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5 酵母细胞固定化

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课题5：酵母细胞的固定化
【教学目标】1．说出固定化酶和固定化细胞的作用和原理。

2．尝试制备固定化酵母细胞，并利用固定化酵母细胞进行酒精发酵。

【导学过程】
（一）课题背景（阅读课本P52导课内容,理解）
实际问题：酶对环境条件敏感，易失活；溶液中的酶很难回收，不能再次利用，提高了生产成本；反应后的酶会混合在产物中，如不除去，会影响产品质量。

（二）、固定化酶技术：（阅读课本P52-53内容，理解）
①固定化酶：是利用和的方法将酶与结合在一起形成有酶活性的酶复合物。

优点：酶既能与反应物接触，也易分离。

能被反复利用。

（阅读提示：阅读课本P53的制备方法，结合图3-8，理解相关内容）
②主要方法：、和交联法（化学结合法）。

③固定化酶的应用实例(阅读课本P53知识海洋)
（1）生产新型青霉素；（2）高果糖浆生产：葡萄糖异构酶能将葡萄糖转化为果糖。

使用固定化酶技术，将这种酶固定在一种颗粒装载体上，制成固定化酶反应柱。

可连续使用，降低成本，提高产量和质量。

（阅读提示：阅读课本P54-55固定化细胞技术及实验）
（三）、固定化细胞技术：固定化细胞方法与固定化酶基本相同。

优点：成本低，操作更容易（酶由细胞合成）；一系列的酶促反应；对酶活性影响小。

一般来说，酶更适合采用和法固定，而细胞多采用法固定化。

这是因为细胞个大，而酶分子很小；个大的难以被吸附或结合，而个小的酶容易从包埋材料中漏出。

包埋法法固定化细胞即将微生物细胞包埋在不溶于水的中。

常用的载体有、、、和等。

〖思考1〗操作上看，哪种方法更容易？对固定酶的作用影响较小的固定方法是什么？
〖思考2〗将谷氨酸棒状杆菌生产谷氨酸的发酵过程变为连续的酶反应，应当选用固定（）；若将蛋白质（大分子）变成氨基酸（小分子），应当固定（）。

（四）、实验操作：
(1)制备固定化酵母细胞：需要的材料是、
和。

1.酵母菌的活化：活化就是处于休眠状态的微生物重新恢复正常的生活状态。

2.配制物质的量尝识为0.05mol/L的Cacl2溶液（作用：使胶体聚沉，形成凝胶珠）
3.配制海藻酸钠溶液：注意①浓度适宜，保证凝胶珠成型且能固定；②加热时要注意：小火，或者间断加热。

边加热边搅拌，将海藻酸钠调成糊状。

4.海藻酸钠溶液与酵母菌细胞混合：（注意）融化的海藻酸钠要冷却致室温，才可加酵母细胞（为什么？）
5.固定化酵母细胞：以恒定的速度缓慢地将注射器中的溶液滴加到配制好的 CaCl2溶液中，并浸泡。

(2)用固定化酵母细胞发酵
1.将固定好的酵母细胞用蒸馏水冲洗2-3次。

（为什么？
）
2.将固定好的酵母细胞加入到装有麦芽汁（或葡萄糖溶液）的瓶中发酵，温度为。

〖思考3〗加热溶化海藻酸钠时微火加热并不断搅拌的目的是什么？
〖思考4〗为什么要海藻酸钠溶液冷却后才能加入酵母细胞？
〖思考5〗发酵过程中锥形瓶为什么要密封？锥形瓶中的气泡和酒精是怎样形成的？〖思考6〗在利用固定化酶或固定化细胞进行生产的过程中，需要无菌操作吗？
（五）、结果分析与评价
（1）观察凝胶珠的颜色和形状：如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白色，说明海藻酸钠的浓度偏低，固定的酵母细胞数目较少；如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，则说明海藻酸钠的浓度偏高，制作失败，需要再作尝识。

（2）观察发酵的葡萄糖溶液：发酵产生酒精，可以看到产生了很多，同时会闻到。

【典例分析】
例题、下列对固定化酶和固定化细胞的说法错误的是
A、固定化酶和固定化细胞是利用物理或者化学方法将酶或者细胞固定在一定空间内的技术
B、固定化酶和固定化细胞技术包括包埋法、化学结合法和物理吸附法
C、一般来说，酶更适合采用包埋法固定化，而细胞多采用化学结合和物理吸附法固定化
D、包埋法常用的载体有明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素和聚丙烯酰胺等
答案C
【达标检测】
1、（多选）酶的固定化常用的方式包括
A．吸附 B．包埋 C．交联 D．将酶加工成固体
2．海藻酸钠在水中溶解的速度较慢，需要通过加热促进其溶解，采用的最好的加热方法是
A．快速加热B．持续高温加热 C．小火间断加热D．灼烧加热
3．高果糖浆生产需要的酶是
A．葡萄糖异构酶 B．蔗糖酶 C．麦芽糖酶 D．果糖酶4．（多选）关于酵母菌的叙述，正确的是
A．酵母菌在营养物质充足时、环境适宜时，依靠有性生殖进行繁殖
B．酵母菌的代谢类型是异养兼性厌氧型
C．酵母菌的生物膜系统包括细胞膜、核膜、各种的细胞器膜等膜
D．用酵母菌酿酒时，应先密封后通气
5．研究认为，用固定化酶技术处理污染物是很有前途的，如将大肠杆菌得到的三酯磷酸酶固定到尼龙膜上制成制剂，可用于降解残留在土壤中的有机磷农药，于微生物降解相比，其作用不需要适宜的
A．温度 B．酸碱度 C．水分 D．营养
6．将酵母菌的培养液由富氧状态变为缺氧状态，下面加快的一项是
A．CO2的释放 B．丙酮酸的氧化 C．葡萄糖的利用 D．ATP的形成7．下列不是用于包埋法固定化细胞的载体是
A．琼脂糖 B．醋酸纤维素 C．聚丙烯酰胺 D．聚乙烯树脂
8、试分析下图中，哪一处与用海藻酸钠作载体制备的固定化酵母细胞相似
9、关于固定化酶和一般酶制剂在应用效果上的说法错误的是
A、固定化酶活性强，可长久使用
B、一般酶制剂应用后和产物混合在一起，产物纯度不高
C、一般酶制剂使用后不能重复利用
D、固定化酶可以反复利用，降低生产成本，提高产量和质量。

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酵母细胞的固定化

酵母细胞的固定化

酵母细胞的固定化课题5 酵母细胞的固定化1. 游离酶、固定化酶和固定化细胞的⽐较(1) 物理吸附法(吸附法)是将酶吸附在载体表⾯的⼀种固定⽅法。

特点是⼯艺简便且条件温和，应⽤⼴泛。

实质是利⽤酶与载体之间的范德华⼒实现吸附。

(2) 化学结合法(交联法)是利⽤酶与载体之间形成的共价键将酶进⾏固定的。

2. 酵母细胞的固定化（1）活化:在缺⽔状态下，微⽣物处于休眠状态。

活化是指让处于休眠状态的微⽣物重新恢复正常⽣活状态的过程。

（2）⽤蒸馏⽔配制CaCl溶液,⽽不⽤⾃来⽔。

原因是防⽌⾃来⽔中各种2离⼦影响实验结果。

溶液的作⽤：使胶体聚沉，凝胶珠形成稳定的结构。

（3）CaCl2（4）海藻酸钠的作⽤：包埋细胞。

溶液中浸泡⼀段时间，以便形成稳定的结（5）刚形成的凝胶珠应在CaCl2构。

（6）检验凝胶珠的质量是否合格，可以使⽤下列⽅法。

⼀是⽤镊⼦夹起⼀个凝胶珠放在实验桌上⽤⼿挤压，如果凝胶珠不容易破裂，没有液体流出，就表明凝胶珠的制作成功。

⼆是在实验桌上⽤⼒摔打凝胶珠，如果凝胶珠很容易弹起，也能表明制备的凝胶珠是成功的。

（7）如果制作的凝胶珠颜⾊过浅、呈⽩⾊，说明海藻酸钠的浓度偏低，固定的酵母细胞数⽬较少；如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，则说明海藻酸钠的浓度偏⾼，制作失败，需要再作尝试。

3. ⽤固定化酵母细胞发酵（1）配制麦芽汁或葡萄糖溶液:注意浓度适宜，过⾼会造成固定的酵母细胞失⽔，甚⾄死亡。

（2）葡萄糖的作⽤：既可以作为发酵底物，也作为酵母菌细胞的营养物质。

（3）固定化酵母凝胶珠的处理:固定好的凝胶珠从氯化钙溶液取出后要⽤蒸馏⽔冲洗2~3次。

洗去氯化钙溶液的⽬的是防⽌凝胶珠硬度过⼤，影响通透性。

（4）发酵:开始时凝胶珠沉在发酵液的底部，⼀段时间后慢慢上浮且有⽓泡产⽣，发酵液有酒味。

思考：1.发酵过程中锥形瓶为什么要密封？2.锥形瓶中的⽓泡和酒精是怎么形成的？3.发酵时为什么要将温度控制在25℃？例题：为了探究啤酒酵母固定化的最佳条件，科研⼈员研究了氯化钙浓度对固定化酵母发酵性能的影响，结果如下图所⽰。

酵母菌细胞的固定化技术

酵母菌细胞的固定化技术


浓度太低：固定的酵母菌太少
第四步：将海藻酸钠溶液与酵母细胞的混合
① 过程 将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温，加入以活化的酵 母细胞，进行充分搅拌，再转移至注射器中 ②注意事项 为什么要冷却至室温？
防止高温杀死酵母菌。恒定的速度缓慢的将注射器中的溶液滴加到配制好的 CaCl2溶液中，浸泡30min左右。 ②注意事项 为什么要浸泡30分钟？
③注意事项 溶解物质要彻底，勿用自来水溶解，以防自来水中各种离 子影响实验结果
第三步：配制海藻酸钠溶液
① 过程 称取0.2g海藻酸钠，放入40ml蒸馏水，用酒精灯小火间 断加热至完全溶化。 ②注意事项 为什么要小火间断加热？
防止海藻酸钠焦糊。 为什么说该步骤是实验成败的关键步骤？
浓度太高：得不到规则的凝胶珠
酵母菌细胞的固定化技术
一、基本步骤：
酵母细胞的活化 配制CaCl2溶液 配制海藻酸钠溶液 将海藻酸钠溶液与酵母细胞的混合 固定化酵母细胞
第一步：酵母细胞的活化
加水 活化
由于缺水，酵母处于 休眠状态
活化的干酵母
第二步：配制0.05mol/L的CaCl2
① 过程 称取无水CaCl2 0.83g，放入200ml的烧杯中，加入150ml 的蒸馏水，使其充分溶解，待用 ② 目的 使胶体聚沉
以便凝胶珠形成稳定的结构
球形或椭 球形，浅 黄色
二、用固定化酵母发酵
1.将固定好的酵母细胞（凝胶珠）用_蒸__馏__水__冲洗2~3次。
2.发酵时的温度就为__2_5_℃___，时间_2_4_h____（底物为葡 萄糖） 3.将凝胶珠加入用于发酵的葡萄糖溶液后会发现有_气__泡___ 产生，同时有_酒__精__味散发。
酵母细胞的固定化

酵母细胞的固定化

酵母细胞的固定化一、固定化酶与固定化细胞及应用实例1、固定化酶（1）含义：将酶固定在不溶于水的载体上。

（2）实例：利用固定化酶技术生产“高果糖浆”。

（3）优点：酶既能与反应物接触，又能与产物分离，同时，固定在载体上的酶还可以被反复利用。

（4）缺点：一种酶只能催化一种化学反应，而在实际生产中，很多产物的形成是通过一系列的酶促反应才能得到。

（5）应用实例：生产高果糖浆①原料：葡萄糖②原理：葡萄糖果糖③生产过程及示意图：a.反应柱能连续使用半年，大大降低了生产成本。

b.提高了果糖的产量和品质。

2、固定化细胞（1）含义：将细胞固定在一定空间内的技术。

（2）优点：成本低、操作容易、对酶活性的影响更小、可以催化一系列的反应、容易回收（3）缺点：固定后的细胞与反应物不容易接近，可能导致反应效果下降，由于大分子物质难以自由通过细胞膜，因此固定化细胞的应用也受到限制。

二、固定化酶或固定化细胞技术的常用方法1、固定化酶或固定化细胞：指利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术。

2、方法：①物理吸附法 ：将酶（或细胞）吸附在载体表面上②包埋法：将酶（或细胞）包埋在细微网格里③化学结合法：将酶（或细胞）相互结合，或将其结合到载体上。

葡萄糖异构酶三、固定化酵母细胞的制备与发酵（一）制备固定化酵母细胞1、酵母细胞的活化：1g干酵母＋10mL蒸馏水→50mL烧杯→搅拌均匀→放置1h，使之活化。

〖思考〗活化是指什么？在缺水状态下，微生物处于休眠状态。

活化是指让处于休眠状态的微生物重新恢复正常生活状态的过程。

2、配制物质的量浓度为0.05mol/L的CaCl2溶液：0.83gCaCl2＋150mL蒸馏水→200mL烧杯→溶解备用3、配制海藻酸钠溶液0.7g海藻酸钠＋10mL水→50mL烧杯→酒精灯微火（或间断）加热，并不断搅拌，使之溶化→蒸馏水定容到10mL。

注：加热时要用小火，或者间断加热，并搅拌，反复几次，直到海藻酸钠溶化为止4、海藻酸钠溶液和酵母细胞混合将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温，加入以活化的酵母细胞，进行充分搅拌，再转移至注射器中注：1、海藻酸钠溶液必须冷却至室温，搅拌要彻底充分，使两者混合均匀，以免影响实验结果的观察。

酵母细胞固定化技术

酵母细胞固定化技术


解析例题
• 1．关于酵母细胞活化的说法，不正确的是 A ______ • A．酵母细胞活化就是由无氧呼吸变成有氧 呼吸 • B．活化就是让处于休眠状态的细胞恢复生 活状态 • C．酵母细胞活化所需要的时间较短
• D．酵母细胞活化后体积增大
2.对配制海藻酸钠溶液的叙述不准确的是
C ______
A．加热使海藻酸钠溶化是操作中最重要
如何通过凝胶珠的特点来判断细胞固定化是否成功？ （一）观察凝胶珠的颜色和形状 如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白色，说 明 ； 如果形成的凝胶珠 海藻酸钠浓度过低，固定的酵母细胞过少 不是圆形或椭圆形，则说明 ，制作失败， 海藻酸钠浓度过高 需要再作尝试。 （二）观察发酵的葡萄糖溶液 利用固定的酵母细胞发酵产生酒精，可以看到产生 了很多 ，同时会闻到 。
酵母细胞的细胞的固定化技术
等级要求
B
温故知新
• 固定化酶和固定化细胞是利用 物理 或 化学 方 法将酶或细胞固定在一定空间内的技术，包 括 吸附法、 交联法和 包埋 法。一般来说，酶更适 合采用 吸附法 和 交联 法固定，而细胞多采用 法固定化。这是因为细胞个大，而酶分子很小； 包埋剂 容易从 中漏出。 • 包埋法固定化细胞即将微生物细胞 整个 包埋在 不溶于水的 载体 中。常用的载体 有 琼脂 、 海藻酸钠 、 角叉菜胶 、 明胶 和 醋酸纤维素 等。 • 酵母菌是（单 ）细胞（ 真核）生物，代谢形式为 （异氧兼性厌氧型 ）。
气泡 酒味
知识小结 一、固定化酵母细胞的流程
蒸馏水 酵母细胞的活化（将休眠的酵母细胞加入 中） ↓ 配制CaCl2溶液（作用： 使胶体聚沉 ） ↓ 配制海藻酸钠（钙）溶液 （注意点：①浓度高时， 凝胶珠不能成形 ；浓度低 固定化酵母细胞过少 时， ，影响实验效果。②小火或间断加热，避免焦糊。） ↓ 海藻酸钠与酵母菌混合（注意点： 海藻酸钠冷却后再与酵母菌混合 。） ↓ 固定化酵母细胞 二、注意点 1．固定化细胞要在严格的无菌 条件下进行。 2．反复使用固定化酵母细胞时，需要避免 微生物的污染 。