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hDaxx及其删除突变体在原核细胞中的表达与鉴定①

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第29卷第5期Vol.29No.5南华大学学报・医学版Journal of Nanhua University(Medical Edition)2001年10月Oct.2001　hDaxx及其删除突变体在原核细胞中的表达与鉴定①万艳平,尹卫国,余敏君,粟盛梅,杨长胜,吴移谋(南华大学基础医学院微生物学教研室,湖南衡阳421001)摘　要:目的　将人Daxx(human Daxx,hDaxx)及其6种删除突变体(△hDaxx)在原核细胞大肠杆菌BL21 (E.coli)中表达,以便在体外探索hDaxx的生物学活性。

方法　用PCR方法从Hela细胞cDNAs文库中扩增全序列hDaxx cDNA,利用载体pQE3x构建了hDaxx及其△hDaxx质粒,通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导E.coli表达相应蛋白质,并将其纯化。

结果　IPTG能诱导hDaxx及其△hDaxx在E.coli中表达,表达产物纯化率达85%以上。

结论　hDaxx及其6种△hDaxx能在E.coli中表达。

关键词:hDaxx;　hDaxx删除突变体;　原核细胞;　表达中图分类号:Q786 文献标识码:A 文章编号:1000-2510(2001)05-0435-04Expression and Identification of hDaxx and Its DeletionMutants in Prokaryotic CellsW AN Y an-ping,YI N Wei-guo,Y U Min-jun,et al(Department o f microbiology,School o f Basic Medicine,Nanhua Univer sity,Hengyang,Hunan421001,China)Abstract　Objective:T o question the biological activities of human Daxx(hDaxx)in vitro,hDaxx and its6deletion mutants(△hDaxx)were induced expression in prokary otic cells,E.coli BL21.Methods:The prokary otic expression plas2 mids of hDaxx and△hDaxx were constructed in pQE3x.Expression of hDaxx and△hDaxx were induced by IPTG.Ex2 pression productions were purifed using Ni-NT A agarose.Results:C oomassie strains and Western blot showed that hDaxx and△hDaxx were induced expression by IPTG.Purific rates of expression are m ore than85%.C onclusion:hDaxx and its 6△hDaxx were induced expression in E.coli.K ey w ords　hDaxx;　hDaxx deletion mutants;　prokary otic cell;　expression 急性早幼粒细胞性白血病蛋白(promyelocytic leukemia protein,PM L)作为PM L癌基因结构域(PM L oncogenic domains,PODs)的主要蛋白质,对PODs球状结构的形成与维持及其它蛋白质在该区的定位起着重要的作用1。

Daxx是一种能结合Fas死亡结构域(death domain,DD)并具有转录抑制作用的新型蛋白,它作为Fas下游两条凋亡通路中的一条,与另一条由Fas相关死亡蛋白诱导的凋亡通路相互独立,诱导凋亡2。

hDaxx与PM L在体内相互作用共定位于PODs,且hDaxx的定位依赖小泛素相关修饰子1(small ubiquitin-related m odifier,S UM O-1)修饰后的PM L(PM LΠS UM O-1)。

来自于急性早幼粒细胞性白血病(acute promyelocytic leukemia,AP L)病人的NB4细胞、PM L与反式维甲酸受体α(the retinoic and receptorα,RARα)形成的复合物PM L-RARα是一种癌蛋白,能打破hDaxx与PM L的共定位,使hDaxx不能定位于PODs,而定位到密集的染色质。

一旦用反式维甲酸(the retinoic acid,RA)或三氧化二砷(As2O3)处理NB4细胞,hDaxx脱离密集的染色质,重新定位到PODs3。

为了研究hDaxx的体外生物534①由南华大学资助,编号为5-00-X J-00-065学活性,我们构建了hDaxx及其6种△hDaxx的原核表达质粒,并在原核细胞中用IPTG诱导表达,同时利用Western blot检测诱导表达产物及其纯化的蛋白质。

1　材料与方法1.1　主要仪器　电穿孔机及低温超速离心机分别系BI O-RAD公司与Beckman公司产品,操作按说明。

1.2　酶及主要试剂　限制性核酸内切酶、T4DNA 连接酶、碱性磷酸酶购于Biotech或Bechringer Mannheim公司。

Ni-NT A琼脂购于Qiagen公司,按说明书纯化蛋白质。

IPTG购于Fisher Scientific公司,EC L试剂购于ME N T M公司。

兔抗组氨酸抗体及辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(HRP-G AR IgG)购于Santa Cruz公司。

1.3　hDaxx及其6种△hDaxx原核表达质粒的构建　根据hDaxx开放性阅读框架4,合成一对寡核苷酸引物,两侧均带EcoRI和BamHI位点(EcoRI位点用黑体表示,BamHI位点用下画线表示)。

上游引物5’G CC GAATTC GG ATCCCCT ATGG CC ACCG CT AAC -3’,下游引物5’-CCG GAATTC GG ATCCG TC AT2 C AG AG TCTG AG AG-3’。

以Hela细胞cDNA文库为模板,用PCR方法扩增约2.2kb产物,经EcoRI酶切回收约2.2kb片段,插入pcDNA3.1(-)EcoRI位点,得质粒pcDNA3.1ΠhDaxx,经DNA测序证实。

将pcDNA3.1ΠhDaxx BamHI酶切片段,插入pM2相应位点得质粒pMΠhDaxx。

将pcDNA3.1ΠhDaxx或pMΠhDaxx的BamHI、HindIII、BamHI和BglII、SacI、BamHI 和SacI等酶切片段插入原核表达载体pQE30或pQE32相应位点,得下列hDaxx及其△hDaxx原核表达质粒:pQE30ΠhDaxx(AA1-740)、pQE30Π△hDaxx (AA1-570)、pQE30Π△hDaxx(AA1-499)、pQE30Π△hDaxx(AA1-129)、pQE30Π△hDaxx(AA129-395)、pQE32Π△hDaxx(AA395-740)、pQE30Π△hDaxx(AA570-740),在N端附有6个组氨酸残基(6xHis)编码片段。

所构建的质粒用限制性核酸内切酶酶切或PCR方法鉴定插入片段及方向的正确性。

1.4　hDaxx及6种△hDaxx在原核细胞中的诱导表达及纯化　用电穿孔法将hDaxx及6种△hDaxx 原核表达质粒转化大肠杆菌(E.coli)菌株BL21。

用LA液体培养基(LA液)将细菌经37℃水浴振荡过夜后,取200μL培养物移入2m L LA液中培养2～4h,待OD600值为0.8～1.0时,加IPTG并使其终浓度为0.4mm olΠL,设不加IPTG作对照组。

30℃水浴振荡培养3h后,取200μL培养物离心去上清,沉淀物加30μL1倍S DS2样本缓冲液。

取诱导表达好的300 m L细菌培养物离心去上清,按文献5纯化目的蛋白,取纯化蛋白10μL加5μL3倍S DS2样本缓冲液。

纯化蛋白质保存在-80℃冰箱中备用。

将样本煮沸3min,经S DS-PAGE后,一组用考马斯亮蓝染色、醋酸脱色液脱色及干胶;另一组作Western blot,即样本经S DS-PAGE后转硝酸纤维素膜,将膜用5%的脱脂牛奶封闭过夜。

兔抗组氨酸抗体按滴度稀释在5%的脱脂牛奶中,置室温轻摇2h后,用T B-T缓冲液洗膜3次。

HRP-G AR IgG按滴度稀释在5%的脱脂牛奶中,置室温轻摇1h后,洗膜3次,EC L试剂显影。

2　结 果2.1　图1A是hDaxx及6种△hDaxx结构示意图,N 端附有6xHis。

质粒pQE30ΠhDaxx、pQE3xΠ△hDaxx及其酶切片段琼脂糖电泳结果见图1B。

2.2　hDaxx及其6种△hDaxx的原核表达质粒经转化E.coli BL21后,用IPTG诱导表达目的蛋白,未诱导及诱导表达的细菌培养物取沉淀作S DS-PAGE 后,考马斯亮蓝染色结果及Western blot结果分别见图2的A和B。

2.3　大批量诱导表达hDaxx及其6种△hDaxx,诱导表达产物离心去上清并纯化目的蛋白。

取适量纯化物作S DS-PAGE后,考马斯亮蓝染色结果及Western blot结果分别见图2的C和D。

3　讨 论近10多年来,人们利用电子显微镜技术发现了新核区ND10,即PODs,并利用荧光扫描生物显微镜在原发性胆汁性肝硬化病人血清中发现了抗核抗体,证明它能与S p100结合,即发现了第一个定位PODs的蛋白质S p1006。

后来,人们又发现了PM L 定位PODs,且PM L影响S p100的定位,但PM L在体内并不与S p100结合。

这样,可能在PODs存在着某种蛋白质网络,而网络中的某些蛋白质作为接受子,使象S p100一样的不与PM L结合的蛋白质能定位到PODs。

hDaxx可能是这样一种蛋白质1。

1997年, Y ang等利用酵母双杂交系筛选的新蛋白Daxx,它在634图1　hDaxx 及其删除突变体原核表达质粒与酶切片段琼脂糖电泳图A.hDaxx 及其删除突变体结构草图,N 端附有6xH is ,图中数字为氨基酸序号。

B.质粒pQE30ΠhDaxx 及其删除突变体与酶切片段琼脂糖电泳图,2～8为质粒,9～15为酶切片段,图上方数字为核苷酸序号图2　hDaxx 及其删除突变体在E.coli 中的表达与纯化A 和C 为考马斯亮蓝染色结果,B 和D 为W estern blot 结果。

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GFP-HPV16 E2及其删除突变体融合蛋白在真核细胞中的表达与定位

GFP-HPV16 E2及其删除突变体融合蛋白在真核细胞中的表达与定位

GFP-HPV16 E2及其删除突变体融合蛋白在真核细胞中的表达与定位陈杰;陈苏芳;唐双阳;李薇;万艳平【期刊名称】《中南医学科学杂志》【年(卷),期】2010(038)001【摘要】目的构建人乳头瘤病毒16型E2(HPV16 E2)及其N端(TAD)、C端(DBD)删除突变体与增强型绿色荧光蛋白(GFP)融合蛋白的真核表达载体,观察其在Hela细胞中的表达与定位. 方法 HPV16 E2基因经PCR扩增后,与pMD-T载体连接,经蓝白斑筛选、PCR、双酶切鉴定及序列分析后,将E2基因亚克隆至pEGFP-C1真核表达载体中,构建荧光蛋白融合表达载体pEGFP-C1/HPV16 E2.PCR扩增TAD、DBD基因片段,将其双酶切后插入pEGFP-C1,构建荧光蛋白融合表达载体pEGFP-C1/TAD及pEGFP-C1/DBD.将3种质粒转染Hela细胞,在荧光显微镜下观察融合蛋白的表达与定位. 结果重组载体经 PCR、双酶切鉴定及测序证明插入片段序列正确,且在Hela细胞中能表达目的蛋白;GFP-E2融合蛋白在细胞核与细胞质中都有表达,但主要分布于细胞核;而 GFP-DBD融合蛋白仅在细胞核内;GFP-TAD融合蛋白仅在细胞质中. 结论构建的绿色荧光蛋白融合表达载体pEGFP-C1/HPV16 E2、pEGFP-C1/TAD及pEGFP-C1/DBD均在Hela细胞中表达,并确定了各自在细胞内的定位.【总页数】4页(P34-37)【作者】陈杰;陈苏芳;唐双阳;李薇;万艳平【作者单位】南华大学,病原生物学研究所,湖南,衡阳421001;岳阳职业技术学院;南华大学,病原生物学研究所,湖南,衡阳421001;南华大学,病原生物学研究所,湖南,衡阳421001;南华大学,病原生物学研究所,湖南,衡阳421001;南华大学,病原生物学研究所,湖南,衡阳421001【正文语种】中文【中图分类】R37【相关文献】1.POAG相关基因MYOC cDNA的克隆及MYOC/GFP融合蛋白在真核细胞的表达与定位 [J], 王建文;孙慧敏;季建;李筱荣;郑建秋;唐广贤;吕建华;王庆瑛2.GFP-HPV16 E5融合蛋白在HeLa细胞内的表达与定位 [J], 唐双阳;陈杰;李薇;周良;余敏君;朱翠明;万艳平3.hDaxx及其删除突变体在真核细胞中的表达与鉴定 [J], 唐旭红;何爱桃;万艳平4.GFP-HPV18 E2及其突变体融合蛋白在真核细胞内的表达与定位 [J], 陈春莲; 万艳平; 彭俊5.GFP-HPV18 E2删除突变体融合蛋白真核表达载体的构建与鉴定 [J], 陈春莲;彭俊;余敏君;尹卫国;朱翠明;万艳平因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

禾谷镰刀菌醛脱氢酶(ALDH)基因敲除突变体的转录组分析

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禾谷镰刀菌醛脱氢酶(ALDH)基因敲除突变体的转录组分析唐磊;翟焕趁;葛锦雯;张帅兵;吕扬勇;魏闪;马平安;胡元森【期刊名称】《南方农业学报》【年(卷),期】2024(55)3【摘要】【目的】对野生型PH-1菌株和醛脱氢酶(ALDH)基因FGSG_04194敲除突变体(ΔFg04194)进行转录组测序,分析禾谷镰刀菌ALDH调控菌丝生长和脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)生成情况,为深入探究禾谷镰刀菌ALDH的生物学功能、DON生成机制及致病机理提供了理论依据。

【方法】接种禾谷镰刀菌野生型PH-1、ΔFg04194突变体和基因回补突变体(ΔFg04194-C)菌株至CM培养基和小麦基质中,分析FGSG_04194基因对菌丝生长和DON生成的影响。

利用高通量转录组测序技术对野生型PH-1菌株和ΔFg04194突变菌株在CM培养基中培养72 h 的菌丝进行转录组测序,对筛选出的差异表达基因(DEGs)进行GO功能注释和KEGG信号通路富集分析,利用实时荧光定量PCR对转录组测序结果进行验证。

【结果】ΔFg04194突变体的菌落直径和生成的DON含量较野生型PH-1和ΔFg04194-C突变体菌株显著减少(P<0.05,下同)。

野生型PH-1和ΔFg04194突变体转录组原始数据经过滤后获得34.9 Gb Clean data,共鉴定出329个DEGs,其中263个基因表达显著上调,66个基因表达显著下调。

GO功能注释结果显示,DEGs显著富集在质膜成分、碳水化合物代谢和物质转运过程等条目上。

KEGG 信号通路富集分析显示,DEGs显著富集在碳水化合物代谢通路、氨基酸代谢通路、脂质代谢、能量代谢、生物降解代谢通路、细胞生长和死亡相关途径、信号转导途径等。

将FGSG_04194基因调控下有代表性的DEGs分成五大类:几丁质合成相关的基因、跨膜转运蛋白相关的基因、转录因子相关基因、脂质代谢相关基因和能量代谢相关的基因。

13-18年理综全国卷生物试题(附答案)

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