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㊃综述㊃N G S在感染性疾病诊断中的临床应用陈梨张丽琴谢超皖南医学院弋矶山医院呼吸内科,芜湖241002通信作者:张丽琴,E m a i l l i z h333333@a l i y u n c o mʌ摘要ɔ目前复杂的感染性疾病逐渐增加,如脑膜炎㊁肺炎㊁脓毒血症等,精准快速的病原学诊断可以帮助临床医师及时优化抗菌药物的使用,提高治愈率㊂二代测序技术发展迅速,为临床上感染性疾病的病原学诊断提供了非常有价值的诊断途径㊂ʌ关键词ɔ二代测序;脑膜炎;肺部感染;脓毒血症D O I103760c m a j c n131368-20190718-01031C l i n i c a l a p p l i c a t i o no f n e x t-g e n e r a t i o n s e q u e n c i n g i nd i a g n o s i s o f i n f e c t i o u s d i s e a s e sC h e nL i Z h a n g L i q i n X i eC h a oD e p a r t m e n to f R e s p i r a t o r y M e d i c i n e Y i j i s h a n H o s p i t a l W a n n a n M e d i c a l C o l l e g e W u h u241002C h i n aC o r r e s p o n d i n g a u t h o r Z h a n g L i q i n E m a i l l i z h333333@a l i y u n c o mʌA b s t r a c tɔA t p r e s e n t t h ec o m p l e xi n f e c t i o u sd i s e a s e sa r e g r a d u a l l y i n c r e a s i n g s u c h a sm e n i n g i t i s p n e u m o n i a s e p s i s e t c A c c u r a t ea n d r a p i d p a t h o g e n i c d i a g n o s i sc a n h e l p c l i n i c i a n so p t i m i z e t h e u s e o f a n t i b i o t i c s a n d i m p r o v e t h e c u r e r a t e N e x t-g e n e r a t i o n s e q u e n c i n g t e c h n o l o g y h a sr a p i d l y d e v e l o p e d p r o v i d i n g a v e r y v a l u a b l e d i a g n o s t i c r o u t e f o r t h e p a t h o g e n i cd i a g n o s i so f c l i n i c a li n f e c t i o u s d i s e a s e sʌK e y w o r d sɔ N e x t-g e n e r a t i o n s e q u e n c i n g M e n i n g i t i s L u n g i n f e c t i o n S e p s i sD O I103760c m a j c n131368-20190718-01031随着医学的发展,人类发现了越来越多的疑难病例,各种病原体的变异导致了复杂感染性疾病发生率逐渐增加,精准快速的病原学诊断可以帮助临床医师及时优化抗菌药物的使用,从而减少住院时间㊁提高治愈率㊁改善预后㊂目前常用的微生物检测方法有痰涂片㊁痰培养㊁血培养㊁脑脊液㊁胸腹水化验㊁P C R等,其中痰标本获取干扰因素较多,培养阳性率较低,检测种类有限,缺乏病原体类型㊁致病性㊁耐药信息以及罕见或未知的新发病原体相关信息,容易造成漏诊㊁误诊㊂故上述方法已不能有效地满足临床需求㊂而随着二代测序(n e x t-g e n e r a t i o n s e q u e n c i n g, N G S)技术的不断成熟和普及,为临床上感染性疾病的病原学诊断提供了一种新的有价值的诊断工具㊂现将N G S在临床上的部分应用进行综述㊂1N G S在20世纪70年代,S a n g e r等分别开发了通过链终止和片段化技术对D N A进行测序的方法,这些方法提供了破译完整基因以及整个基因组的工具,从而改变了生物学㊂S a n g e r等开发的第一代测序技术(S a n g e r测序)测序准确性高㊁读长较长,在人类基因组计划及其他领域取得重大成就,S a n g e r技术实现了2004年第一个人类基因组序列的完成[1]㊂随着科学技术的发展,第一代测序技术已不能满足目前全基因组测序的需求,因此出现了现在的新一代基因测序方法,即N G S技术,又称大规模平行测序或深度测序[2],包括第二代㊁第三代和第四代测序技术㊂目前,具有代表性的第二代测序平台有基因组测序仪㊁H i S e q2000和M i S e q㊁寡聚物连接检测测序(s e q u e n c i n g b y o l i g o l i g a t i o nd e t e c t i o n,S O L I D)5500X L㊁个人化操作基因组测序仪;第三代测序平台有H e l i S c o p e遗传分析系统和单分子实时测序技术;第四代测序技术有纳米孔测序技术[3]㊂代表性的第二代测序平台主要技术核心原理是桥式P C R和荧光可逆终止子的边合成边测序,先构建待测单链D N A 文库,形成寡核苷酸桥,进行P C R扩增㊁变性,切掉d N T P3'端延长终止基团,继续添加碱基进行测序; S O L I D测序技术是基于连接酶法,即利用D N A连接酶在连接过程中测序,单链D N A文库构建㊁微乳液P C R扩增以及连接酶测序;纳米孔测序技术为单分子测序,有高通量的G r i d I O N和U盘大小M i n I O N测序仪[4]㊂因D N A分子在电泳驱动下通过纳米微孔组成电路时可引起特征性电流变化,据此可确定D N A分子的碱基类型和排列顺序㊂其有生物纳米孔和固态纳米孔[5],后者较前者稳定性更好㊂㊃049㊃国际呼吸杂志2020年6月第40卷第12期I n t JR e s p i r,J u n e2020,V o l.40,N o.12Copyright©博看网. All Rights Reserved.现今N G S取得了令人瞩目的进展,正在发展成为分子显微镜,几乎涉及生物医学研究的每个领域[6]㊂2N G S在中枢神经系统感染中的应用单核细胞增生李斯特菌是一种革兰阳性㊁兼性细胞内细菌,可以污染食物,摄入后可导致多种动物感染,包括牲畜和人类㊂单核细胞增生李斯特菌感染的严重程度取决于细菌菌株的毒力和宿主的免疫状态[7]㊂由单核细胞增生李斯特菌引起的脑炎虽很罕见,但有时是致命的㊂使用常规脑脊液测试很难早期诊断,而N G S越来越多地用于检测病原体㊂Y a o等[8]收集了2014年1月至2014年10月期间入住北京协和医院的3例临床疑似李斯特菌脑膜脑炎的患者,征得同意后将3例患者纳入研究㊂在给予抗生素治疗之前,按照标准程序收集脑脊液,快速冷冻并在-20ħ下储存㊂此3例急性/亚急性脑膜脑炎患者磁共振成像和血培养提示疑似单核细胞增生李斯特菌的诊断,而脑脊液培养是阴性的㊂在以上3种情况下,对收集的脑脊液进行N G S 鉴定并测序,显示符合单核细胞增生李斯特菌的读数,并且获得了后期P C R检测结果的验证㊂首次报道了N G S在中枢神经系统李斯特菌感染中的应用㊂李斯特菌脑炎通常呈现双相病程㊂前驱症状包括发烧㊁头痛㊁恶心㊁呕吐,然后发展为进行性神经系统症状,甚至发展到呼吸衰竭[9]㊂此报道中有2例患者发生呼吸衰竭㊂因此,早期明确诊断和适当的早期抗生素治疗对预后至关重要㊂王小娟等[10]为明确5例中枢神经系统感染患者的致病微生物,采用血液与脑脊液常规㊁生化㊁细胞学㊁培养㊁革兰染色等检测方法,应用B G I S E Q-100测序平台进行脑脊液病原体测序㊂利用P r e m i e r设计了2对引物进行P C R 验证,扩增后采用A B IP r i s m a3730X L型基因分析仪对其进行测序分析㊂脑脊液N G S共检测到李斯特菌的核酸序列数57~2611条,平均7308条㊂样本检出李斯特菌序列数与检出微生物核酸总序列比值为1508%~9084%,平均6021%,检测深度为1,基因覆盖度为023%~1400%,平均380%㊂N G S在李斯特菌检测方面具有优势,在较低基因组覆盖下也可有效识别出细菌病原体[11]㊂病毒性脑炎是遗传性原发性免疫缺陷患者发病和死亡的主要原因,如X连锁性丙种球蛋白血症[12]㊂F r e m o n d等[13]报道了星状病毒感染的脑膜炎病例㊂患有X连锁性丙种球蛋白血症的14岁男孩,维持每3周高效价丙种球蛋白注射治疗,表现为进行性认知功能障碍㊁复发性癫痫发作,脑脊液㊁血液㊁痰和粪便等未发现病毒㊂脑脊液分析白细胞计数㊁葡萄糖水平和蛋白质水平是正常的,P C R和R T-P C R是阴性的,右侧额叶脑组织活检㊁组织学结果无特异性㊂采用N G S进行深度测序并进行分析,鉴定了星状病毒基因组大片段,显示出与V A1/HMO-C进化枝高水平同源性,获得了完整的基因组,并将该新菌株命名为HA s t V-V A1/HMO-C-P A㊂更改治疗方案联合静脉注射利巴韦林治疗,患者运动行为㊁认知得到改善㊂N G S其中一个主要优点就是不仅限于细菌病原体,还可以检测鉴定真菌和病毒[14-15]㊂N G S在疾病诊断中的可用性越来越高㊂3N G S在肺部感染中病原体检测作用肺部感染病发率较高,是临床很常见的呼吸系统感染性疾病,治疗不及时会发展为重症肺炎㊁呼吸衰竭等,预后很差,病死率高,严重威胁人类健康㊂H e等[16]报告了3例侵袭性肺曲霉菌病(i n v a s i v e p u l m o n a r y a s p e r g i l l o s i s, I P A),其传染性强,病死率高㊂但I P A的临床诊断却很困难,很难获得微生物学证据㊂患者行常规的抗感染治疗症状未见好转㊂对以上3例患者进行支气管肺泡灌洗,使用N G S对支气管肺泡灌洗液(b r o n c h o a l v e o l a r l a v a g ef l u i d, B A L F)进行测试㊂在收到样品后48h内,N G S即检测到3例患者B A L F中烟曲霉的序列读数㊂其中2例患者B A L F 中的曲霉半乳甘露聚糖检测为阳性,1例患者使用传统方法检测为阴性,包括血清半乳甘露聚糖检测和B A L F半乳甘露聚糖检测均为阴性,痰培养未发现真菌㊂即使接受治疗,患者仍有反复发热㊁咳痰㊁胸闷等症状,最后B A L F 通过N G S检测到烟曲霉,证实为I P A㊂3例患者均给予伏立康唑抗真菌治疗,上述症状逐渐好转,复查胸部C T病灶明显吸收㊂I P A是一种致命的机会性真菌感染,常发生于血液系统恶性肿瘤患者㊂然而在非传统宿主中也报道了许多I P A病例,尤其是C O P D患者[17]㊂在这些非中性粒细胞减少患者中,更容易发生误诊事件[18]㊂因此,早期明确肺曲霉菌病诊断具有重要意义㊂P a r i z e等[19]报道了一项多中心前瞻性研究,采用N G S技术对101例免疫缺陷患者进行病原体检测,同时送检血清㊁咽拭子㊁穿刺液体等标本㊂该前瞻性研究结果表明N G S较传统检测方法有较高的检出率以及更高的阴性预测值(64/65,95%C I:095~1)㊂N G S可检测出更多临床相关的病毒和细菌㊂因此,N G S是免疫功能受损或免疫缺陷患者病原体诊断的前景方法㊂P e n d l e t o n等[20]使用宏基因组学检测呼吸道病原体,报道了患有结缔组织病相关间质性肺炎的41岁女性患者和59岁败血症男性患者,使用宏基因组测序分别快速检测出铜绿假单胞菌菌株和金黄色葡萄球菌菌株㊂N G S在加速和改善临床常见致命疾病的诊断和治疗方面具有很大潜力㊂结核分枝杆菌在肺部感染的病原体中也占据了重要部分㊂N o m u r a等[21]进行了一项回顾性研究,在心脏手术期间暴露于受污染的加热器-冷却器装置的患者容易感染分枝杆菌嵌合体(M c h i m a e r a)㊂抗酸杆菌培养的诊断金标准通常需要侵入性取样㊂研究人员采用N G S方法对10例曾做过心脏手术的患者的血浆进行检测,同时对获取的标本进行抗酸杆菌培养㊂血浆N G S检测到10例患者中有9例患有侵袭性疾病,其检测所需的中位时间为4d㊂其中7例患者血浆N G S是第一个提供M c h i m a e r a感染病原学确认的试验㊂相反,抗酸杆菌培养物转为阳性所需的中位时间为20d,确认M c h i m a e r a的中位时间为41d㊂该队列中获得的24个抗酸杆菌血培养物中,仅4个(17%)为阳性㊂其中90%的患者进行了侵入性手术,并且仅在5例患者(50%)的标本培养中提示了分枝杆菌生长㊂M c h i m a e r a感染的患者因潜伏期较长以及其非特异性症状而不易被识别[22]㊂因此血浆N G S可以比抗酸杆菌培养物更快更准确㊃149㊃国际呼吸杂志2020年6月第40卷第12期I n t JR e s p i r,J u n e2020,V o l.40,N o.12Copyright©博看网. All Rights Reserved.地检测M c h i m a e r a,使其成为一种很有价值的新型诊断工具㊂另一方面,结核分枝杆菌耐药也是全世界主要的健康问题之一㊂K o等[23]应用N G S对易感结核分枝杆菌菌株和耐药菌株进行遗传分析,并通过估算N G S的阳性预测值和阴性预测值来检测菌株的耐药性㊂研究人员在H a l l y m大学医学中心收集了36株从临床标本中分离的结核菌株,通过培养基制作㊁核酸提取㊁P C R和基因测序㊁生物学信息分析㊁估计预测值及统计分析综合程序得出结果,共有24种变体与耐药性相关,基因型和表型都一致对异烟肼㊁利福平㊁乙胺丁醇敏感,对链霉素㊁阿米卡星反应较差,所有药物类别阴性预测值均大于97%,而阳性预测值为44%~ 100%㊂该研究成功地应用N G S进行了结核分枝杆菌耐药性㊁敏感菌株的遗传分析,获得了多态性和可能多态性列表,有可能成为在分枝杆菌试验中应用N G S的测试指导㊂肺部感染的病原体很多,其中病毒感染也占据了重要的位置,而且病毒结构非常简单,且更易突变,临床上不易检测到㊂Y a n g等[24]使用大量寡核苷酸探针来富集34种呼吸D N A和R N A病毒的序列,减少N G S数据中的非病毒读数并实现了基于N G S测序病原体鉴定的高性能㊂N G S 在靶向检测呼吸道病毒方面使用l l u m i n aM i S e q系统扩增和测序富集文库,实现了与分子测定相当的病毒检测灵敏度,并获得了每种病毒的部分甚至完整的基因组序列以获得精准的基因分型和变体分型㊂W o l l a n t s等[25]报道了1例中老年男性感染西尼罗河病毒,它是一种广泛存在的全球再生病原体,感染初始可能仅有流感样症状,随着病情发展可导致多脏器功能衰竭等危重情况㊂入院血象㊁尿沉渣㊁胸片㊁超声等均正常,对B A L F进行多重P C R检测,结果显示22种不同的呼吸道病原体呈阴性㊂结核分枝杆菌的单重P C R结果也为阴性㊂免疫荧光和P C R检测卡式肺囊虫的结果仍是阴性㊂脑脊液分子诊断结果显示13种病原体呈阴性,血清学检测显示12种病原体呈阴性㊂采取N G S对B A L F样本和病毒培养物进行检测,对N G S结果分析,确定了完整的西尼罗河病毒基因组(11060n t)㊂并且在B A L F标本和细胞培养物上进行新的R N A提取和新开发引物逆转录P C R,并进行S a n g e r测序,该阳性标本序列与来自N G S获得的完整基因组的序列相同㊂分子检测是用于诊断呼吸道病毒性病原体的金标准方法,N G S较R T-P C R相比可提供更多的病毒序列和分型信息㊂所以,在传统方法检测病原体阴性时,N G S可成为识别临床标本中未知病原体的有力工具㊂4N G S在脓毒血症中进行病原体检测脓毒症是由血流感染所引起的临床综合征,并且脓毒性休克是患者对治疗措施反映出治疗不佳的一种临床表现[26]㊂脓毒血症患者病死率在全球范围内很高,尤其是在不能及时明确病原体和抗生素非合理使用的情况下病死率会进一步增加[27]㊂A b r i l等[28]报道了1例牧羊犬咬伤的60岁男性患者,1周后出现体温升高㊁心率加快㊁血压下降,经验使用广谱抗生素治疗㊂入院血培养阴性,脑脊液革兰染色和单纯疱疹病毒P C R均为阴性㊂收集患者血浆标本进行N G S,24h内N G S分析检测到高水平微生物D N A,其读数沿整个犬咬二氧化碳嗜纤维菌(Cc a n i m o r s u s)基因组排列,检测出Cc a n i m o r s u s,之后并对血培养物分离进行16S r R N A测序确认㊂该病例首次报告了其在脓毒症重症患者中的应用,突出了N G S在临床有限时间范围内提供相关诊断性数据的巨大希望,并对改善抗生素治疗具有重要意义㊂G r u m a z等[29]报道了1篇关于N G S技术应用于脓毒症患者病原体检测的观察性研究,纳入了25例患者,其中包括7例脓毒症患者㊁12名健康志愿者㊁6例接受过腹部手术的患者(在该研究中分析了不同时间点的血浆),总计62份血浆样本,同时进行厌氧血培养㊁需氧血培养㊁P C R 检测㊁伤口拭子㊁导管和粪便标本培养,以及N G S对血浆标本进行检测㊂脓毒性休克患者的c f D N A浓度水平增加(平均19723μg/L),尤其在脓毒症发病期间(平均37730μg/L);并且与对照组相比发病期间脓毒症患者的平均分类读数较高(982%),明显高于健康组(350%)和腹部手术前组(264%),这表明脓毒症患者细菌负荷较高㊂而且在血浆样本中发现了来自致病细菌显著水平的D N A片段,检测出病原体有阴沟肠杆菌㊁金黄色葡萄球菌㊁单纯疱疹病毒㊁肺炎克雷伯菌㊁脆弱拟杆菌,并在28d试验期内完善通过传统方法检测到的病原体数据,其与N G S检测结果匹配,从而得到证实㊂所以,该方法有望成为脓毒血症患者比较有前景的诊断方式㊂5结语与展望现今感染性疾病发病率越来越高,随之而来的疑难病原体感染发生率也逐渐增加,从而加大了临床医师诊治的难度㊂若诊断不明确㊁治疗不及时,病情会迅速进展,乃至发生重症炎症㊁多脏器功能衰竭等危重疾病,甚至死亡㊂N G S技术不断发展,改变了基因组分析,为临床微生物实验室的应用开辟了很多新机会,其快速无偏的特性补充了传统方法检测病原体的不足,有很好的临床使用价值㊂但N G S目前仍缺乏相关公认的标准,又因价格较昂贵,临床上仍以传统方法检测为主,目前N G S总体使用率仍不高㊂但随着社会的快速发展,有理由相信N G S在未来临床感染性疾病中的使用会更加广泛,利用其快速精准明确病原体的优势,成为临床上一项重要的医学检验技术㊂利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突参考文献1v a nD i j k E L A u g e r H J a s z c z y s z y n Y e ta l T e n y e a r so fn e x t-g e n e r a t i o ns e q u e n c i n g t e c h n o l o g y J T r e n d s G e n e t2014309418-426D O I101016j t i g2014070012 B e h j a t iS T a r p e y P S W h a t i sn e x t g e n e r a t i o ns e q u e n c i n gJ A r c h D i sC h i l dE d u cP r a c tE d2013986236-238D O I101136a r c h d i s c h i l d-2013-3043403 H o d k i n s o n B P G r i c e E A N e x t-g e n e r a t i o n s e q u e n c i n g ar e v i e w o f t e c h n o l o g i e s a n d t o o l s f o r w o u n d m i c r o b i o m er e s e a r c h J A d v W o u n dC a r e N e w R o c h e l l e20154150-58D O I101089w o u n d2*******4 F e n g Y Z h a n g Y Y i n g C e ta l N a n o p o r e-b a s e df o u r t h-g e n e r a t i o n D N A s e q u e n c i n g t e c h n o l o g y J G e n o m i c s㊃249㊃国际呼吸杂志2020年6月第40卷第12期I n t JR e s p i r,J u n e2020,V o l.40,N o.12Copyright©博看网. All Rights Reserved.P r o t e o m i c sB i o i n f o r m a t i c s2*******-16D O I101016j g p b2015010095 M a t t e i T A B i o m i m e t i c n a n o p o r e s a n e w a g e o f D N As e q u e n c i n g J W o r l d N e u r o s u r g2014823-4252-254D O I101016j w n e u2014060496 B u e r m a n sH P d e n D u n n e nJ T N e x t g e n e r a t i o ns e q u e n c i n gt e c h n o l o g y a d v a n c e sa n da p p l i c a t i o n s J B i o c h i m B i o p h y sA c t a20141842101932-1941D O I101016j b b a d i s2014060157 B e c a t t i n iS L i t t m a n n E R C a r t e r R A e t a l C o mm e n s a lm i c r o b e s p r o v i d e f i r s t l i n e d e f e n s e a g a i n s t l i s t e r i a m o n o c y t o g e n e s i n f e c t i o n J JE x p M e d201721471973-1989D O I101084j e m 201704958 Y a o M Z h o u J Z h u Y e t a l D e t e c t i o n o f l i s t e r i am o n o c y t o g e n e s i n C S F f r o m t h r e e p a t i e n t s w i t h m e n i n g o e n c e p h a l i t i s b y n e x t-g e n e r 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o.12Copyright©博看网. 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N G S在临床中的应用 Revised by Petrel at 2021高通量测序在临床分子诊断中的应用与展望对于单基因遗传病，以往临床实验室主要借助于Sanger测序、等位基因特异性聚合酶链反应（allele-specificpolymerasechainreaction，AS-PCR）、荧光原位杂交、DNA印记杂交等技术进行检验。
NGS技术针对癌症、心血管疾病、肾病、糖尿病等复杂性疾病的遗传学筛查与诊断提供了便捷的途径。
另外，NGS技术在病原微生物的快速鉴定、药物的靶向治疗以及产前筛查等多个领域具有潜在的应用优势。
1测序技术的发展及性能比较2006年，Illumina公司推出了Solexa测序平台。
目前，该公司已经推出了多种型号的测序平台，如MiSeq、HiSeq、NextSeq等系列，其中MiSeq系列适合于小型基因组测序，HiSeq系列适用于大型基因组测序。
2007年，美国应用生物系统公司推出SOLiD测序平台。
该平台采用五轮测序法以4色荧光标记寡核苷酸的连接合成为基础，测序准确性得以提高。
2010年，美国生命科学公司和太平洋生物科学公司分别发布了半导体测序平台和第3代单分子实时（singlemoleculerealtime，SMRT）DNA测序平台。
这2种测序技术与以往的基于光学信号的检测技术不同，半导体测序平台通过半导体芯片直接感应在序列合成过程中磷酸二酯键3'OH基团释放的质子；第3代测序仪通过纳米孔技术记录单个聚合酶在不受干扰情况下连续合成，其中PacBioRSII每次运行能够产生60000×16条序列，每条序列的平均长度达8500bp。
一般来说，以上每种测序仪在序列读段长度、准确性、测序通量、价格等多个方面存在一定的差异。
焦磷酸测序平台测序读段较长，测序通量较低，成本相对较高；Illumina系列平台产生的读段相对较短，测序费用相对较低，应用比较广泛；SOLiD测序平台在通量和准确性方面相对以上2种类型的测序平台有明显改善，但是测序长度更短；半导体测序平台以及SMRT测序平台相比其他测序平台运行时间较短，另外单分子测序平台减少了测序前的扩增准备工作，测序读段较长，但是测序成本和错误率都相对较高[8-10]。
2021基因测序论文（核心期刊范文8篇）范文 基因测序技术是分子生物学、生物工程领域一项重要的基础技术手段，其应用前景非常广泛，现已在生物学、基础医学等领域发挥着重要作用。
本文汇总了8篇“基因测序论文范文”，以供参考和研究。
基因测序论文（核心期刊范文8篇）之第一篇：基因测序技术发展及生物医学应用 摘要：基因测序技术在分子生物学和基础医学领域应用广泛,已经从第一代发展到第四代:第一代测序技术测序精确, 是常用的单基因病诊断技术, 但通量较低, 成本高;第二代测序技术测序通量提高, 在临床上发挥重要作用;第三代测序技术在测序通量、时间和成本方面都有极大改善;第四代测序技术还在实验阶段。
本文主要介绍了第一代、第二代和第三代测序技术的优缺点和在生物医学领域的应用, 第四代测序技术的研究进展。
关键词：基因测序,基因诊断,生物医学 基因组携带了个体的全部遗传信息,基因测序能够加深对疾病尤其是恶性肿瘤的分子机制理解, 在诊断与治疗方面都发挥着重要作用。
人类基因组学计划完成后, 基因测序技术的发展更加迅猛, 在临床实践和基础研究中的应用更加广泛。
化学裂解法是基于PCR的DNA测序法[1], 可以对未知基因进行检测, 但是不能读取长的PCR产物片段, 所以很快被Sanger的双脱氧链末端终止法取代, 此为第一代基因检测技术。
以高通量为特点的下一代基因测序技术 (Next Generation Sequencing, NGS) 包括大规模平行签名测序 (Massively Parallel Sequencing, MPS) 、聚合酶克隆测序 (Polony Sequencing) 和连接测序 (Sequencing-by-Ligation) 等, 此为第二代检测技术, 是目前应用最为普遍的测序技术。
目前第三代测序技术单分子实时测序已经成熟, 而以纳米孔为基础的第四代测序技术也已崭露头角。
本文简要概括了四代基因测序技术的发展特点及其生物医学应用。
ngs 原理NGS（Next Generation Sequencing）是新一代测序技术的缩写，是一种高效、高通量的DNA测序技术。
NGS技术的原理是将DNA样本分离成许多小片段，然后同时进行大规模的并行测序。
通过这种方式，NGS技术能够在较短的时间内获得大量的DNA测序数据。
NGS技术的原理主要包括DNA文库构建、片段扩增、测序和数据分析等步骤。
首先，需要将DNA样本进行处理，使其适合用于测序。
这包括DNA的纯化、断裂、末端修复和连接等步骤。
接下来，通过PCR扩增的方式将DNA片段进行放大，以便进行后续的测序。
在测序过程中，NGS技术采用不同的方法，如Illumina测序、Ion Torrent测序等，来测定DNA片段的碱基序列。
最后，通过数据分析软件对测序结果进行处理和解读，从而获得DNA样本的完整序列信息。
相比传统的测序技术，NGS具有许多优势。
首先，NGS技术具有高通量的特点，能够在较短的时间内获得大量的测序数据，从而提高测序效率。
其次，NGS技术具有高灵敏度，能够检测到低频突变和低拷贝数的DNA序列，对于疾病的早期诊断和基因变异的检测具有重要意义。
此外，NGS技术还具有较低的成本，使得大规模的基因组测序成为可能，为研究人员提供了更多的数据资源。
NGS技术的应用非常广泛。
在医学领域，NGS技术可以用于疾病的诊断和治疗。
通过对病人的基因组进行测序，可以发现潜在的致病基因和药物靶点，为个体化医疗提供依据。
在生物学研究中，NGS技术可以用于基因组学、转录组学、表观基因组学等研究领域。
通过对不同生物体中基因组的测序，可以揭示基因的组成和结构，探索基因的功能和调控机制。
此外，NGS技术还可以用于环境监测、农业科学和人类进化等方面的研究。
尽管NGS技术具有许多优势，但也存在一些挑战。
首先，NGS技术在测序过程中会引入一定的误差，如测序错误和放大偏差等。
这些误差对于数据的准确性和可靠性有一定影响，需要通过数据分析和校正来解决。
附件1肿瘤相关突变基因检测试剂（高通量测序法）性能评价通用注册技术审查指导原则本指导原则旨在指导注册申请人对肿瘤相关基因检测试剂分析性能评价注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门对注册申报资料的技术审评提供参考。
本指导原则是针对肿瘤相关基因检测试剂分析性能评价的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。
本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但需要详细阐明理由，并对其科学合理性进行验证，提供详细的研究资料和验证资料，相关人员应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。
本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制定的，随着法规和标准的不断完善，以及科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。
一、适用范围本指导原则所述肿瘤相关基因检测试剂分析性能评价主要是指基于高通量测序（high-throughput sequencing）即下一代测—1 —序（next generation sequencing，NGS），又称为大规模平行测序（massively parallel sequencing，MPS），体外检测人体组织肿瘤细胞中的肿瘤相关基因变异。
用于检测体细胞突变的NGS正在广泛用于肿瘤诊疗相关的分子检测，包括对特定基因的DNA/RNA进行测序，以寻找与肿瘤临床诊疗相关的基因变异。
肿瘤基因突变类型包括点突变、插入、缺失、基因重排、拷贝数异常等广义的基因突变。
基于NGS测序原理的体外诊断（In Vitro Diagnosis，IVD）检测可能包括以下步骤：样本收集、处理和保存、核酸提取及处理、文库制备、测序和碱基识别、序列比对、变异识别和过滤、变异注释和解读以及检测报告的生成。
NGS技术在肿瘤个体化治疗中的应用研究引言：肿瘤是世界范围内一种常见病，其发病率和死亡率仍然居高不下。
多年来，人们持续不断地进行着与肿瘤治疗相关的研究和探索，目的是为了找到更有效的治疗方法。
近年来，基因组测序技术（Next Generation Sequencing，NGS）在肿瘤的个体化治疗方面取得了显著的突破。
本文将探讨NGS技术在肿瘤个体化治疗中的应用研究。
一、肿瘤个体化治疗的概念和意义肿瘤个体化治疗，也被称为精准医学或个性化治疗，是根据患者肿瘤的个体遗传特征和其它相关因素，通过对患者进行基因组测序和分析，来制定适合患者个体情况的治疗方案。
相较于传统的肿瘤治疗方法，个体化治疗可以更准确地指导治疗方案的制定，从而提高治疗的成功率和患者的生存率。
因此，肿瘤个体化治疗被认为是未来肿瘤治疗的一个重要发展方向。
二、NGS技术在肿瘤个体化治疗中的应用1. 肿瘤基因组测序NGS技术可以快速高效地对肿瘤样本进行基因组测序，以获取肿瘤细胞中遗传变异的信息。
通过对肿瘤基因组的测序分析，可以发现肿瘤细胞中潜在的致病突变和基因的异常表达，为制定个体化治疗方案提供依据。
同时，肿瘤基因组测序还可用于监测肿瘤的进展和转移，以及评估肿瘤治疗的效果。
2. 靶向治疗的指导NGS技术不仅可以揭示肿瘤的遗传变异，还可以预测肿瘤对特定药物的敏感性。
通过整合多组学数据，如基因组、转录组和蛋白质组等信息，可以寻找到与肿瘤发生和发展相关的关键突变，并进一步预测肿瘤对特定靶向治疗药物的敏感性。
这种个体化的药物选择可以增强治疗的针对性，提高抗肿瘤疗效。
3. 肿瘤免疫治疗的筛选免疫治疗是目前最热门的肿瘤治疗方法之一。
NGS技术可以用于分析肿瘤细胞的免疫组库，并发现肿瘤细胞中存在的免疫逃逸机制和潜在的靶点抗原。
通过对患者肿瘤免疫组库的分析，可以评估免疫疗法的应用前景，并为制定个体化的免疫治疗方案提供依据。
4. 微环境治疗的优化肿瘤微环境是肿瘤细胞周围的细胞和分子组成的复杂网络系统。
创新的NGS液体活检技术用于检测低频肿瘤突变Oncomine cfDNA肺癌研究试剂盒的产品经理Thomas Bittick发表了《创新的NGS液体活检技术用于检测低频肿瘤突变》的主题演讲。
Thomas Bittick是Thermofisher最新开发的Oncomine cfDNA肺癌研究试剂盒的产品经理。
他先介绍了液体活检和实体瘤检测的差异，让大家更加了解在无法获取病人组织样本时，采用液体活检方法也一样能够及时地对病人开展检测，并且是更适合对经过治疗的病人进行预后监控和管理。
由此引出Thermofisher基于NGS Ion半导体高通量测序平台的液体活检解决方案，在2天的时间内即可完成从血浆样本到用药建议报告的完整流程。
这套方案中包含通过磁珠分选的方式从血浆冲提取病人的cfDNA，配合高灵敏度的Oncomine cfDNA肺癌研究试剂盒，在最先进的Chef及S5全自动化测序平台上完成实验部分，最终结果经过Oncomine Knowledgebase数据库的全面解析，可以获得一份和突变信息匹配的目前欧美药监局批准的药物建议和全球正在开展的公开临床实验信息报告。
Thermofisher解决方案不仅仅是便捷的操作和一键式的分析系统，Oncomine cfDNA 肺癌研究试剂盒还是一款高灵敏度高精确度的检测试剂盒。
当cfDNA样本量仅有20ng的情况下，该试剂盒可以达到0.1%的检测下限。
当然，即使仅有1ng的cfDNA样本，也可以同样进行检测，只是限于其中DNA拷贝数的限制，自然不可能出现0.1%的突变。
这款试剂盒可以检测肺癌最常见的11个基因中超过168个的SNV及Indel突变。
由于采取了全新的专利捕获技术，修正了常规PCR中容易引入的扩增错误，针对0.1%的突变，特异性也可以达到98%。
液体活检中最重要的就是结果的准确性。
Thomas给大家详细介绍了在研发这款试剂盒时，我们的研发团队做非常多细致严谨的验证工作。
临床分子病理实验室二代基因测序检测专家共识近年二代基因测序（next—generation sequencing，NGS)技术快速发展,其应用已进展至临床检测，如遗传疾病、实体肿瘤、血液肿瘤、感染性疾病、人类白细胞抗原分析及非侵袭性产前筛查等。
国内外有关学会已出台相关共识与指南以推动其在临床中的应用。
中华医学会病理学分会和中国抗癌协会肿瘤病理专委会前期组织病理、临床、生物信息等专家进行了充分讨论，拟在NGS的操作流程、数据处理、结果解读等方面作规范和建议，以规范NGS在分子病理领域的应用。
临床分子病理实验室NGS样本可采用甲醛固定石蜡包埋组织(formalin-fixedparaffin—embedded，FFPE）、新鲜组织、各种体液上清液、体液离心细胞块、石蜡包埋标本和血浆/血液标本等。
本共识特色是基于病理评估的组织样本（FFPE、新鲜）的规范。
测序分析范围基于目前临床需求，本共识着重在于目标区域测序（panel）分析的实践。
随着技术的更新和应用的成熟，本共识将持续更新以满足临床需求。
一、实验室总体要求NGS检测实验室的总体设计与要求应参考《分子病理诊断实验室建设指南(试行）》、《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》、《个体化医学检测质量保证指南》、《肿瘤个体化治疗检测技术指南》、《个体化医学检测实验室管理办法》、《测序技术的个体化医学检测应用技术指南（试行)》进行。
1。
NGS检测人员的资质要求:NGS检测技术人员应具备临床病理学、分子生物学的相关专业大专以上学历，并经过NGS 技术的理论与技能培训合格。
数据分析人员应具有临床医学或分子生物学或遗传学知识背景并经生物信息学培训。
最终报告应由中级或硕士以上具有病理学背景、经培训合格的本单位执业医师或者授权签字人(医学博士学位或高级职称）审核。
2.NGS检测实验室的区域设置要求：原则上NGS实验室应当有以下分区：样本前处理区、试剂储存和准备区、样本制备区、文库制备区、杂交捕获区/多重PCR区域（第一扩增区）、文库扩增区（第二扩增区）、文库检测与质控区、测序区、数据存贮区.各工作区空气及人员流向需要严格按照《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》.分区可根据实际情况合并，但是在前处理和建库时，血液样本应与组织样本分开. 3。
肿瘤生物标志物TMB的挑战和研究进展肿瘤突变负担（TMB），定义为癌症基因组中存在的体细胞非同义突变总数，在癌症类型中各不相同。
TMB是衡量肿瘤突变数量的指标；突变越多，新抗原越多，其中一个或多个自身新抗原具有免疫原性并触发T细胞反应的几率就越高。
许多研究报告了较高的TMB和ICI疗效之间的联系，表明TMB可能是一个良好的预测性生物标记物。
2020年6月16日，FDA批准了Pembrolizumab用于治疗不可切除或转移性的高肿瘤组织样本突变负荷（TMB-H）≥10个突变/Mb的成人和儿童实体瘤患者。
然而，TMB对所有癌症类型的适用性和最佳阈值仍尚待确定。
目前，对TMB的研究正在沿着三条主要途径推进：通过实验室中严格的质量控制措施，包括减轻混淆因素，如有限的小组范围和低肿瘤纯度，加强TMB评估；通过引入克隆、持续性或HLA校正的TMB、肿瘤新抗原负荷和突变特征等创新概念，完善传统的TMB框架；以及TMB与已建立和新兴的生物标志物的整合，如PD-L1表达、微卫星不稳定性、免疫基因表达谱和肿瘤免疫背景。
鉴于TMB在癌症发病机制和免疫系统识别肿瘤能力中的关键功能，深入理解TMB 的基本原理和持续进化对肿瘤学领域至关重要。
TMB的定义及测定TMB的概念定义是肿瘤标本中出现的突变总数。
根据不同的方法，针对TMB考虑的基因改变类型的实际定义有所不同。
TMB的特征最初是通过全外显子组测序（WES）来完成的，WES本质上认为遗传改变仅限于外显子（编码区域）。
WES的TMB计算包括编码区的非同义突变，并通过减去匹配的正常样本排除种系变化。
基金会医学开发的324个基因（相当于1.1MB编码基因组）的全面基因组分析检测试验（FoundationOne），被证实是WES对TMB的准确评估。
最近，FDA批准了该检测方法，作为对于>10个突变/Mb的TMB患者使用pembrolizumab的辅助诊断。
FoundationOne分析还包括其TMB中的同义突变和内含子区的插入缺失标记（Indels），这些都不包括在WES 中。
