雌激素对兔脊髓缺血再灌注损伤的保护作用

２０１　３年１２月第３卷第２３期　・基础医学・　

雌激素对兔脊髓缺血再灌注损伤的保护作用　

金建文　周常宝　黄福云　刘俊乐　１．福建卫生职业技术学院附属省级机关医院心内科，福建福州３５０１０１；２．解放军７３１２１部队医院，　福建福州３５００１２；３．解放军总医院麻醉手术中心，北京１００８５３　

［摘要】目的探讨雌激素对兔脊髓缺血再灌注损伤的神经保护效应。方法成年新西兰大白兔肾下腹主动脉钳夹　

２０ｍｉｎ恢复再灌注。实验分组如下：Ｃｏｎｔｒｏｌ组（ｎ＝８）仅行肾下腹主动脉钳夹２０ｍｉｎ恢复再灌注；Ｓｈａｍ组（ｎ＝８）　行对照组操作除外肾下腹主动脉钳夹；雌激素处理组（ｎ＝８）分别在再灌注开始即刻经兔耳缘静脉给予雌激素　

２００，４００，８００　ｇ／ｋｇ。再灌注后４８ｈ进行下肢神经功能评分（Ｔａｒｌｏｖ法）后处死受试动物，取脊髓行组织ＨＥ　

染色切片病理分析。结果Ｔａｒｌｏｖ评分发现雌激素处理组神经功能评分明显高于ｃｏｎｔｒｏｌ组（尸＜０．０５　ｏ组　

织病理分析可见脊髓前角运动神经元凋亡，坏死较明显。雌激素处理组脊髓前角运动神经元计数明显多于Ｃｏｎｔｒｏｌ　

组（Ｐ＜０．０１）。结论兔脊髓缺血后静脉给予雌激素可明显改善下肢神经功能，增加脊髓前角正常运动神经元数量，　

减轻缺血再灌注损伤。　

【关键词】雌激素；缺血再灌注；神经保护　【中图分类号】Ｒ３１８．５　［文献标识码】Ａ　［文章编号】２０９５—０６１６（２０１３）２３—３５—０４　

Ｔｈｅ　ｎｅｕｒ０ｐｒ０ｔｅｃｔｉＶｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｅｓｔｒｏｇｅｎ　ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ　ｔｏ　ｒａｂｂｉｔｓ　

ａｆｔｅｒ　ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ　ａｇａｉｎｓｔ　ｉｓｃｈｅｍｉａ－ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ　ｉｎｊ　ｕｒｙ　

Ｊ／Ｎ　Ｊｉａｎｗｅｎ　ＺＨＯＵ　Ｃｈ￣ｇｂ．Ｊ　ＨＵＡＮＧ脚ｎ２　Ｌ／Ｕ　Ｊｕｎｊｅ；３　

１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ，Ｆｕｊｉａｎ　Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ　Ｕｎｉｔ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｆｕｊｉａｎ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｆｕｚｈｏｕ　３５０１０１，Ｃｈｉｎａ；２．Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｐｅｏｐｌｅ’Ｓ　Ｌｉｂｅｒａｔｉｏｎ　Ａｒｍｙ　７３　１２１　Ｍｉｌｉｔａｒｙ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｆｕｚｈｏｕ　３５００１２，Ｃｈｉｎａ；３．Ａｎａｅｓｔｈｅｓｉａ　ａｎｄ　Ｏｐｅｒａｔｉｏｎ　Ｃｅｎｔｅｒ，Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｐｅｏｐｌｅ’ｓ　

Ｌｉｂｅｒａｔｉｏｎ　Ａｒｍｙ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１００８５３，Ｃｈｉｎａ　［ＡｂｓｔｒａｃｔｌＯｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｎｅｕｒｏ—ｐｒ０ｔｅｃｔｉｖｅ　ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｅｓｔｒｏｇｅｎ　ｉｎ　ｒａｂｂｉｔｓ　ａｆｔｅｒ　ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ　ａｇａｉｎｓｔ　ｉｓｃｈｅｍｉａ－　ｒｅｐｅｆｆｕｓｉｏｎ（Ｉ／Ｒ）ｉｎｊｕｒｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｂｄｏｍｉｎａｌ　ａｏｒｔａ　ｗａｓ　ａｐｐｌｉｅｄ　ｔｏ　ａｄｕｌｔ　ｒａｂｂｉｔｓ，￣ｌｌｏｗｅｄ　ｂｙ　ｒｅｍｏｖａｌ　

ｏｆ　ａｏｒｔｉｃ　ｃｌａｍｐ　ａｎｄ　ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ．Ｔｈｅ　ａｂｄｏｍｉｎａｌ　ａｏｒｔａｓ　ｏｆ　Ｎｅｗ　Ｚｅａｌａｎｄ　Ｗｈｉｔｅ　ａｌｂｉｎｏ　ｒａｂｂｉｔｓ　ｗｅｒｅ　ｏｃｃｌｕｄｅｄ　ｆｏｒ　２０　ｍｉｎ．　

Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｇｒｏｕｐｓ　ｗｅｒｅ　ａｓ￣ｌｌｏｗｓ：Ａｎｉｍａｌｓ　＝８）ｉｎ　ａ　ｓｈａｍ　ｇｒｏｕｐ　ｕｎｄｅｒｗｅｎｔ　ｔｈｅ　ｓｕｒｇｉｃａｌ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ　ｂｕｔ　ｔｈｅ　ａｏｒｔａ　ｗａｓ　ｎｏｔ　ｏｃｃｌｕｄｅｄ．Ｉｎ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ，ａｎｉｍａｌｓ　＝８）ｗｅｒｅ　ｓｕｂｊｅｃｔｅｄ　ｔｏ　ｓｐｉｎａｌ　ｃｏｒｄ　ｉｓｃｈｅｍｉａ　ｂｕｔ　ｒｅｃｅｉｖｅｄ　ｎｏ　ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃ　

ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ，ａｎｄ　ｅｓｔｒｏｇｅｎ—ｔｒｅａｔｅｄ　ｇｒｏｕｐ　＝８）ｅａｃｈ　ｇｒｏｕｐ）ｒｅｃｅｉｖｅｄ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｏｎｌｙ　２００，４００，８００　ｇ／ｋｇ　ｅｓｔｒｏｇｅｎ　ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓｌｙ　ｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙ　ａｆｔｅｒ　ｔｈｅ　ｏｎｓｅｔ　ｏｆ　ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ　ｓｔａｔｕｓ　ｗａｓ　ａｓｓｅｓｓｅｄ　ａｔ　４８ｈ　ａｆｔｅｒ　ｔｈｅ　ｏｐｅｒａｔｉｏｎ．Ｅｖｅｒｙ　ａｎｉｍａｌ　

ｗａｓ　ｋｉｌｌｅｄ　ａｔ　４８　ｈｏｕｒ　ａｆｔｅｒ　ｔｈｅ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ．Ｓｐｉｎａｌ　ｃｏｒｄｓ　ｗｅｒｅ　ｈａｒｖｅｓｔｅｄ　ｆｏｒ　ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ　ａｎａｌｙｓｅｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｔｏ　Ｔａｒｌｏｖ’ｓ　ｓｃａｌｅ，ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ　ｓｔａｔｕｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒａｂｂｉｔｓ　ａｔ　ｐｏｓｔｏｐｅｒａｔｉｖｅ　４８　ｈｏｕｒ　ｗａｓ　ｂｅｔｔｅｒ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｅｓｔｒｏｇｅｎ—ｔｒｅａｔｅｄ　ｇｒｏｕｐ　

ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｔｏ　ｔｈｅ　Ｉ／Ｒ　ｇｒｏｕｐ．Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ　ａｎａｌｙｓｅｓ　ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ　ｔｙｐｉｃａｌ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ　ｏｆ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　

ｓｅｒｉｏｕｓｌｙ　ｉｎ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０１），Ｔｈｅｒｅ　ｗｅｒｅ　ｍｏｒｅ　ｎｏｒｍａｌ　ｍｏｔｏｒ　ｎｅｕｒｏｎｓ　ａｔ　ａｎｔｅｒｉｏｒ　ｈｏｒｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｐｉｎａｌ　ｃｏｒｄ　ｉｎ　ｅｓｔｒｏｇｅｎ　

ｇｒｏｕｐｓ　ｔｈａｎ　ｔｈｏｓｅ　ｉｎ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ　＜０．０１）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｅｓｔｒｏｇｅｎ　ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ　ａｆｔｅｒ　ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ　ｍａｙ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｒｅｄｕｃｅ　ｔｈｅ　ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ　ｏｆ　ｓｐｉｎａｌ　ｃｏｒｄ　ｉｎｊｕｒｙ　ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ　ｔｅｍｐｏｒａｒｙ　ａｏｒｔｉｃ　ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ．　

［Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ］Ｅｓｔｒｏｇｅｎ；Ｉｓｅｈｅｍｉａ／Ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ；Ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　’　

脊髓手术或腹主动脉瘤等因术中阻断动脉，可能引起不　

同程度的脊髓缺血，或表现为神经功能一过性障碍，严重者　

则出现急性或迟发性截瘫。寻找有效的防治方法是目前研　

究的热点难点Ｉｌ＿　。以前的研究证实了雌激素可减轻老年性　

痴呆、帕金森病和脑中风预后［６－９］，而有关其在脊髓缺血再　

灌注损伤的保护作用报道甚少。本实验目的旨在探讨雌激　素在兔脊髓缺血再灌注损伤中的保护作用及其可能机制，　

并对其最佳使用剂量作一初步研究，为其在临床应用提供　

理论依据。　

［基金项目］国家自然科学基金（８１２００３２４　ｏ　

通讯作者　１材料与方法　

１．１一般资料　

雄性新西兰大白兔４０只，体质量２．０～２．５ｋｇ，　

购自上海生旺实验动物养殖场（合格证号：　

２００７０００７０００２５），随机分为５组，每组８只。对照组　

（Ｃｏｎｔｒｏｌ组）行单纯肾下腹主动脉阻闭２０ｍｉｎ，再灌注　

４８ｈ；假手术组（Ｓｈａｍ组）行单纯手术操作不阻闭肾下　

腹主动脉；雌激素处理Ｅ１组（Ｅ１组）、雌激素处理Ｅ２组　

（Ｅ２组）、雌激素处理Ｅ３组（Ｅ３组），行。肾下腹主动脉阻　

闭２０ｍｉｎ，再灌注开始即刻经耳缘静脉分别给予雌激素　

２００，４００，８００　ｇ／ｋｇ。　

ＣＨＩＮＡ　ＭＥＤＩＣＩＮＥ　

ＡＮＤ　ＰＨＡＲＭＡＣＹ十一蕾药斜学３５　・基础医学・　

１．２方法　所有动物实验前晚禁食，不限制饮水。实验前予２０ｇ／Ｌ戊　

巴比妥钠（４０ｍｇ／ｋｇ）经兔耳缘静脉进行麻醉。术中使用　

复方乳酸钠４ｍＬ／（ｋｇ・ｈ）静脉维持。行股动脉穿刺，接　

压力传感器监测股动脉压，并从压力波形读取脉率（ＰＲ）。　

自肛门放入温度探头持续监测肛温，术中维持肛温于　３８．０～３９．０℃。选取缺血前、缺血１０ｍｉｎ以及再灌注１０ｍｉｎ　

抽取动脉血样测定ＰａＯ　，ＰａＣＯ　，ｐＨ等。　１．２．１　脊髓缺血模型制作参照文献及本实验室以往所采　

用的方法［１０　１２］，取腹正中切口，白剑突下两指剪开皮肤、腹　

膜，暴露左侧肾脏及腹主动脉，选取左肾动脉分支下０．８ｃｍ　

处阻闭腹主动脉，阻闭２０ｍｉｎ后恢复再灌注。动脉阻闭以股　动脉压力波形消失，远端动脉压力监测值ＭＡＰ≤１０ｍｍ　Ｈｇ　

为阻闭成功。开放时则以股动脉压力波形恢复为准。　

１．２．２后肢运动功能评分手术结束后将动物放回笼中进　行单独饲养观察，自由饮食。再灌注后４８ｈ，由一名不了解　

分组情况的观察者进行后肢运动功能评分，评分方法采用修　

正Ｔａｒｌｏｖ标准：４分，后肢功能完全恢复，能正常行走；３分，　

可站立但无法行走；２分，后肢可自由活动但无法站立；１分，　

有可觉察的关节自主活动；０分，没有可觉察的下肢活动。　

１．２．３病理学观察所有动物在再灌注４８ｈ神经功能评分　结束后，静脉给予２０ｇ／Ｌ戊巴比妥钠（４０ｍｇ／ｋｇ）深麻醉下，　

自胸骨处剪开胸腔，暴露心脏，自主动脉根部插入灌注针　

头并用生理盐水１０００ｍＬ灌注，继之以１０％福尔马林溶液　

５００ｍＬ滴注行组织固定。待灌注固定完毕后，白背侧暴露脊　

髓，并将腰膨大（Ｌ　～Ｌ　）部位脊髓组织取出，浸泡于１０％　福尔马林溶液中过夜。２４ｈ后经乙醇脱水变干后，行石蜡包　

埋。沿冠状切面将脊髓组织切成６　ｍ厚度切片，脱蜡膜后，　

常规苏木精一伊红（ＨＥ）染色。病理学改变由一不了解分　２０１　３年１２月第３卷第２３期　

组情况的观察者在２００倍显微镜下观察。损伤及坏死神经　

元表现为胞核固缩或溶解，胸浆呈嗜伊红染色，胞浆中尼氏体　消失，有的细胞固缩红染明显。正常神经元表现为多角形结　

构，胞核结构清晰，胞浆中尼氏体存在。病理损伤程度通过计　

数脊髓前角（沿中央导水管横线以前）正常神经元数来评估。　１．３统计学分析　

采用ＳＰＳＳ１７．０统计学软件。所有生理学参数用（　－４－ｓ）表　

示，组间比较采用ｔ检验。脊髓前角正常神经元计数采用完　

全随机设计的单因素方差分析（ＡＮＯＶＡ）进行统计，后肢运　

动功能评分采用非参数秩和Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ检验。Ｐ＜０．０５　

为差异有统计学意义。　

２结果　

２．１生理学指标　脊髓缺血过程中血流动力学各项指标，直肠温度，ＰａＯ　，　

ＰａＣＯ　，ｐＨ变化各组间比较，差异均无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。　

手术过程中，直肠温度保持在３８．０～３９．０　。肾下腹主动　

脉阻闭前后股动脉压力在各组间比较，差异无统计学意义　（Ｐ＞０．０５）表１。　

２．２后肢运动功能评分　术后动物无意外死亡。再灌注４８ｈ后，对照组动物后肢　

运动功能评分显著低于雌激素处理组（Ｐ＝０．００８），Ｅ３组显　

著高于Ｅ１组（Ｐ＝Ｏ．０２６），Ｅ１、Ｅ２组比较差异无统计学意义，　

Ｓｈａｍ组后肢功能无障碍为４分（图１）。　２．３病理学观察　

再灌注４８ｈ后，对照组脊髓前角光镜下可见正常神经元数　

量明显减少，神经细胞缺血变性坏死严重，胞浆深染，有的细胞　

核固缩，核仁消失，细胞周围有空泡形成；正常神经元数量显著　

少于雌激素处理组（Ｐ＝０．００６）（图２）。而Ｅ３组正常运动神经元　

较多，胞体呈多角形，核仁清晰，胞浆中尼氏体清晰（图３）。　

表１　缺血前后生理参数比较（　±Ｓ）　

注：各治疗组在缺血前后以及各组之间相比，未见统计学差异　

３６中■医药斜詈ＣＨＩＮＡ　ＭＥＤＩＣＩＮＥ　

ＡＮＤ　ＰＨＡＲＭＡＣＹ