小鼠脾脏来源的调节性表型γδT细胞的存在和体外诱导
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・４８８・ 中国免疫学杂志２００８年第２４卷 小鼠脾脏来源的调节性表型Ｙ６Ｔ细胞的存在和体外诱导① 杨静琳康宁②汤龙② 陈兴明③刘庆丰②崔莲仙②胡云章④何维② （北京协和医学院医学生物研究院中国医学科学院医学生物研究所疫苗室，昆明６５０１１８）
中国图书分类号Ｒ３９２ 文献标识码Ａ 文章编号１０００－４８４Ｘ（２００６）０６－０４８８－０５ ［摘要］ 目的：研究初始７６１ｒ细胞是否存在具有调节细胞表型的亚群，同时是否能够像ｃＤ４ ＣＤ２５一Ｔ细胞一样可以在 体外诱导产生具有调节表型的７６１ｒ细胞。方法：采用流式分选或磁珠分选的方法分离纯化脾淋巴细胞中 细胞，通过反转 录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）、实时定量ＰＣＲ（Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ）和免疫荧光染色分析初始的 细胞以及ＴｃＦ．Ｂ（５ ｎｇ／￣）诱导后的 细胞中Ｆｏｎ￣３及部分调节性Ｔ细胞表面分子和细胞因子的表达情况。结果：与ＣＩＮ ＣＤ２５ Ｔ细胞相比，初始的 细胞 Ｖｏｘｐ３表达量很低；活化的７８ｒｒ细胞经过ＴＧＦ．Ｂ诱导后Ｖｏｘｐ３表达量明显增加，同时与免疫调节相关的表面分子如ＧＩ＇ＩＩ１、ＣⅡ。Ａ一 ４和细胞因子ＴｃＦ．Ｂ、ＩＬ－ＩＯ的表达量也相应增加，ＩＦＮ－ｙ的表达有所降低。结论：初始的 细胞低表达Ｖｏｎ￣３，在体外可经 ＴＧＦ．Ｂ诱导产生具有调节性Ｔ细胞表型的亚群。 ［关键词］ 细胞；调节性Ｔ细胞；Ｆｏｘｐ３；免疫调节
Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｓｐｌｅｅｎ ｄｅｒｉｖｅｄ ｙＳＴ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ ＹＡＮＧ Ｊｉｎｇ－Ｌｉｎ，ＫＡＮＧ Ｎｉｎｇ，ＴＡＮＧ ｎｇ，ＣＨＥＮ ｎｇ－施ｎｇ，ＬＩＵ Ｑ ｒ． ｎｇ，ＣＵＩ Ｌｉａｎ－Ｘｉａｎ，ＨＵ Ｙｕｎ—Ｚｈａｎｇ，ＨＥ Ｗｅｉ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐｅｋｉｎｇ Ｕｎｉｏｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ ａｎｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｋｕｎｍｉｎｇ ６５０１１８，Ｃｈｉｎａ
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｗｈｅｔｈｅｒ ａ ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｎａｉｖｅ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｒｅｇｕｌａ呻ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｅｘｉｓｔｓ ｉｎ ｍｕｒｉｎｅ ｓｐｌｅｅｎｓ，ａｎｄ ｗｈｅｔｈｅｒ ｉｔ ｃａｎ ｂｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｓ ＣＩＭ ＣＩＹ２５一Ｔ ｃｅｌｌｓ ｌｉｋｅｗｉｓｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ： ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｂｙ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒａｎｇ ｏｒ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ ｆｒｏｍ ｍｏｕｓｅ ｓｐｌｅｅｎ．Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ），Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒ￣ｓｃｅｎｃｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ ｗｅＩ℃ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｖｏｘｐ３ ａｎｄ ｓｏｎｌｅ ｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ－ｒｅｌａｔｅｄ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｎｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｉｎｆｒｅｓｈｌｙ ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｎｄ ＴＧＶ－￣（５ ａｓ／ ｍ１）ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｃｏｍｐ￣－ｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈａｔ ｏｆ ＣＤ４ ＣＤ２５ Ｔ ｃｅｌｌｓ，ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｏｆ Ｆｏｘｐ３ ｉｎ ｎａｉｖｅ ｃｅｌｌｓ ｗａｓ ｍｕｃｈ ｌｏｗｅｒ． Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｆｏｌｏｗｉｎｇ ＴＧＶ－￣ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ，ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｏｆ Ｖｏｘｐ３ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ－ｒｅｌａｔｅｄ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｎｄ ｃ￣ｏｋｉｎｅｓ ｓｕｃｈ ａｓ Ｇ１ＴＲ，ＣＴＩＡ－４，ＴＧＶ－￣ａｎｄ ＩＬ－１０ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ，ｗｈｅｒｅａｓ １ＦＮ－７ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌｓ．Ｃｏｎｄｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅ ｆｒｅｓｈｌｙ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｒｅｓｓ ｌｏｗ ｌｅｖｅｌ ｏｆ Ｖｏｘｐ３．ＴＧＦ－￣ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｏｕｌｄ ｇｅｎｅｒａｔｅ ａ ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌ ｐｈｅ－ ｎｏｔｙｐｅ． ［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ］ ｃｅｌｌ；Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌ；Ｖｏｘｐ３；Ｉｒｍｎｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ
在上世纪７０年代就有学者提出存在一群具有 调节作用的Ｔ细胞，直到９０年代初ＣＤ４ ＣＤ２５ 的 发现，才使学术界公认了调节性Ｔ细胞的存在［－－。 ①本文为国家９７３免疫学项目（２００７ＣＢ５１２４０５）、北京协和医院基础与 临床合作项目（２００６４ｏ７） ②北京协和医学院基础学院，中国医学科学院基础医学研究所免疫 学系，医学分子生物学国家重点实验室，北京１００３０５ ③北京协和医院耳鼻喉科，北京１００３０５ ④通讯作者，Ｅ－ｍａｉｌ：ｈｕｙｕｎｚ＠２１ｃｎ．ｅｏｍ 作者简介：杨静琳（１９８２年一），女，在读硕士，主要从事祁调节性细 胞的研究，Ｅ－ｍａｉｌ：ｔｍｕｙ￣＠１６３．ｃｏｒｎ； 通讯作者及指导教师：何维（１９５５年一），男，博士生导师，教授，主 要从事７８１＂细胞的相关研究，Ｅ．ｍａｉｌ：ｈｅｗｅｉｉｍｕ ＠ｐｕｂｌｉｃ．ｂｔａ．ｎｅｔ．ｃａ。 调节性Ｔ细胞（Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌ，Ｔｒｅｇ）作为Ｔ细胞的 一个亚群其功能被认为是抑制自身效应性Ｔ细胞的 增殖和活性，由此抑制自身免疫病的发生【２】。Ｆｏｘｐ３ （Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｆｏｒｋｈｅａｄ ｂｏｘ ｐ３）被认为是目前为 止Ｔｒｅｇ细胞最特异的标志物，Ｆｏｘｐ３是ＣＩＭ Ｃｆｆ２５ Ｔｒｅｇ细胞的主要控制基因 ．４ｊ。 ＴＧＦ．Ｉ９是介导Ｔ细胞免疫调节和免疫耐受的关 键因子 ｊ。无论是在体内还是体外，ＴＧＦ．ｐ对于免 疫应答的调节作用都已得到肯定。已有文献报道 ＴＧＦ－￣能够在体外诱导ＣＩＭ ＣＤ２５一Ｔ细胞转变为 ＣＩＭ ＣＤ２５ Ｆｏｘｐ３ Ｔ细胞 ｊ。近年的研究发现， Ｔｒｅｇ细胞不仅仅局限于ＣＤ４ Ｔ细胞，ＣＤ８ 以及ｙＳＴ 细胞同样具有免疫调节作用的亚群［ 。本研究主要
维普资讯 http://www.cqvip.com 杨静琳等小鼠脾脏来源的调节性表型 细胞的存在和体外诱导第６期 探讨小鼠脾脏来源的 细胞是否具有调节细胞表 型（Ｆｏｘｐ３ ）以及在ＴＧＦ－ｔ３诱导下Ｆｏｘｐ３、相关细胞因 子和表面分子表达情况的变化。 １材料与方法 １．１材料 １．１．１实验动物６～８周雄性ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，购于 中国药品和生物制品检定所啮齿类实验动物中心， 饲养于中国医科院基础医学研究所实验动物中心。 １．１．２主要试剂和仪器纯化的抗小鼠ＴＣＲｙ￣单 克隆抗体和Ｆ１ＴＣ标记的仓鼠抗小鼠ＴＣＲｙ８单克隆 抗体均为ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ产品；ＡＰＣ标记的抗小鼠 Ｆｏｘｐ３单克隆抗体、Ｆ１ＴＣ标记的抗小鼠Ｃ１Ｍ单克隆 抗体及ＰＥ标记的抗小鼠ＣＤ２５抗体均为ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ 产品；抗Ｆ１ＴＣ磁珠为Ｍｉｈｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ公司产品；１６４０ 培养基干粉及胎牛血清为Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ产品；重 组ＴＧＦ－￣Ｉ为Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ产品；重组人ＩＬ－２为北京 瑞得合通药业有限公司产品；ＳＹＢＲ￣ＧＲＥＥＮ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ为Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ产品；流式分析仪 Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ为Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ公 司产品；流式分选仪Ｍｏｆｌｏ￣（Ｈｉｇｈ—ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ）ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ为Ｆｏｒｔ Ｃｏｌｌｉｎｓ公司产品；７５００ Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ为Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ产品。 １．２方法 １．２．１脾细胞的分离和培养断颈处死小鼠，无菌 条件下取其脾脏，研磨后制成单细胞悬液，用Ｔｒｉｓ— ＮＨ４Ｃｌ处理５分钟，２ ０００×ｇ×７分钟，１６４０洗涤两 遍，重悬于４ ｍｌ预热至３７℃的含１０％血清的１６４０ 培养基，加入处理后的尼龙毛柱中，３７℃孵育５０分 钟后，以预热的含１０％血清的１６４０培养基洗脱，洗 脱获得的细胞即为脾脏来源的Ｔ淋巴细胞。用 Ｆ１ＴＣ标记的ａｎｔｉ．ＴＣＲｙ８抗体进行免疫荧光染色， ＰＢＳ洗涤一次后，每１×１０７细胞加入１０ ｌ ａｎｔｉ—Ｆ１ＴＣ 磁珠，４℃孵育１５分钟，充分洗涤后进行流式分选或 磁珠分选。磁珠分选具体为：细胞加入磁分选柱进 行分选，即得到７ｂ＇Ｔ细胞。细胞以１．５×ｌＯ６ ｍｌ 的 浓度重悬于１０％血清的１６４０的完全培养基（含２００ Ｕ／ｍｌ的ＩＬ－２）中。 １．２．２ ７６３＇细胞的扩增培养用１ ｇ／ｍｌ的抗小鼠 １℃Ｒ 抗体包被９６孑Ｌ细胞培养板，每孑Ｌ加２００ 细 胞悬液，３７℃、５％ＣＯ２培养７～１０天。 １．２．３ ＴＧＦ－ｔ３刺激７６＂Ｉ＇细胞 以５ ｎｇ／ｍｌ的ＴＧＦ－ｔ３ 刺激已扩增至纯度＞９０％的 细胞，３天后收集 细胞，一部分做Ｆｏｘｐ３的免疫荧光染色，另一部分细 胞用于提取ＲＮＡ。 １．２．４反转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）反应每５０ 体系含有１０×缓冲液５ ，ｄＮＴＰ（２．５ ｍｍｏＬ／Ｌ）４ ｌ，ｃＤＮＡ模板２ ｌ，上、下游引物各１０ ｐｍｏ￣Ｌ，Ｔａｑ酶 （５ Ｕ／ １）１ ｔＡ。反应条件：９４℃２分钟预变性，９４℃１ 分钟，６０℃４５秒，７２℃１分钟，共３０或３５个循环； ７２℃延伸１０分钟。上述反应条件下的ＰＣＲ扩增产 物以 ａｃｔｉｎ为内参照，通过１．５％的琼脂糖凝胶电 泳进行鉴定。 １．２．５ Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ ＳＹＢＲ￣ＧＲＥＥＮ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ
Ｍｉｘ １０ ，ｃＤＮＡ模板２ ，引物１ ｌ（正向、反向引物 各０．５ ），灭菌ｄｄＨ２Ｏ ７ ｌ，总体积２０ ｌ。反应条 件：反应管置于７５００ Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ内：Ｓｔａｇｅ １：５０℃２分钟；Ｓｔａｇｅ ２：９５℃１０分钟；Ｓｔａｇｅ ３：９５℃１５ 秒，６０℃４５秒，共４５个循环数。熔解反应：选择 Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｃｕⅣｅ程序，设定反应板参数，进行熔解 反应生成熔解曲线。数据分析：数据使用Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒｓｉｏｎ１．２（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）进 行分析。所用引物见表１。
