酵母细胞的固定化 初资料

一、实验前已知的知识：溶液配制的基本方法；酵母细胞的作用；
二、实验背景：
（一）固定化酶的应用实例
1.利用固定化酶技术生产高果糖浆的实例
（1）高果糖浆的生产需要葡萄糖异构酶
（2）葡萄糖异构酶的优点：
稳定性好，可持续发挥作用
（3）在生产中直接使用酶有什么缺点？
酶溶解于葡萄糖溶液后，无法回收，造成浪费
2.固定化酶的反应柱示意图
3.固定化酶在生产实践中的优点
反应柱能连续使用半年，大大降低了生产成本，提高了果糖的产量和质量。

（二）固定化细胞技术
1.将酶或细胞固定化的方法
2.固定化酶和固定化细胞的联系与区别
联系：应用相同，都能催化某些反应
区别：1）固定化细胞技术操作容易，成本低，容易回收； 将酶（或细胞）包埋在细微网格里
将酶（或细胞）相互连接起来
将酶（或细胞）吸附在载体表面上
2）固定化细胞技术对酶活性影响更小；
3）固定化细胞固定的一系列酶；
4）由于大分子难以通过细胞膜，因此固定化细胞的应用有一定的限制；
3.固定化酶和固定化细胞常用的载体材料
明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素和聚丙烯酰胺等，其共同的特点是不溶于水的多孔性载体
本实验中所用的是海藻酸钠
三、实验目的
1、掌握固定化细胞的原理和作用；
2、制备固定化酵母细胞，并利用固定化酵母细胞进行酒精发酵。

3、比较固定化和未固定化酵母细胞的发酵差异。

四、实验原理
由于酵母细胞较大可采用包埋法（将细胞包埋在多孔载体内部而制成固定化细胞的方法）。

酵母细胞与海藻酸钠的混合液滴入CaCl2溶液中，钙离子会从外部扩散进入海藻酸钠与酵母细胞的混合液珠内，与钠离子发生离子交换，是海藻酸钠变为不溶于水的海藻酸钙凝胶，由此将酵母细胞包埋在其中，达到固定的效果。

五、实验步骤
1、酵母细胞的活化：称取1克干酵母，放入50ml小烧杯中，加入蒸馏水10ml，搅拌均匀成糊状，放置1h，使其活化。

（母酵细胞活化时体积会变大，因此活化前应该选择体积足够大的容器，以避免酵母细胞的活化液溢出容器外。

）
2、配置0.11mol/L CaCl2溶液，称取无水氯化钙3g放入100ml烧杯中搅拌均匀，转移到250ml容量瓶中，定容。

3、配置10%的葡萄糖溶液，取25g葡萄糖放入100ml烧杯中加水搅拌均匀，再转移到250ml容量瓶中，定容。

（葡萄糖溶液浓度不能过大，否则酵母菌会脱水死亡。

经查阅资料，葡萄糖浓度为1g/ml最为合适）
4、配置海藻酸钠溶液，称取0.7g海藻酸钠于50ml烧杯中，加入10ml蒸馏水，用沸水浴加热8min。

边加热边搅拌至完全溶化成糊状。

注意海藻酸钠不能焦糊。

（加热时可间断加热防止焦糊，在加热过程中蒸馏水会蒸发，致浓度偏大，影响凝胶珠形成，故溶化后用蒸馏水定容至10ml）
5、混合酵母细胞和海藻酸钠溶液，将溶化的海藻酸钠溶液冷却至室温，加入已活化的酵母细胞，将其搅拌均匀后部分匀速而轻柔转入注射器中。

（出现气泡会影响固定效果，所以出现气泡时用玻璃棒搅破。

转入注射器中后，将其中的空气排尽后再进行下一步）
6、固定酵母细胞，取出70ml氯化钙溶液，以恒定的速度缓慢地将注射器中的混合液滴入氯化钙溶液中，并将形成的凝胶珠在氯化钙中浸泡30min使其结构稳定。

（注射器不能垂直向下，有一定角度。

且与CaCl2溶液30cm 左右，有利于凝胶珠呈圆形。

若凝胶珠成蝌蚪状，可能是混合液浓度偏大，可在混合液中加入少量蒸馏水稀释，3-5ml，做预实验确定）具体是不把海藻酸钠混合液全部转移到注射器中，而是倒少量（0.5ml）送到注射器前端，滴加到氯化钙溶液中，观察形状，有尾巴，再重复操作，直至凝胶珠呈圆形，但蒸馏水不能较多，每次5滴即可。

7、对固定的酵母细胞进行发酵检验，取一定的凝胶珠用蒸馏水冲洗2-3次，每次1-2min。

将10%的葡萄糖溶液分别取75ml装入2个锥形瓶中，加入凝胶珠，再用保鲜膜封口。

在室温下发酵24h（据温度定）后，观察气泡的产生情况，过几天打开闻一闻是否有酒味。

也可取出一定的发酵液，用重铬酸钾检验酒精产生。

（酵母菌发酵是无氧环境，需保持密闭）
检验凝胶珠的质量是否合格：可以使用下列方法。

一是用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用手挤压，如果凝胶珠不容易破裂，没有液体流出，就表明凝胶珠的制作成功。

二是在实验桌上用力摔打凝胶珠，如果凝胶珠很容易弹起，也能表明制备的凝胶珠是成功的。

判断固定效果：固定效果好的凝胶珠颜色在米白到米黄之间，形状圆球形，干燥后颜色加深；颜色过浅或白色是因为海藻酸钠的浓度偏低，固定的酵母细胞数目少。

对照试验我没有写，晚上讨论。