基于二代测序的石蜡切片样本体细胞突变检测方法和设备的制作技术
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第二代测序技术ppt课件
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
454 (GS-FLX)
▪ Roche：（2005，2007，2008）
▪ 原理：在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光 素酶和双磷酸酶的作用下，将每一个dNTP的 聚合与一次化学发光信号的释放偶联起来， 通过检测化学发光信号的有无和强度，达到 实时检测DNA序列的目的。
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
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454 (GS-FLX)流程
▪ 包水的混合 物，每个独特的片断在自己的微反应器里、SOLiD双碱基编码原理及测序流程
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SOLiD流程
▪ 4、SOLiD双碱基编码原理及测序流程
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454 (GS-FLX)
▪ Roche：（2005，2007，2008）
▪ 原理：在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光 素酶和双磷酸酶的作用下，将每一个dNTP的 聚合与一次化学发光信号的释放偶联起来， 通过检测化学发光信号的有无和强度，达到 实时检测DNA序列的目的。
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454 (GS-FLX)流程
▪ 包水的混合 物，每个独特的片断在自己的微反应器里、SOLiD双碱基编码原理及测序流程
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
SOLiD流程
▪ 4、SOLiD双碱基编码原理及测序流程
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
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mutect2 的使用要点
mutect2 的使用要点mutect2 是一款广泛应用于全外显子测序数据的突变检测工具。
它的主要功能是从肿瘤样本和正常样本的比对数据中，准确地识别出可能的突变事件。
在本文中，我将介绍 mutect2 的使用要点，帮助读者更好地理解和应用这一工具。
一、什么是 mutect2mutect2 是 GATK（Genome Analysis Toolkit）的一部分，由Broad Institute 开发，用于检测全外显子测序数据中的突变事件。
它基于一种被称为“局部组装”的方法，通过比对两个样本的比对数据，识别出可能存在的突变位点。
二、mutect2 的使用步骤1. 数据准备在使用 mutect2 进行突变检测之前，首先需要准备好两个样本的比对数据，包括正常样本和肿瘤样本的比对 BAM 文件。
2. 运行 mutect2在运行 mutect2 之前，需要进行一些设置和参数的配置。
其中，一个重要的参数是 "--normal"，用于指定正常样本的 BAM 文件；另一个重要的参数是 "--tumor"，用于指定肿瘤样本的 BAM 文件。
3. 突变检测结果mutect2 运行完成后，会生成一个 VCF（Variant Call Format）文件，其中记录了检测到的突变位点及其相关信息。
可以利用该文件进行后续的分析和注释。
三、mutect2 使用要点1. 数据质控在进行突变检测之前，务必对比对数据进行质控。
推荐使用 GATK 的工具对 BAM 文件进行排序、去重、标记重复等处理，以保证数据的准确性和可靠性。
2. 适当调整参数mutect2 提供了一系列的参数可供调整，以适应不同的研究需求。
根据实际情况，可以调整突变检测的灵敏度和特异性等参数，以获得更准确的结果。
3. 结果过滤由于 mutect2 的灵敏度较高，可能会产生一些误报的突变位点。
建议根据实际需求对结果进行进一步的过滤和筛选，以提高结果的可信度。
常用的分子生物学基本技术
常用的分子生物学基本技术核酸分子杂交技术由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的灵敏性，它已成为分子生物学中最常用的基本技术，被广泛应用于基因克隆的筛选，酶切图谱的制作，基因序列的定量和定性分析及基因突变的检测等。
其基本原理是具有一定同源性的原条核酸单链在一定的条件下（适宜的温室度及离子强度等）可按碱基互补原成双链。
杂交的双方是待测核酸序列及探针（probe）,待测核酸序列可以是克隆的基因征段，也可以是未克隆化的基因组DNA和细胞总RNA。
核酸探针是指用放射性核素、生物素或其他活性物质标记的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知DNA或RNA片段。
根据其来源和性质可分为cDNA探针、基因组探针、寡核苷酸探针、RNA探针等。
固相杂交固相杂交（solid-phase hybridization）是将变性的DNA固定于固体基质（硝酸纤维素膜或尼龙滤膜）上，再与探针进行杂交，故也称为膜上印迹杂交。
斑步杂交（dot hybridization）是道先将被测的DNA或RNA变性后固定在滤膜上然后加入过量的标记好的DNA或RNA探针进行杂交。
该法的特点是操作简单，事先不用限制性内切酶消化或凝胶电永分离核酸样品，可在同一张膜上同时进行多个样品的检测；根据斑点杂并的结果，可以推算出杂交阳性的拷贝数。
该法的缺点是不能鉴定所测基因的相对分子质量，而且特异性较差，有一定比例的假阳性。
印迹杂交（blotting hybridization）Southern印迹杂交：凝胶电离经限制性内切酶消化的DNA片段，将凝胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至硝基纤维素膜或其他固相支持物上，经干烤固定，再与相对应结构的已标记的探针进行那时交反应，用放射性自显影或酶反应显色，检测特定大小分子的含量。
可进行克隆基因的酶切图谱分析、基因组基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性长度多态性分析（RELP）等。
Northern印迹杂交:由Southerm印杂交法演变而来，其被测样品是RNA。
切片培训资料
切片厚度
切片厚度应适中，太厚会影响观察质量， 太薄则易碎。
切片均匀度
切片应均匀，无厚薄不均的现象。
染色质量
染色应鲜艳、清晰，无背景干扰。
切片完整度
切片应完整，无撕裂、破碎等现象。
03
切片技术的应用
生物医学领域的切片应用
病理诊断
切片技术广泛应用于病理诊断中，医生可以通过对病变组织的切片检查，明确诊断疾病种 类、程度和预后情况。
切片技术的发展历程
切片技术最早可以追溯到19世纪末，当时科学家开始利用显微镜观察植物细胞， 并对细胞进行了染色处理，以便更好地观察细胞的结构。
随着科技的不断进步，切片技术也在不断发展和完善，例如在20世纪中期，人们 开始利用更精密的仪器和技术进行切片分析，例如电子显微镜和X射线衍射等技 术的应用，使得切片分析的精度和可靠性得到了极大的提高。
THANKS
感谢观看
切片技术主要分为冷冻切片、石蜡切片、免疫荧光切片等几 种，每种切片技术具有不同的应用范围和特点。
切片技术的应用场景
切片技术在生物学、医学、材料科学等领域应用广泛，例 如在肿瘤研究、药物研发、细胞生物学、纳米技术等领域 都有应用。
切片技术可以用于观察细胞和组织的微观结构和功能，例 如观察细胞器的分布和形态，研究细胞分裂和分化等生物 学过程，以及检测细胞中各种分子的表达水平和定位等。
，研究材料的力学、电磁学等性能和变化规律。
02
产品检测
切片技术可以用于产品检测，通过对产品切片的微观观察和分析，检
测产品的质量、成分和结构等。
03
工业制造过程控制
切片技术可以用于工业制造过程控制，通过对生产过程中的切片检查
，控制生产工艺和产品质量。
IHC、DNA测序、FISH简介
优点：特异性强；敏感性高；定位准确、形态与功能相 结合。
缺点：准确率差；操作复杂；人为主关影响大；均质性 差；样本单一；蛋白水平。
临床常用检测技术
IHC
免疫组化（IHC） 样本类型 灵敏性，特异性 准确性 重复性 理论基础 DNA扩增突变 定位作用 mRNA表达 蛋白质表达 操作复杂程度 实验要求 均质性 组织切片，细胞爬片等 较高 高(50%~75%) 较高 免疫反应 —— 原位 —— 定性，相对定量 复杂 高 否 高 高(95%以上) 高 链式聚合酶反应 能(突变定量) —— 相对/绝对定量 —— 简便 严格指控，无污染 是 临床常用检测技术 RT-PCR 所有样本
•
•
临床常用检测技术
其他
液相芯片技术
临床常用检测技术
其它
变性高效液相色谱（DHPLC）
利用液相色谱技术（HPLC），既在高压闭合液相流路中，将DNA样品自动注 入并在缓冲液携带下流过专利的DNA分离柱，通过缓冲液的不同梯度变化，
在不同分离柱温度条件下实现对DNA不同的分析；由紫外检测或荧光检测被
FISH
操作流程
红色探针：与17号染色体Her2基因结合 绿色探针：与17号染色体中心粒结合 临床常用检测技术
FISH
结果判读
红色探针：与17号染色体Her2基因结合 绿色探针：与17号染色体中心粒结合
临床常用检测技术
FISH
优点
• 准确性高，重复性好
• 与临床疗效相关性好 • 冰冻和固定的标本均可
分离的DNA样品。
临床常用检测技术
谢 谢！
15%~20% 高
不需要 —— 定性 —— ~1000bp 复杂 是 科研，临床
5~10% 高
二代测序(NGS)实验方案设计和应用
这里为您介绍二代测序的相关流程和应用。
随着人类基因组工程的完成，对于低花费的测序技术的需求促进了高通量二代测序技术的发展。
这些新的测序平台允许进行高通量测序，具有广泛的应用：∙全基因组从头测序或者重测序∙目标序列重测序∙转录组分析∙微生物组研究∙基因调控研究NGS 序列二代测序仪器有很多种组合，在通量、片段长度、准确度、每一轮测序成本、每百万碱基对测序成本、初始成本、规格和技术方面存在存在差异。
从规格和初始成本的角度而言，二代测序仪器可轻松地分类为更窄的范围，也就是所谓的“台式测序仪”和高通量仪器。
台式测序仪使得任何实验室都可以像使用real-time PCR一样，自己进行测序。
这些仪器可以和一些靶标序列富集技术相结合，用在一些临床的应用中，其中：选定的靶标基因用于深度分析，以检测稀有的突变，或者检测多样样本中（比如癌症样本）中的突变。
目前，这些仪器的通量在10 Mb到7.5 Gb之间，但是随着硬件，软件和试剂的持续改善，通量也在稳步增加。
高通量测序仪非常适合于大量的，基因组范围的研究，每次测序能测定600 Gb的序列。
一些这样的高通量和高精度的平台，能测定的片段长度相对较短，这对于高重复性的序列和未知基因组的从头测序就可能成为问题。
与此相反，也有一些仪器能测序的片段较长（达到2500 bp），但是其精度和测序能力（90 Mb）要低很多。
还有一些测序能力位于两者之间的仪器（~800 bp，700 Mb）。
因此，应用决定了哪一种仪器是最合适的。
有一种新的方法被称作“纳米孔测序”。
这种技术中，根据一个DNA链通过一个合成的或者蛋白纳米孔道所引起的电流的改变，可以确定通过这个孔道的碱基。
这理论上可以仅用一步就测序一个完整的染色体，而不需要生成新的DNA链。
DNA测序二代DNA测序的工作流程如下：∙DNA样本制备∙文库构建和验证∙文库分子大规模平行克隆扩增∙测序二代测序DNA样本的质量控制首先，评价基因组DNA的质量是非常必要的（完整性和纯度）。
实时荧光聚合酶链反应临床实验室应用指南(WST 230—2024)
本标准不适用于基于核酸杂交、核酸恒温扩增、基因测序等 技术所开展的检测。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本标准必不 可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版 本适用于本标准；不注日期的引用文件，其最新版本（包括 所有的修改单）适用于本标准。
GB/T 37874 核酸提取纯化方法评价通则 GB/T 40974 核酸样本质量评价方法 JJF 1874 （自动）核酸提取仪校准规范 JJF 1527 聚合酶链反应分析仪校准规范
5 样本采集和处理
5.2 样本采集
5.2.3 采样时效
5.2.3.1 应结合不同检测目的与疾病特点， 明确样本采集的时 效性， 避免因在疾病发生发展过程中样本采集过早或过迟而 导致假阴性结果。 感染性疾病可考虑在病程不同阶段连续采 样送检。
5.2.3.2 手术、 输血、 药物治疗等医疗行为可影响实时荧光 PCR 检测结果， 采样前应明确患者有无接受上述诊疗行为， 如有宜建议推迟采样或在报告中备注相关情况。
性酶促扩增技术。 当存在模板、 底物、 引物和耐热DNA聚合酶 时， 通过调节反应温度引导多次“变性-退火-延伸” 反应循环， 可令痕量DNA模板扩增数百万倍。 3.2 实时荧光聚合酶链反应 real-time fluorescence polymerase chain reaction;real-time PCR 在 PCR 反应体系中引入荧光基团， 利用荧光信号的积累实时监 测整个 PCR 进程， 通过连续监测绘制反应动力曲线， 从而对样 本中被扩增模板 DNA 的初始含量进行计算。 该技术包含定性和 定量检测， 常以qPCR（quantitative polymerase chain reaction） 代 表定量检测。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本标准必不 可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版 本适用于本标准；不注日期的引用文件，其最新版本（包括 所有的修改单）适用于本标准。
GB/T 37874 核酸提取纯化方法评价通则 GB/T 40974 核酸样本质量评价方法 JJF 1874 （自动）核酸提取仪校准规范 JJF 1527 聚合酶链反应分析仪校准规范
5 样本采集和处理
5.2 样本采集
5.2.3 采样时效
5.2.3.1 应结合不同检测目的与疾病特点， 明确样本采集的时 效性， 避免因在疾病发生发展过程中样本采集过早或过迟而 导致假阴性结果。 感染性疾病可考虑在病程不同阶段连续采 样送检。
5.2.3.2 手术、 输血、 药物治疗等医疗行为可影响实时荧光 PCR 检测结果， 采样前应明确患者有无接受上述诊疗行为， 如有宜建议推迟采样或在报告中备注相关情况。
性酶促扩增技术。 当存在模板、 底物、 引物和耐热DNA聚合酶 时， 通过调节反应温度引导多次“变性-退火-延伸” 反应循环， 可令痕量DNA模板扩增数百万倍。 3.2 实时荧光聚合酶链反应 real-time fluorescence polymerase chain reaction;real-time PCR 在 PCR 反应体系中引入荧光基团， 利用荧光信号的积累实时监 测整个 PCR 进程， 通过连续监测绘制反应动力曲线， 从而对样 本中被扩增模板 DNA 的初始含量进行计算。 该技术包含定性和 定量检测， 常以qPCR（quantitative polymerase chain reaction） 代 表定量检测。
tngs检测技术原理
tngs检测技术原理TNGS（Targeted Next-Generation Sequencing）检测技术是一种高通量测序技术，能够对特定基因区域进行深度测序，从而实现对个体基因组的全面分析。
本文将从TNGS检测技术的原理、应用以及优缺点等方面进行阐述。
一、TNGS检测技术的原理TNGS检测技术主要基于Illumina测序平台，通过将目标DNA片段进行多轮PCR扩增，得到大量的DNA片段。
然后将这些DNA片段连接到测序芯片上，并进行测序反应。
测序过程中，通过使用荧光标记的碱基，以及逐个碱基加入的方式，可以逐一确定DNA序列。
最后，通过计算机分析和拼接这些碱基的信息，就能够得到目标基因区域的DNA序列信息。
二、TNGS检测技术的应用1. 遗传病检测：TNGS检测技术可以对多个与遗传病相关的基因进行测序，从而快速准确地诊断患者的遗传病风险。
2. 癌症基因变异检测：通过对癌症相关基因进行测序，可以发现患者体内的致病基因变异，为癌症的早期预防和治疗提供依据。
3. 感染病原体检测：通过对感染病原体的基因进行测序，可以准确鉴定感染源，指导临床治疗。
4. 个体基因组分析：通过对个体基因组的测序，可以了解个体的遗传特征，为个性化医学提供基础数据。
三、TNGS检测技术的优缺点1. 优点：（1）高通量：TNGS技术可以同时对成千上万个基因进行测序，大大提高了测序效率和吞吐量。
（2）高灵敏度：由于对目标基因区域进行深度测序，TNGS技术能够检测到低频突变，提高了检测的灵敏度。
（3）高准确性：TNGS技术经过多轮PCR扩增和测序反应，可以减少测序错误率，提高测序的准确性。
（4）多样性：TNGS技术可以同时对多个样本进行测序，适用于大规模研究和临床应用。
2. 缺点：（1）数据分析复杂：TNGS技术产生的数据量大，数据分析和解读需要专业的生物信息学分析工具和技术支持。
（2）成本较高：与传统测序技术相比，TNGS技术的设备和试剂成本较高，限制了其在临床应用中的推广。
常用分子生物学和细胞生物学实验技能技术总结介绍
精心整理常用分子生物学和细胞生物学实验技术介绍(2011-04-2311:01:29)转载▼标签：分子生物学细胞生物学常用实用技术基本实验室技术生物学实验教育常用的分子生物学基本技术核酸分子杂交技术由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的灵敏性，它已成为分子生物学中最常用的基本技术，被广泛应用于基因克隆的筛选，酶切图谱的制作，基因序列的定量和定性分析及基因突变的检测等。
其基本原理是具有一定同源性的原条核酸单链在一定的条件下（适宜的温室度及离子强度等）可按碱基互补原成双链。
杂交的双方是待测核酸序列及探针（probe ）,待测核酸序列可以是克隆的基因征段，也可以是未克隆化的基因组DNA 和细胞总RNA 的已知 固相杂交Southern DNA 片段Northern 复杂的盐酸核生物（如人），则因工作量太大，表达的序列所占百分比较低（仅5％左右），价值不大。
cDNA 微点隈杂交（cDNAmicroarrayhybridization ）是指将cDNA 克隆或cDNA 的PCR 产物以高度的列阵形式排布并结合于固相支持物上（如：尼龙膜或活化的载玻片）以微点阵，然后用混合的不同DNA 探针与微点阵上的DNA 进行杂交。
再利用荧光、化学发光、共聚焦显微镜等技术扫描微点阵上的杂交信息。
它比差异杂交技术的效率高、速度快、成本低，适用于大规模的分析。
已成商品问世。
其缺点是无法克服保守的同源序列及重序对杂交信息的干扰。
寡核苷酸微点隈杂交（oligonucleotidemicroarrayhybridization ）是在特殊的固相支持物上原位合成寡核苷酸，使它共价结合于支持物表面，与平均长度为20-50nt 的混合RNA 或cDNA 探针进行杂交，以提高杂交的特异性和灵敏度。
应用共聚焦显微镜可检测跨越三个数量级的杂交信息。
适用于低丰度mRNA的检测，以区分基因家族不同成员的差异表达特征，或鉴定同一转录在不同组织和细胞中的选择性剪接。
猪圆环病毒检测方法.doc
猪圆环病毒病原检测方法及应用动医112班动物科学学院动物医学专业2012年7月11日摘要：猪圆环病毒(PCV)是近年受到广泛关注的危害世界养猪业的重要病源之一。
PCV具有PCV-1和PCV-2两种基因型。
猪圆环病毒（PCV）感染引起的猪圆环病毒病，是以免疫抑制为特征的类病毒性传染病，临床表现主要是由PCV-2引起的仔猪断奶后多系统衰竭综合征。
特别是猪圆环病毒2型感染引起的不同生长阶段猪的免疫系统损伤，造成猪机体高度易感，使养猪业蒙受巨大的损失。
因此对猪圆环病毒感染的检测技术方法至关重要，且意义重大。
文章对就近几年国内外对猪圆环病毒检测技术，包括病毒的分离、电镜观察、聚合酶链式反应（PCR）间接免疫荧光试验、免疫组织化学技术检测、原位核酸杂交试验等进行综述。
特别是对猪圆环病毒2型检测技术及应用做了介绍。
关键词：猪圆环病毒；检测方法；应用。
猪圆环病毒（PCV）为圆环病毒科圆环病毒属，是迄今发现的最小的动物DNA 病毒。
该病毒基因组为单股环状DNA，无囊膜，粒子呈20面体对称，直径17～20nm。
根据PCV的抗原性、核苷酸序列及致病性将PCV分成PCV-1和PCV-2两种基因型。
猪圆环病毒是近年来备受人们关注的一种在世界各地广泛存在的慢性疾病，是一系列疾病的总称。
自1974年Tischer I等［1］首次发现猪圆环病毒（Porcine circovirus,PCV）以来，随着研究的深入，发现PCV-1对猪无致病性，但是PCV1能产生血清抗体，猪群中普遍存在PCV-1，广泛存在于猪源细胞及正常猪体内各组织中。
PCV-2对猪有致病性，与传染性先天性震颤（CT）、断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）、皮炎肾衰竭综合征（PDNS）、猪呼吸道疾病综合征（PRDC）及妊娠母猪繁殖障碍相关，其可在猪源细胞培养物中繁殖，不产生细胞病变,易被忽视，因此猪源细胞疫苗或诊断抗体造成潜在的危害。
PCV-2导致的断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）造成了很大的经济损失。
艾德KRAS试剂盒说明书
【产品名称】通用名称：人类KRAS基因7种突变检测试剂盒（荧光PCR法）英文名称：Human KRAS Gene 7 Mutations Fluorescence Polymerase ChainReaction (PCR) Diagnostic Kit【包装规格】12测试/盒【预期用途】KRAS基因是人体肿瘤中常见的致癌基因。
该基因的突变常见于多种恶性肿瘤，在肺癌患者中的突变率为15～30%，在结直肠癌患者中的突变率为20～50%。
导致KRAS处于激活状态的突变主要位于第12和13密码子上。
KRAS基因突变一般会使肺癌患者对EGFR酪氨酸激酶抑制剂产生耐药，使结直肠癌患者对抗EGFR抗体类药物产生耐药。
但是，2010年10月的最新研究发现第13密码子上的Gly13Asp（G13D）突变亦对抗EGFR抗体类药物有治疗反应性（参见：De Roock. W. JAMA. 2010;304(16):1812-1820）。
因此，KRAS基因突变检测能提高肿瘤临床治疗的针对性，降低治疗费用，节省宝贵的治疗时间。
大部分肿瘤的突变都是体细胞突变，突变细胞往往与野生型细胞混杂在一起，因此所提取的DNA常带有大量野生型DNA，所以对体细胞突变检测需要较高的特异性，而目前广泛使用的直接测序法检测能力有限，不能完全满足临床需要。
本试剂盒用于检测人类KRAS基因的12和13密码子上7种热点体细胞突变（见表1），试剂盒以DNA为检测样本，提供突变状态的定性评估。
辅助临床医生筛选出可受益于肿瘤靶向药物的大肠癌等癌症患者。
该产品用于组织中提取DNA的KRAS基因7种突变的检测，为临床医生对大肠癌或肺癌患者选择肿瘤靶向药物治疗提供参考。
表1 人类KRAS基因的12和13密码子上7种热点体细胞突变突变名称氨基酸变化碱基变化Cosmic ID 公司命名Gly12Asp 甘氨酸到天门冬氨酸GGT>GAT 521 12-2-A Gly12Ala 甘氨酸到丙氨酸GGT>GCT 522 12-2-C Gly12Val 甘氨酸到缬氨酸GGT>GTT 520 12-2-T Gly12Ser 甘氨酸到丝氨酸GGT>AGT 517 12-1-A Gly12Arg 甘氨酸到精氨酸GGT>CGT 518 12-1-C Gly12Cys 甘氨酸到胱氨酸GGT>TGT 516 12-1-T Gly13Asp甘氨酸到天门冬氨酸GGC>GAC 53213-2-A【检测原理】本试剂盒基于实时PCR平台结合了特异引物和双环探针两种技术，检测DNA样品中含有的突变基因。
MSH2基因启动子甲基化检测的引物和检测方法[发明专利]
![MSH2基因启动子甲基化检测的引物和检测方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s1/m/f23c5f57793e0912a21614791711cc7931b77818.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201611038356.X(22)申请日 2016.11.11(71)申请人 南昌艾迪康医学检验所有限公司地址 330029 江西省南昌市高新开发区青山湖大道1111号1栋(72)发明人 林有升 刘赵玲 王淑一 (74)专利代理机构 浙江杭州金通专利事务所有限公司 33100代理人 黄素萍(51)Int.Cl.C12Q 1/68(2006.01)C12N 15/11(2006.01)(54)发明名称MSH2基因启动子甲基化检测的引物和检测方法(57)摘要本发明公开了MSH2基因启动子区多CG位点甲基化检测的引物和方法包括：(1)扩增MSH2基因启动子区的正、反向兼并引物SEQ NO 1和SEQ NO 2；(2)上述引物扩增的目标序列包括至少12个CG位点；(3)针对石蜡切片DNA片段化严重，而亚硫酸氢盐修饰饱和状态下仍呈现有效模板浓度低的问题，将Touch-down PCR扩增和Sanger测序相结合，可显著提高检测灵敏度。
本发明具有特异性高，准确度高以及低污染风险等优点，可检测肿瘤患者手术石蜡切片MSH2基因启动子区多个CG位点甲基化，结果可指导医生进行相关疾病的预后评估。
权利要求书1页 说明书6页序列表1页 附图2页CN 106520965 A 2017.03.22C N 106520965A1.用于检测MSH2基因启动子甲基化的引物，其特征在于，包括一对特异性扩增兼并引物SEQ NO 1和SEQ NO 2，其序列为：SEQ NO 1：5’-TGGAAGTTGATTGGGTGTGGTY-3’；SEQ NO 2：5’-RCTCTCCAACTACAACRTCTCCTTC-3’。
2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，扩增引物同为测序引物，所述测序引物的序列为：SEQ NO 1：5’-TGGAAGTTGATTGGGTGTGGTY-3’；SEQ NO 2：5’-RCTCTCCAACTACAACRTCTCCTTC-3’。
体细胞突变检测 标准
体细胞突变检测标准
体细胞突变检测的标准方法通常包括以下步骤：
1.样本准备：收集受检个体的组织样本，如血液、口腔拭子、皮肤
等，确保样本无污染且具有足够的数量。
2.DNA提取：从组织样本中提取DNA，这是进行突变检测的必要步
骤。
3.突变富集：通过使用适当的引物和探针，对目标基因的特定区域
进行扩增和杂交，从而富集突变序列。
4.测序分析：将富集的突变序列进行测序，以确定是否存在突变。
通常会进行多次测序以确保结果的准确性。
5.数据分析：对测序数据进行深入分析，以识别突变类型并确定其
在基因组中的位置。
这有助于评估突变对基因功能的影响。
6.生物信息学分析：利用生物信息学方法对测序数据进行分析，以
确定突变的频率、类型和分布。
这有助于评估突变在群体中的普遍性和潜在的致病变异。
7.可视化报告：根据分析结果生成详细的可视化报告，包括突变类
型、位置、频率等信息，以供医生和研究人员参考。
需要注意的是，体细胞突变检测的标准可能因不同的应用场景和检测目标而有所差异。
此外，在进行体细胞突变检测时，需要注意遵循实验室规范和质量控制标准，以确保检测结果的准确性和可靠性。
二代测序在遗传突变中的应用
二代测序在遗传突变中的应用遗传突变是指在基因或染色体结构中发生的变异，它是生物进化和种群遗传多样性的重要驱动力，也是导致许多遗传疾病和肿瘤发生发展的根本原因。
随着二代测序技术（也称为高通量测序技术）的迅速发展，我们能够对遗传突变进行更为全面和精确的研究，以探索其在个体和种群水平上的重要性。
本文将介绍二代测序在遗传突变检测、疾病表型关联、肿瘤进化和个体遗传变异研究中的应用，并探讨其未来的发展方向。
一、遗传突变检测二代测序技术已经成为检测遗传突变最为常用的方法之一。
通过对个体基因组的全序列测定或目标区域的深度覆盖测序，我们可以发现一些单碱基变异、插入缺失、复杂重排等突变。
这些突变可能是导致遗传疾病发生的原因，也可能是个体遗传差异的来源。
二代测序技术的高通量和高灵敏性使得我们能够更全面地了解个体的遗传异质性，从而实现个性化医学的目标。
此外，二代测序还可以检测外源性核酸（如病毒、细菌等）的感染，并跟踪其在个体中的传播和演化。
二、疾病表型关联遗传突变与疾病表型之间存在着密切的关联。
通过对大样本群体的基因组测序和表型数据的整合分析，我们可以鉴定出与疾病发生发展有关的遗传变异。
这些变异可能是单基因遗传病的致病突变、复杂疾病的易感变异、基因表达调控元件的变异等。
二代测序技术的高通量能力使得我们能够在大样本群体中快速发现和验证这些与疾病相关的突变，为疾病的早期预测和个体化治疗提供了重要的依据。
三、肿瘤进化研究肿瘤是由遗传突变引起的一类疾病，肿瘤细胞在不断的演化过程中会积累大量的突变。
二代测序技术的出现为肿瘤进化和肿瘤异质性研究提供了无与伦比的机会。
通过对肿瘤样本和正常样本的基因组测序和比较分析，我们可以追踪肿瘤的起源、进化和扩散过程，揭示肿瘤的发展规律和临床表现的多样性。
此外，通过定向测序和组学数据的整合分析，我们也可以发现对特定药物敏感或抵抗的突变，并为肿瘤个体化治疗提供理论依据。
四、个体遗传变异研究每个个体都存在着独特的遗传变异，这些变异会影响个体的生理特性、药物反应以及疾病易感性等。
二代测序检测甲基化的方法
二代测序检测甲基化的方法二代测序是一种高通量测序技术，可以快速、准确地获得大量的DNA或RNA序列信息。
甲基化是一种常见的DNA修饰形式，对于基因表达、细胞分化、发育和疾病等方面起着重要的调控作用。
因此，准确检测甲基化状态对于深入研究基因组学和表观遗传学具有重要意义。
本文将介绍二代测序检测甲基化的方法及其应用。
常用的二代测序检测甲基化的方法主要有甲基化敏感限制性内切酶测序（MRRBS）、甲基化敏感PCR测序（MSP、Methyl-Seq）和甲基化特异性抗体免疫沉淀测序（MeDIP-Seq）等。
甲基化敏感限制性内切酶测序是一种经典的二代测序方法，其原理是利用甲基化敏感的限制性内切酶将未甲基化的DNA片段切割成短序列，再进行测序。
通过比较未甲基化和甲基化的DNA片段，可以推测出DNA的甲基化状态。
该方法具有高准确性和较低的成本，被广泛应用于甲基化研究领域。
甲基化敏感PCR测序是一种基于PCR扩增的方法，主要用于检测少量样品或特定位点的甲基化状态。
该方法通常包括甲基化特异性PCR和测序两个步骤。
首先，通过甲基化特异性PCR扩增甲基化和未甲基化的DNA片段，并在PCR过程中引入特定的标记。
然后，将扩增产物进行测序，通过分析序列数据来确定甲基化状态。
该方法具有高灵敏度和高特异性，适用于甲基化位点的快速检测。
甲基化特异性抗体免疫沉淀测序是一种利用甲基化特异性抗体与甲基化DNA结合的方法。
首先，将甲基化的DNA片段与甲基化特异性抗体进行免疫沉淀，然后通过测序来获得甲基化DNA的序列信息。
该方法可以直接检测全基因组的甲基化状态，具有高通量和高分辨率的特点。
然而，由于抗体的特异性和亲和力等因素的限制，该方法可能存在一定的假阳性和假阴性结果。
除了上述方法，还有一些新兴的二代测序方法被用于甲基化检测，如全基因组甲基化测序（WGBS）、甲基化基因组测序（MethylC-Seq）和环状化学修饰测序（EM-Seq）等。
这些方法在测序技术和生物化学方法上有所改进，能够更加准确地检测甲基化状态。
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本技术涉及二代测序分析领域的基于二代测序的石蜡切片样本体细胞突变检测方法和装置。
该方法包括：获取新鲜肿瘤冷冻组织样本体细胞突变和肿瘤组织石蜡切片样本体细胞突变最高一致性时的过滤参数作为过滤阈值；检测待测肿瘤组织石蜡切片样本的体细胞突变；过滤与正常样本变异位点集重合的位点；过滤未达到所述过滤阈值的体细胞突变位点；过滤生殖细胞突变和高频突变位点。
本技术以PON、以基于石蜡切片组织特征的特异性训练体细胞突变位点过滤阈值以及以已有数据库过滤生殖细胞突变和高频突变位点作为体细胞突变检测的过滤条件，能够快速剔除大部分由石蜡切片制备造成的假阳性结果，提高检测效率和特异性，快速精准检测石蜡切片体细胞突变。
权利要求书1.基于二代测序的石蜡切片样本体细胞突变检测方法，其特征在于，包括如下步骤：获取正常组织石蜡切片样本的测序结果，将所述测序结果与人类参考基因组比对，所得比对数据构建正常组织石蜡切片样本的正常样本变异位点集；分别获取同一组织来源的新鲜肿瘤冷冻组织样本、肿瘤组织石蜡切片样本和正常组织样本的测序结果，基于测序结果，在不同过滤参数下检测新鲜肿瘤冷冻组织样本的体细胞突变和肿瘤组织石蜡切片样本的体细胞突变；对比所述新鲜肿瘤冷冻组织样本体细胞突变和肿瘤组织石蜡切片样本体细胞突变的一致性，获取最高一致性时的过滤参数作为过滤阈值；分别获取待测肿瘤组织石蜡切片样本及其配对正常组织样本的测序结果，基于测序结果检测待测肿瘤组织石蜡切片样本的体细胞突变，得到原始变异结果；过滤所述原始变异结果中与正常样本变异位点集重合的位点，得到第一体细胞突变结果；过滤所述第一体细胞突变结果中未达到所述过滤阈值的体细胞突变位点，得到第二体细胞突变结果；过滤所述第二体细胞突变结果中生殖细胞突变和高频突变位点，即得待测肿瘤组织石蜡切片样本的体细胞突变结果；所述过滤参数包括体细胞变异位点的测序深度总和、变异等位基因频率、链偏好性、Read 朝向偏好性、测序质量值、胚系突变干扰值、污染物干扰值、碱基质量值中位数、平均比对质量值、片段长度中位数、reads末端距离中位数、假阳性优势对数、覆盖reads总数、位点杂合纯合性优势对数、短片段重复次数、链偏好质量值、聚合酶滑动质量值中的一种或一种以上；针对所述过滤参数设定阈值。
2.根据权利要求1所述的体细胞突变检测方法，其特征在于，所述过滤参数包括变异等位基因频率、链偏好性和Read朝向偏好性中的一种或一种以上。
3.根据权利要求2所述的体细胞突变检测方法，其特征在于，所述链偏好性的计算公式为：链偏好性 = 正向读长深度 / 所有读长深度；所述Read朝向偏好性的计算公式为：其中，SOB表示Read朝向偏好性；#of F1R2alt表示和参考基因组方向互补且携带突变位点的reads总数；#of F2R1alt表示和参考基因组方向相同且携带突变位点的reads总数。
4.根据权利要求1所述的体细胞突变检测方法，其特征在于，根据属性约减法，选择最优三种所述过滤参数组合。
5.根据权利要求1所述的体细胞突变检测方法，其特征在于，采用统计学方法获取所述过滤阈值；所述统计学方法包括Kappa一致性检验、卡方检验、配对t检验和相关系数中的任一种方法。
6.根据权利要求1所述的体细胞突变检测方法，其特征在于，所述配对正常组织样本与待测肿瘤组织石蜡切片样本来源于同一个体；所述配对正常组织样本包括外周血、癌旁组织和新鲜组织中的一种或一种以上。
7.根据权利要求1所述的体细胞突变检测方法，其特征在于，使用任何生殖细胞突变和高频突变的先验数据库过滤所述生殖细胞突变和高频突变位点；所述体细胞突变位点在任一生殖细胞突变和高频突变的先验数据库中，则进行过滤。
8.根据权利要求7所述的体细胞突变检测方法，其特征在于，根据属性约减法，选择生殖细胞突变和高频突变的先验数据库中的任意三种数据库。
9.根据权利要求8所述的体细胞突变检测方法，其特征在于，所述数据库为dbSNP、1000Genomes Project和ExAC。
10.根据权利要求1所述的体细胞突变检测方法，其特征在于，所述正常组织石蜡切片样本的测序结果在与参考基因组比对前，包括质控步骤：所述测序结果去除测序接头序列、低质量序列和N碱基组成的序列，得到过滤数据；对所述过滤数据去接头后的碱基数、碱基质量大于20的百分比、碱基质量大于30的百分比、GC含量、GC-AT分离比、N含量、平均读长长度、读长分布标准差、平均碱基质量和可用数据比例进行筛选，选择符合设定阈值的测序数据进行对比。
11.根据权利要求1所述的体细胞突变检测方法，其特征在于，所述比对数据进行去重合排序处理，并对比对上的数据进行比对率、平均比对质量、插入片段大小、重复片段比例、捕获效率、目标区域测序深度、目标区域覆盖度、大于500X测序深度区域所占比例、大于100X 测序深度区域所占比例和大于10X测序深度区域所占比例筛选，选择符合设定阈值的数据构建正常样本变异位点集。
12.基于二代测序的石蜡切片样本体细胞突变检测装置，其特征在于，包括，原始变异结果提取模块，用于利用待测肿瘤组织石蜡切片样本及其配对正常组织样本的测序结果，基于测序结果检测待测肿瘤组织石蜡切片样本的体细胞突变，提取原始变异结果；第一过滤模块，用于过滤原始变异结果中与正常样本变异位点集重合的位点，得到第一体细胞突变结果；其中，正常样本变异位点集为正常组织石蜡切片样本的测序结果与参考基因组比对而构建；第二过滤模块，用于过滤第一体细胞突变结果中未达到所述过滤阈值的体细胞突变位点，得到第二体细胞突变结果；其中，过滤阈值为新鲜肿瘤冷冻组织样本体细胞突变和肿瘤组织石蜡切片样本体细胞突变最高一致性时的过滤参数；第三过滤模块，用于过滤第二体细胞突变结果中生殖细胞突变和高频突变位点，得到待测肿瘤组织石蜡切片样本的体细胞突变结果。
13.根据权利要求12所述的装置，其特征在于，所述第二过滤模块包括过滤参数单元和过滤阈值单元；所述过滤参数单元，用于基于将同一组织来源的新鲜肿瘤冷冻组织样本、肿瘤组织石蜡切片样本和正常组织样本的测序结果，在不同过滤参数下检测新鲜肿瘤冷冻组织样本的体细胞突变和肿瘤组织石蜡切片样本的体细胞突变；所述过滤阈值单元，用于对比所述过滤参数单元获得的所述新鲜肿瘤冷冻组织样本体细胞突变和肿瘤组织石蜡切片样本体细胞突变的一致性，获取最高一致性时的过滤参数作为过滤阈值。
14.根据权利要求13所述的装置，其特征在于，所述过滤参数单元中还包括过滤参数组合单元，用于将最优的过滤参数组合。
15.根据权利要求13或14所述的装置，其特征在于，所述过滤阈值单元还包括统计单元，用于计算获得的所述新鲜肿瘤冷冻组织样本体细胞突变和肿瘤组织石蜡切片样本体细胞突变最高一致性时的过滤参数以获取所述过滤阈值。
16.根据权利要求12所述的装置，其特征在于，所述第三过滤模块包括先验数据库单元，用于过滤所述生殖细胞突变和高频突变位点。
17.根据权利要求16所述的装置，其特征在于，所述先验数据库单元中还包括先验数据库组合单元，用于将最优的先验数据库组合。
18.根据权利要求12所述的装置，其特征在于，所述第一过滤模块还包括质控单元；所述质控单元包括过滤单元和第一筛选单元；所述过滤单元，用于将正常组织石蜡切片样本的测序结果去除测序接头序列、低质量序列和N碱基组成的序列，得到过滤数据；所述第一筛选单元，用于将所述过滤单元获得的过滤数据进行去接头后的碱基数、碱基质量大于20的百分比、碱基质量大于30的百分比、GC含量、GC-AT分离比、N含量、平均读长长度、读长分布标准差、平均碱基质量和可用数据比例筛选，选择符合设定阈值的测序数据进行对比。
19.根据权利要求12所述的装置，其特征在于，所述第一过滤模块还包括去重合排序处理单元和第二筛选单元；所述去重合排序处理单元，用于将质控单元处理后的数据与参考基因组的比对结果进行去重合排序处理；所述第二筛选单元，用于将所述去重合排序处理单元处理后的比对上的数据进行比对率、平均比对质量、插入片段大小、重复片段比例、捕获效率、目标区域测序深度、目标区域覆盖度、大于500X测序深度区域所占比例、大于100X测序深度区域所占比例和大于10X测序深度区域所占比例筛选，选择符合设定阈值的数据构建正常样本变异位点集。
技术说明书基于二代测序的石蜡切片样本体细胞突变检测方法和装置技术领域本技术涉及二代测序分析领域，具体涉及基于二代测序的石蜡切片样本体细胞突变检测方法和装置。
背景技术随着二代测序(NGS)的快速发展，癌症基因组学正在揭示大多数人类恶性肿瘤中多种致癌基因和抑癌基因中观察到的不同频率的体细胞突变，探讨其在诊断、预后及治疗分层中的潜在价值。
特别是用于病理诊断的福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织对研究癌症基因组学具有重要价值。
与新鲜冷冻组织样品相比，FFPE样品在癌症基因组学方面具有以下4个优点：1) 随着癌症病例和类型的增加，FFPE组织样本允许回顾性研究；2) FFPE切片显示癌症的各种组织学特征，包括癌前病变，可以评估与组织学改变相关的遗传事件；3)通过激光捕获FFPE 切片靶细胞的微分离(LCM)，可以更精确地分析肿瘤的进化过程；4) FFPE切片免疫组化(IHC)有助于通过LCM提取特异性靶细胞，阐明特异性标记阳性细胞的遗传改变。
FFPE DNA的二代测序分析具有很大的发展潜力。
然而目前一个主要的挑战在于FFPE样品一般存在降解严重、化学修饰、核酸和蛋白质的交联以及组织处理和加工的变异性，这些分子变化将会直接影响数据质量，带来困扰，如：1）样本降解导致测序Reads比对质量较低，产生较多的SoftClip reads，产生较多的重复测序片段（Duplicate reads）；2）甲醛固定导致核酸随机产生胞嘧啶-胸腺嘧啶（C-T）转化，使得FFPE分离的核酸与下游高通量分子技术不兼容，展现出多个方面的偏好，如PCR 偏好、链偏好、序列偏好、比对偏好等，使FFPE DNA鉴定出的突变结果存在很高假阳性，限制了FFPE样本在二代测序中的应用。
目前针对FFPE样本，多数是在提取、建库方法上有不同的研究和改良，在数据分析阶段还没有形成一套完整的可参考流程，因此迫切需要一套基于二代测序的高准确度石蜡切片组织突变检测方法，以确保后续分析的可靠性。
技术内容因此，本技术解决的技术问题在于克服现有技术中石蜡切片样本用于检测体细胞突变存在很高假阳性，从而提供基于二代测序的石蜡切片样本体细胞突变检测方法和装置。
基于二代测序的石蜡切片样本体细胞突变检测方法，包括如下步骤：获取正常组织石蜡切片样本的测序结果，将所述测序结果与人类参考基因组比对，所得比对数据构建正常组织石蜡切片样本的PON（panel of normal, 正常样本变异位点集）；分别获取同一组织来源的新鲜肿瘤冷冻组织样本、肿瘤组织石蜡切片样本和正常组织样本的测序结果，基于测序结果，在不同过滤参数下检测新鲜肿瘤冷冻组织样本的体细胞突变和肿瘤组织石蜡切片样本的体细胞突变；对比所述新鲜肿瘤冷冻组织样本体细胞突变和肿瘤组织石蜡切片样本体细胞突变的一致性，获取最高一致性时的过滤参数作为过滤阈值；分别获取待测肿瘤组织石蜡切片样本及其配对正常组织样本的测序结果，基于测序结果检测待测肿瘤组织石蜡切片样本的体细胞突变，得到原始变异结果；过滤所述原始变异结果中与PON重合的位点，得到第一体细胞突变结果；过滤所述第一体细胞突变结果中未达到所述过滤阈值的体细胞突变位点，得到第二体细胞突变结果；过滤所述第二体细胞突变结果中生殖细胞突变和高频突变位点，即得待测肿瘤组织石蜡切片样本的体细胞突变结果。