试验酵母细胞的固定化

生产高果糖浆需要： 葡萄糖异构酶
作用： 将葡萄糖转化为果糖
如何改进？
特点： 酶稳定性好，可持续发挥作用
直接使用酶时的缺点： 酶溶于葡萄糖溶液后，就无法 从糖浆中回收，造成很大①反应柱能连续使用半 年，大大降低了生产成 本。
②提高了果糖的产量和 品质。
三、实验操作 （一）制备固定化酵母细胞 （二）用固定化酵母细胞发酵
（一）制备固定化酵母细胞 1、酵母细胞的活化：
1g干酵母＋10mL蒸馏水→50mL烧杯→搅拌均匀→放 置1h，使之活化。
〖思考〗活化是指什么？
在缺水状态下，微生物处于休眠状态。活化是指让 处于休眠状态的微生物重新恢复正常生活状态的过 程。 操作提示
五、结果分析与评价
（一）观察凝胶珠的颜色和形状 如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白色： 说明海藻酸钠的浓度偏低，固定的酵母细胞数目较少； 如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形：
说明海藻酸钠的浓度偏高。 二者都说明制作失败，需要再作尝试。
（二）观察发酵的葡萄糖溶液 利用固定的酵母细胞发酵产生酒精，可以看到产 生了很多气泡，同时会闻到酒味
〖思考〗 1、发酵过程中锥形瓶为什么要密封？ 酵母菌的酒精发酵需要缺氧条件。
〖思考〗 2、锥形瓶中的气泡和酒精是怎么形成的？ 酵母菌进行无氧呼吸产生的
本请 并
节 结
完 成 习
做 好 复
束题 习
！
谢谢！
〖思考〗为什么要将海藻酸钠冷却至室温？
以免海藻酸钠温度过高杀死酵母菌
操作提示 海藻酸钠溶液必须冷却至室温，搅拌要彻底充分， 使两者混合均匀，以免影响实验结果的观察。
（5）固定化酵母细胞
以恒定的速度缓慢的将注射器中的溶液滴加CaCl2 溶液中，将形成的凝胶珠在CaCl2溶液中浸泡 30min左右。

酵母细胞的固定化课题5 酵母细胞的固定化1. 游离酶、固定化酶和固定化细胞的⽐较(1) 物理吸附法(吸附法)是将酶吸附在载体表⾯的⼀种固定⽅法。

特点是⼯艺简便且条件温和，应⽤⼴泛。

实质是利⽤酶与载体之间的范德华⼒实现吸附。

(2) 化学结合法(交联法)是利⽤酶与载体之间形成的共价键将酶进⾏固定的。

2. 酵母细胞的固定化（1）活化:在缺⽔状态下，微⽣物处于休眠状态。

活化是指让处于休眠状态的微⽣物重新恢复正常⽣活状态的过程。

（2）⽤蒸馏⽔配制CaCl溶液,⽽不⽤⾃来⽔。

原因是防⽌⾃来⽔中各种2离⼦影响实验结果。

溶液的作⽤：使胶体聚沉，凝胶珠形成稳定的结构。

（3）CaCl2（4）海藻酸钠的作⽤：包埋细胞。

溶液中浸泡⼀段时间，以便形成稳定的结（5）刚形成的凝胶珠应在CaCl2构。

（6）检验凝胶珠的质量是否合格，可以使⽤下列⽅法。

⼀是⽤镊⼦夹起⼀个凝胶珠放在实验桌上⽤⼿挤压，如果凝胶珠不容易破裂，没有液体流出，就表明凝胶珠的制作成功。

⼆是在实验桌上⽤⼒摔打凝胶珠，如果凝胶珠很容易弹起，也能表明制备的凝胶珠是成功的。

（7）如果制作的凝胶珠颜⾊过浅、呈⽩⾊，说明海藻酸钠的浓度偏低，固定的酵母细胞数⽬较少；如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，则说明海藻酸钠的浓度偏⾼，制作失败，需要再作尝试。

3. ⽤固定化酵母细胞发酵（1）配制麦芽汁或葡萄糖溶液:注意浓度适宜，过⾼会造成固定的酵母细胞失⽔，甚⾄死亡。

（2）葡萄糖的作⽤：既可以作为发酵底物，也作为酵母菌细胞的营养物质。

（3）固定化酵母凝胶珠的处理:固定好的凝胶珠从氯化钙溶液取出后要⽤蒸馏⽔冲洗2~3次。

洗去氯化钙溶液的⽬的是防⽌凝胶珠硬度过⼤，影响通透性。

（4）发酵:开始时凝胶珠沉在发酵液的底部，⼀段时间后慢慢上浮且有⽓泡产⽣，发酵液有酒味。

思考：1.发酵过程中锥形瓶为什么要密封？2.锥形瓶中的⽓泡和酒精是怎么形成的？3.发酵时为什么要将温度控制在25℃？例题：为了探究啤酒酵母固定化的最佳条件，科研⼈员研究了氯化钙浓度对固定化酵母发酵性能的影响，结果如下图所⽰。

浓度太低：固定的酵母菌太少
第四步：将海藻酸钠溶液与酵母细胞的混合
① 过程 将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温，加入以活化的酵 母细胞，进行充分搅拌，再转移至注射器中 ②注意事项 为什么要冷却至室温？
防止高温杀死酵母菌。恒定的速度缓慢的将注射器中的溶液滴加到配制好的 CaCl2溶液中，浸泡30min左右。 ②注意事项 为什么要浸泡30分钟？
③注意事项 溶解物质要彻底，勿用自来水溶解，以防自来水中各种离 子影响实验结果
第三步：配制海藻酸钠溶液
① 过程 称取0.2g海藻酸钠，放入40ml蒸馏水，用酒精灯小火间 断加热至完全溶化。 ②注意事项 为什么要小火间断加热？
防止海藻酸钠焦糊。 为什么说该步骤是实验成败的关键步骤？
浓度太高：得不到规则的凝胶珠
酵母菌细胞的固定化技术
一、基本步骤：
酵母细胞的活化 配制CaCl2溶液 配制海藻酸钠溶液 将海藻酸钠溶液与酵母细胞的混合 固定化酵母细胞
第一步：酵母细胞的活化
加水 活化
由于缺水，酵母处于 休眠状态
活化的干酵母
第二步：配制0.05mol/L的CaCl2
① 过程 称取无水CaCl2 0.83g，放入200ml的烧杯中，加入150ml 的蒸馏水，使其充分溶解，待用 ② 目的 使胶体聚沉
以便凝胶珠形成稳定的结构
球形或椭 球形，浅 黄色
二、用固定化酵母发酵
1.将固定好的酵母细胞（凝胶珠）用_蒸__馏__水__冲洗2~3次。
2.发酵时的温度就为__2_5_℃___，时间_2_4_h____（底物为葡 萄糖） 3.将凝胶珠加入用于发酵的葡萄糖溶液后会发现有_气__泡___ 产生，同时有_酒__精__味散发。

生物 ・ 实验 天地
例 析 酵母 细 胞 的 固 定化 技 术
口 胡有 红
二 、制 备 固定 化 酵母 细 胞 的 步骤 求学生熟练掌握实验具体操作过程 ， 分析实验 及 注意 事项 注意事项 ， 还 要考查 实 验 的迁 移 ， 如 探究 固定 １ ． 酵母细胞的活化 ， 即让处于休 眠状态 化 酵母细胞 的强 度与海 藻酸 钠和Ｃ ａ Ｃ １ Ｓ ￣度 的 的微 生物重 新 恢复正 常 的生 活状 态 。 变化关系 、 固定化 酶 的酶活力 和海藻酸钠 的浓 酵母细胞活化时体积会变大，因此活化 度、 使用次数等的关系。下面将详细分析酵母 前应该选择体积足够大的容器 ，以避免酵母 细胞的固定化技 术的重难点及相关拓展 。 细胞 的活 化液溢 出容 器外 。 固定 化细胞 技 术 ２ ．配 置 物 质 的量 浓 度 为 ０ ． ０ ５ ｍｏ ｌ ／ Ｌ的 固定 化酶 和 固定 化细 胞技 术是 利用 物理 Ｃ ａ Ｃ １ ２ ￣液 。 或化 学方法 将 酶或细 胞 固定在 一定 空间 内 的 Ｃ ａ Ｃ １ ２ ￣液 作 用 ： 海藻 酸 钠溶 液 遇 到钙 离 技 术 ，包 括包埋 法 、化学 结合 法和 物理 吸附 子 ， 会 形 成凝胶 ， 从 而将酵母 细胞包埋 在凝 胶 法。 因为 酶分 子很小 容易从 包埋 材料 中漏 出 ， 中， 达到 固定化 效果 。 因此常采用化学结合法 和物理 吸附法 固定 ３ ．配制 海 藻酸钠溶 液 。 （ １ ）海 藻 酸钠 在水 中溶解 的速 度 较 慢 ， 化， 而细胞个大 ， 难 以被吸附或结合 ， 多采用 包埋 法 固定化 。 需 要 加热 促 进其 溶解 。 溶 解 海 藻酸 钠 最好 用 小 火 间断加 热 或 水浴 加 热 。如 果 加 热过 快 ， 例 １ 试 分析 下 图 ， 与 用海 藻酸 钠 海 藻 酸 钠会 发 生焦 糊 。 （ ２ ）海 藻酸 钠 的浓 度 作栽 体制备 的 固定化 酵母 细胞相 似 的是 涉及 到 固定化 细 胞 的质 量 ， 因为海 藻 酸 钠 的 （ ） 浓 度 可 以 改 变 凝 胶 珠 的 孔 径 ：如 果 浓 度 过 高， 形 成的凝胶珠 不成圆形或椭 圆形 ； 如果 浓度 过 低 ， 形 成 的凝 胶 珠所 包 埋 的 酵母 细胞 数 目少 ， 因为 海 藻 酸 钠 浓 度 低 ， 海 藻 酸 钠 凝 胶 结 构 中 的间 隙偏 大 ， 会 有 一部 分 细胞 从 间 Ａ． Ｂ． Ｃ 隙 中漏 出 ， 会 导 致 包 埋 的酵 母 细 胞 少 ， 影 响 实 验效 果 。 解 析 本 题 考 查 固定 化 细 胞 的方 ４ ． 海 藻酸钠 溶液 与酵母 细 胞混合 。 法， Ａ 选项是物理吸附法 ， Ｂ 选项是化学结合 将溶化好 的海藻酸钠溶液冷却至室温 ， 法， 以上两 种方 法 常用 于酶 的 固定化 。Ｃ 和Ｄ 加 入 已活化 的酵母 细胞 ， 温度 不 能太低 ， 因为 选项 是 包埋 法 ， ｃ 是 将 酶 包 埋 在 微 网格 里 ， Ｄ 海藻酸钠溶液容易凝固， 温度不能太高， 会杀 是包 埋 在凝 胶 中 ，所 以Ｄ 与用 海 藻 酸钠 作 载 死酵母细胞。然后要充分搅拌 ，使其混合均 体制 备 的 固定 化 酵母 细胞相 似 。 匀， 防止 出现气泡 而影 响实 验结 果 的观 察 。 最 答案 Ｄ 后转 移至注 射器 中 。