现了淋巴结炎和肝炎。这次实验的目的是确认PCV2是否如在PMWS感染猪中所观察到的可以感染原代猪肾细胞培养物。
雄性SPF NIBS迷你猪，1-45日龄，从动物研究站获得。SPF NIBS迷你猪PCV1和PCV2抗原阴性。所有本实验的动物操作符合NIBS的实验动物护理和使用指导方针。原代猪肝细胞用改良的标准两步胶原分散酶灌注然后差速离心的方法分离提取。简要地说，肝脏通过门静脉用胶原酶-分离酶灌注，使肝细胞分散，然后在PBS（PH7.2）中50×g离心三次使细胞沉淀，使最终密度为5×105个细胞每毫升包含10%的胎牛血清的Williams’E媒介，37度保存（5%CO2）。细胞悬浮液通常包含大约90-95%的完整的肝脏细胞，只有大概1-2%的间充质细胞。95%的的细胞形态学上看起来像肝细胞。平板接种4小时后，用新鲜的Williams’培养基E（10-7M的胰岛素，10-9M的地塞米松，20ng/ml的表皮生长因子，10%FBS）更换旧的培养基，细胞培养物在接种前孵育直到有一半的长满细胞。此外，肝脏病毒感染力与肾脏的进行对比。将肾脏细胞组织块切碎，然后用酶和离心机进行分离。圆形的细胞在含有10%FBS的MEM培养液中再悬浮，浓缩是浓度为5×105个细胞/ml，37度（5%CO2）孵育，直到细胞长的半满，然后接种。
这次实验的PCV2接种物和以前所用的一样。简要的说，在诊断为患有PMWS的猪的淋巴组织匀浆中分离接种物（103.0TCID50/ml）。通过PCR可以检测出PCV2接种物没有PCV1和PRRSV。通过血凝试验，可以证明PCV2接种物不含PPV。PCV1接种物通过持续接种PCV1的PK-15细胞培养液中提取，并且培养液滴度为103.0TCID50/ml。培养基(MEM)用作对照组。
原代培养细胞接种病毒或者同体积的培养基。37度接种后一小时，去除培养基，对细胞进行清洗，然后加入新鲜培养基。接种后2、3、4天，用含有4%PFA的PBS（PH7.2）固定细胞。用超免的猪抗PCV1或者PCV2血清来做免疫组织化学实验。IHC和ISH的操作步骤与之前的类似。在接种后指定时间计数肝脏和肾脏培养基内的PCV阳性细胞。将阳性细胞在所有细胞中的百分比在5个低于40×放大的领域中标会出来。PCV滴度由一系列10倍稀释的PK-15细胞培养物接种物决定。在3dpi，用高免的猪抗PVC1和PCV2血清对细胞做免疫组织化学染色。
为了检查在原代PCV感染的肝细胞培养物的致细胞病变效应（CPE），使用长期的肝细胞培养法。对于这个实验，用一头一日龄的雄性SPF NIBS迷你猪。在直径为60mm的胶原蛋白包被的培养皿中37度用上述方法收集肝细胞。平板接种4小时后，用PCV1或者PCV2接种物感染肝细胞。对照组用相同体积的MEM培养基。37度接种一个小时后，用培养基冲洗细胞，然后接入新的培养基。每两天换一次液，持续培养10天。在接种后0、2、4、6、8、10天，用含有4%的PFA的PBS液固定。用IHC计算PCV阳性细胞在所有肝脏细胞中的百分比。γ谷胺酰转肽酶（γ-GT）的在培养基中的活性自动化分析法来确定，这种方法由日本临床化学学会提供。
无细胞病毒在原代猪肝脏和肾脏细胞培养液中都检测出来。在原代肾细胞培养物中PCV滴度在整个观察期都处于较低水平。相反，在原代肝脏细胞培养物中，PCV滴度在接种后第二天开始增加，在第三天达到峰值，此后逐渐慢慢增加。在整个实验过程中，感染PCV2病毒的肝脏细胞培养物滴度比PCV1感染的要高。不同培养皿的实验结果相一致。
PCV抗原在原代肝脏和肾脏细胞中都检测到。在肝脏细胞中，PCV阳性细胞和数量和抗原数量比肾脏细胞明显要高。PCV2感染的肝脏细胞明显比PCV1要高。PCV2阳性肝脏细胞所占比率从13%到17%。相反，PCV1标记的肝细胞占总细胞的2%。在原代培养肾脏细胞中，只有不到2%的细胞有PCV1或者PCV2。在PCV阳性的肝脏细胞和肾脏细胞中，病毒抗原在细胞质和细胞核中都可以发现。没有感染的细胞PCV1和PCV2抗原阴性。在ISH研究中，含有PCV的细胞核酸在原代肝脏细胞培养物中可以观察到。局部阳性杂交信号与病毒抗原相符合。在接种了PCV后CPE没有在肝脏和肾脏细胞中发现。
尽管PCV1和PCV2抗原在长期培养的肝脏细胞中能够发现，但是PCV2阳性细胞比PCV1阳性细胞要多。接种后十天，PCV2阳性细胞逐渐增加到占总细胞大约20%。相反，PCV1阳性细胞在整个实验过程中都少于2%。在PCV感染的肝脏细胞中γ-GT活性与对照组相似。在培育的10天中，PCV2感染或者没有感染的肝脏细胞中没有明显的CPE。
肾脏，肝脏，和肺脏是感染了PMWS猪中PCV2的主要靶器官。在体外培养中，接种PK-15细胞可以最好的完成PCV复制。当PCV感染力在猪原代肝脏和肾脏细胞培养物中进行检测时，肝脏细胞比肾脏细胞对PCV更敏感。
PCV1通常被认作是不致病的病毒。先前的报道称在感染了PCV1的实验猪没有肉眼和微观损伤。尽管如此，PCV1抗原在主要在脾脏，淋巴，肾脏中发现，肝脏中也有少量。相反，88%的自然感染PMWS的猪含有程度不一的肝炎，70%的肝脏含有PCV2核酸。结果证明肝脏是PCV2感染的主要靶器官。肝脏损伤有可能是PMWS的致病因素。PCV2感染的细胞包括枯否细胞，肝脏细胞，炎症浸润。实验数据反映出PCV2在数量上和易感性上都要比PCV1具有优势。
PCV2缺少自己的DNA聚合酶，它的复制是利用细胞内的活性细胞聚合酶，比如细胞分裂，最好的病毒复制。肝脏中DNA合成在胚胎时期活跃。出生后，肝细胞仍旧继续分裂，作为生理性细胞更新的一部分，并且在肝细胞损失时分裂更快。培养的肝脏细胞处于分离当中，更有利于病毒的复制。肝脏细胞对PCV2的易感性可能与那些细胞有丝分裂的活性有关。此外，肝脏细胞可能含有一些细胞因子例如感受器，这些因子对于PCV2感染来说是必须的。
肝坏死和凋亡小体在PMWS肝损伤病例中可以看到。在这个实验中，PCV2感染之后，没有发现CPE和不正常的γ-GT活性增加。尽管如此，在体外培养中，可以推测PCV2引起极小的或者没有肝细胞损失。为什么没有出现肝组织损失的原因还不清楚。一个可能的解释是10天不足以在感染PCV2的肝脏细胞中引起CPE。单核巨噬细胞系包括枯否细胞同样易感PCV2。肝脏细胞和枯否细胞之间的相互作用可能对PMWS引起的肝脏疾病起到决定性的作用。PCV2感染引起的猪肝细胞死亡的发病机制需要进一步研究。
PCV2和很多病理学条件有关，包括PMWS，生殖障碍，PDNS，猪呼吸道综合征，增生性和坏死性肺炎和AII型先天性震颤。尽管从PMWS中分离的PCV2和流产中分离的PCV2在遗传性上相似（＞95%），仍要考虑两种病毒株生物上性质的不同。在一个研究中，一些伴随有流产的病毒株显示出与在PK-15细胞中与PMWS或者PDNS相关菌株不同的复制动力学。尽管在这个实验中用的PMWS相关的毒株显示出对原代肝细胞很高的感染力，但是仍不清楚是否所有的毒株都与培养的肝细胞有相同的感染力。我们的实验结果显示，PCV2更倾向于感染患有PMWS的猪的培养的肝细胞。
致谢：作者想要感谢Ms Hitomi Tomioka，Nouko Saito和Masayo Ishii，为他们所做的技术支持。
