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原果胶酶酵母基因工程的构建你知道果胶吗？那玩意儿是我们吃的水果里面的一个“小不点”，但它的作用可大了去了。
比如，苹果、橙子、葡萄这些水果，吃起来有时候口感有点儿“黏”，就是果胶在捣鬼。
它是一种天然的多糖，能帮助水果保持形状，还能让果酱、果冻变得有弹性。
你可能会问，果胶酶是啥？嗯，说白了，果胶酶就是帮助我们分解这些果胶的一个“小帮手”。
而且如果你把这个果胶酶放到酵母里，搞成基因工程，那效果就更了不得了。
嘿，这可不是开玩笑的，咱们今天就来聊聊如何构建这样一种“基因工程”。
说实话，基因工程这个词一出来，大多数人都会觉得高大上，跟自己没啥关系。
咱们可以把它想成一种“魔法”——只不过这个魔法是通过改造细胞里面的基因来实现的。
这就好像是你拿到了某个神奇的配方，能够让酵母在一定条件下“自己动手”产生果胶酶。
听起来是不是有点不可思议？但这一切都有它的道理。
咱得了解果胶酶是怎么工作的。
你知道果胶它可是水果里很重要的一部分，很多时候它给果实带来了“密密麻麻”的口感，或者让果实和果皮黏在一起。
所以果胶酶的任务就是把这些果胶分解开，让果实的组织更加松散，甚至能帮助果汁更容易流出。
比如做果汁的时候，加入果胶酶，能让你榨出来的汁水更加清澈、口感更好。
好了，明白果胶酶的重要性了吧？接下来就要看，怎么通过基因工程让酵母产生果胶酶。
酵母本身并没有这个功能，所以我们得给它“添点儿柴火”。
想象一下，你是一个“酵母雕塑家”，通过一根“神奇的针线”——就是基因技术，把果胶酶的基因从别的生物体里拿过来，然后放到酵母的基因组里。
这样，酵母就变成了一个“果胶酶工厂”。
是不是有点儿像给它加了个外挂，突然就能做一些它原本做不到的事儿？不过，这个过程可没那么简单。
你不能就随便把果胶酶的基因塞进酵母里面，给它一点“提示”就完了。
要确保它能好好发挥作用，还得考虑到酵母本身的特点。
你想想，酵母是一个微生物，它原本生活在一个特定的环境中，如果你给它加了“任务”，它能不能按时完成还得看你的安排。
酵母发酵过程中乙醇生成速率随温度变化规律引言：酵母发酵是一种常用的工业生产过程，它能够将有机物转化为乙醇和二氧化碳。
乙醇是一种重要的工业原料和可再生能源，因此了解酵母发酵过程中乙醇生成速率随温度变化的规律对于提高发酵效率和乙醇产量具有重要意义。
本文将探讨酵母发酵中乙醇生成速率与温度之间的关系。
1. 引发酵过程中的乙醇形成机理酵母发酵过程中，葡萄糖作为底物被酵母菌分解为乙醇和二氧化碳。
这个过程称为糖酵解。
其中，乙醇是主要的产物之一。
酵母菌将葡萄糖转化为乙醇的路径是通过糖酵解途径进行的。
在这个途径中，葡萄糖通过一系列酶的催化作用，转化为丙酮酸。
接着，丙酮酸再通过甲酸（NADH）还原酶的作用，还原为乙醇，同时伴随着NADH氧化为NAD+的过程。
这个过程是一个复杂的生化过程，而乙醇生成速率受到发酵条件中的多个因素的影响，包括温度、pH值、营养成分和氧气浓度等。
2. 温度对乙醇生成速率的影响温度是酵母发酵过程中一个重要的调控因素。
在不同的温度条件下，酵母菌的酶活性和细胞代谢速率都会发生变化，进而影响到乙醇生成速率。
一般来说，温度升高会加快酵母发酵速率，但过高的温度会导致酵母菌失活。
酵母菌具有较宽的温度适应范围，在15℃至35℃范围内都可以进行生长和发酵。
尽管酵母菌可以在广泛的温度范围内进行发酵，但是乙醇生成速率随温度的变化并非是线性的。
一般来说，乙醇生成速率随温度的上升而增加，但是当温度超过一定范围时，乙醇生成速率会逐渐下降。
实验结果表明，乙醇生成速率在30℃附近达到最大值。
当温度超过最适温度范围时，酵母菌的酶活性和细胞代谢能力会出现下降，从而限制了乙醇生成速率的提高。
此外，高温环境下酵母菌细胞膜的稳定性也会受到影响，进一步限制了乙醇生成速率的增加。
在低温下，酵母菌的酶活性和细胞代谢速率较慢，导致乙醇生成速率较低。
此外，在低温环境下，细胞膜的流动性减弱，对底物的吸附和转运能力也降低，限制了乙醇生成速率的提升。
酵母的生产工艺
酵母是一种微生物，广泛用于食品行业的发酵过程中，为食品提供香气、口感和营养。
酵母的生产工艺主要包括培养、分离纯化、扩增、收获和干燥等几个步骤。
首先，酵母的生产通常以培养为起点。
首先，选择优质的酵母菌株作为起始种，然后将其接种到含有碳源、氮源和其他必需营养物质的培养基中。
培养基的成分可以根据不同酵母菌株的需求进行调配。
接着，分离和纯化是为了得到纯种的酵母菌。
首先，通过无菌操作将培养基中的单个酵母菌分离出来，然后进行连续传代的方法，将菌群中的其他微生物干扰物逐渐去除，最终获得纯种的酵母菌。
然后，通过扩增培养菌株，使其数量快速增加。
扩增的方法主要有两种，一种是液体发酵，将纯化的菌株接种到大型发酵罐中，提供适宜的培养条件，如温度、氧气和营养物质，使菌株迅速繁殖；另一种是固体发酵，将培养基和菌株混合后，装入培养箱中进行培养。
收获是指将发酵结束后的菌体进行收集。
对于液体发酵，通常通过离心分离出胞外酵母菌，然后将菌体进行破碎和提取。
对于固体发酵，通常将培养容器打开，将菌体收集起来，然后进行后续处理。
最后，酵母菌的干燥是为了延长其保存期限。
通常将酵母菌在
低温、低湿的条件下进行干燥处理，如冷冻干燥或喷雾干燥等。
干燥后的酵母菌可以进行包装和储存，以备后续使用。
总体来说，酵母的生产工艺包括培养、分离纯化、扩增、收获和干燥等几个步骤。
通过科学的操作和控制，可以获得优质和高效的酵母菌株，为食品行业的发酵提供可靠的支持。
化工进展CHEMICAL INDUSTRY AND ENGINEERING PROGRESS2021年第40卷第3期微生物合成植物天然产物的细胞工厂设计与构建孙文涛，李春（清华大学化学工程系，北京100084）摘要：植物天然产物结构多样，具有丰富的生理活性与功能。
利用微生物细胞工厂生产来源稀缺、获取难度大的植物天然产物具有经济可行、环境友好等优势。
本文系统介绍了萜烯、黄酮以及生物碱的生物合成途径及其关键酶，阐述了差异转录组学、同功酶挖掘等途径解析与重构的方法。
指出关键酶改造、途径动态调控、代谢区室化与代谢网络再平衡是增大外源途径代谢通量、抑制副产物合成、降低产物毒性与菌株代谢负担、提高目标产物合成能力的有效策略。
提出了解析合成植物天然产物关键酶在微生物中的催化特异性机制、开发外源途径的高效组装方法等进一步提高微生物细胞工厂生产效率的建议。
关键词：植物天然产物；微生物细胞工厂；途经重构；合成生物学中图分类号：Q819文献标志码：A文章编号：1000-6613（2021）03-1202-13Design and construction of microbial cell factory for biosynthesis of plantnatural productsSUN Wentao ，LI Chun(Department of Chemical Engineering,Tsinghua University,Beijing 100084,China)Abstract:Plant natural products possess diverse structures,physiological activities and functions.The use of microbial cell factories to produce plant natural products with scarce sources and difficult to obtain has the advantages of economic viability and environmental friendliness.This paper systematically introduces the biosynthetic pathways and key enzymes of terpenes,flavonoids and alkaloids,and expounds the decipher and reconstruction methods of their biosynthesis pathways including transcriptomics and isozyme mining.It is pointed out that enzyme engineering,dynamic control,metabolic compartmentation and metabolic network rebalance are effective strategies to increase the metabolic flux of exogenous pathways,inhibit by-product synthesis,reduce product toxicity and strain metabolic burden,and improve the synthesis ability of target products.Suggestions are put forward to further improve the production efficiency of microbial cell factories,such as analyzing the catalytic specific mechanism of plant enzymes in microorganisms,and developing efficient assembly methods for exogenous pathways.Keywords:plant natural products;microbial cell factories;pathway reconstruction;synthetic biology 植物天然产物通常指来源于植物的一类功能性次级代谢产物，主要包括萜烯类、黄酮类以及生物碱等，这些化合物虽然不是植物生存的必须物质，但它们的存在赋予了植物抵抗病虫害以及除草剂等特约评述DOI ：10.16085/j.issn.1000-6613.2020-2101收稿日期：2020-10-20；修改稿日期：2020-12-13。
齐墩果酸酵母细胞工厂的合成途径与发酵工艺优化目的：通过遗传改造和发酵工艺优化等方法进一步提高齐墩果酸酿酒酵母细胞工厂的生产能力。
方法：利用多片段基因同源重组法，增加齐墩果酸酿酒酵母工程菌BY-OA中甘草β-香树脂合酶（GgbAS），蒺藜苜蓿齐墩果酸合成酶（MtOAS）和拟南芥烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸-细胞色素P450还原酶1（AtCPR1）等基因的拷贝数；并通过优化YPD发酵液中初糖浓度的方式提高齐墩果酸的产量。
结果：增加工程菌BY-OA中GgbAS，MtOAS和AtCPR1基因的拷贝数能显著提高工程菌中目标产物的产量，获得的工程菌BY-2OA在初始葡萄糖浓度为20 g·L-1的YPD培养基中发酵7 d后β-香树脂和齐墩果酸分别达到136.5 mg·L-1（提高54%）和92.5 mg·L-1（提高30%），当初糖浓度提高到40 g·L-1时，齐墩果酸产量能达到165.7 mg·L-1。
结论：新获得的工程菌BY-2OA生产齐墩果酸的能力显著提高，为发酵法生产齐墩果酸奠定了基础。
标签：三萜；齐墩果酸；酿酒酵母；合成生物学齐墩果酸（oleanolic acid）为齐墩果型药用三萜类化合物，有抗病毒、抗炎、抗变态反应、抗氧化应激及促进肝糖原合成和肝细胞再生作用等药理活性，齐墩果酸片等药品已在临床应用于肝脏保护[1-2]。
目前其主要生产方式是从齐墩果和女贞等药用植物中直接提取，此方法对野生资源存在过度依赖和破坏。
基于合成生物学的原理，设计和改造微生物菌株来发酵生产天然药用化合物的方法已被广泛认可，如在酵母工程菌中生产青蒿素（artemisinin）的前体青蒿酸（artemisinic acid）已达到25 g·L-1的产业化水平[3]。
齐墩果酸为萜类生物合成途径的产物，其基本合成单元异戊烯焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）由植物细胞中线粒体、细胞溶质和内质网中存在的甲羟戊酸代谢途径（MV A pathway），和在质体中存在的丙酮酸/磷酸甘油醛代谢途径（MEP pathway）分别合成[1，4-5]。
发酵工程复习1.什么是微生物工程？微生物工程也称之为微生物发酵工程。
微生物工程学是以微生物学、生物化学和生物工程学为基础，又与工程技术紧紧联系在一起而建立的一个完整的科学与工程技术体系。
它是研究利用微生物（包括“工程微生物”在内）及其代谢产物与工艺生产过程原理的科学。
2.了解微生物工程发展的4个阶段及每个阶段的特点？（1）微生物工程的孕育时期——天然发酵（或自然发酵）；（2）第一代微生物发酵技术——纯培养技术的建立，柯赫，发明固体培养基建立了纯培养；（3）第二代（近代）微生物发酵技术——深层培养技术，如抗生素工业生产带动了生化工程的建立；（4）第三代微生物发酵技术——微生物工程，主流发展方向为工程菌；（5）第四代微生物发酵技术——微生物工程。
3.微生物代谢产物的三种类型？（1）初级代谢产物：微生物通过代谢活动所产生的、自身生长和繁殖所必需的物质。
（2）次级代谢产物：微生物生长到一定阶段才产生的化学结构十分复杂、对该微生物无明显生理功能，或并非是微生物生长和繁殖所必需的物质。
（3）转化产物：以外源物质为底物，通过微生物细胞的酶或酶系对底物某一特定部位进行化学反应，使它转变成结构相类似但更具有经济价值的化合物。
4.工业菌种必须满足的条件是什么？（1）生产力：能在廉价的培养基上迅速生长，所需的代谢产物的产量高，其它代谢产物少（2）操作性：培养条件简单，发酵易控制，产品易分离（3）稳定性：抗噬菌体能力强，菌种纯粹，不易变异退化（4）安全性：是非病源菌，不产有害生物活性物质或毒素5.掌握实验室及工厂常用的微生物培养方法。
（1）固体培养实验室常见的固体培养方法；生产中常见的固体培养基：小麦麸皮（2）液体培养实验室常见的液体培养：试管液体培养，浅层液体培养，摇瓶培养，发酵罐培养；生产中常见的液体培养：浅盘培养，发酵罐深层培养，连续培养（恒化培养：通过控制培养基中营养物的浓度，使微生物在低于最高生长速率的条件下生长繁殖；恒浊培养：可控制微生物在最高生长速率与最高细胞密度的水平上生长繁殖，达到高效率培养的目的；多级连续培养；固定化细胞连续培养），补料分批培养，混合培养。
一种重组酵母菌株及其构建方法和应用与流程引言：重组酵母菌株是指通过基因重组技术将外源基因导入酵母菌中的一种菌株。
重组酵母菌株的构建方法可以分为直接转化法、原生质体法和自由质粒法等多种方式。
重组酵母菌株在生物医药、农业生物技术和食品工业等领域具有广泛的应用前景。
一、重组酵母菌株的构建方法1. 直接转化法：将外源基因和酵母菌细胞一起处理，使外源基因转化到酵母菌细胞内。
该方法适用于酵母菌对外源DNA接受性较高的情况，如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
直接转化法的优点是操作简单、效率高，但对于某些酵母菌株效果不佳。
2. 原生质体法：将外源基因和酵母菌细胞分别处理，然后通过融合原生质体的方式将外源基因导入到酵母菌细胞内。
该方法适用于酵母菌对外源DNA接受性较低的情况，如担子酵母(Pichia pastoris)。
原生质体法的优点是适用范围广，可以用于多种酵母菌株的基因转化。
3. 自由质粒法：将外源基因和质粒分别处理，然后通过质粒转化的方式将外源基因导入到酵母菌细胞内。
该方法适用于酵母菌株对外源DNA接受性较低的情况，如甘露酵母(Candida utilis)。
自由质粒法的优点是无需使用化学试剂，操作相对简单。
二、重组酵母菌株的应用与流程1. 生物医药领域：重组酵母菌株被广泛应用于生物医药领域，可用于生产重组蛋白、抗体和疫苗等。
流程包括选择合适的酵母菌株、构建重组酵母菌株、表达目的基因、纯化目的蛋白等步骤。
2. 农业生物技术领域：重组酵母菌株可用于农业生物技术领域的基因转化和基因编辑。
例如，通过导入抗虫基因，可以使酵母菌株具有抗虫性，从而减少农药使用。
流程包括选择适合的酵母菌株、导入目的基因、鉴定转基因酵母菌株的稳定性和表达效果等。
3. 食品工业领域：重组酵母菌株可用于食品工业领域的发酵生产。
例如，通过导入酵母菌株具有产酶能力的基因，可以使酵母菌株在发酵过程中产生特定的酶，如纤维素酶、蛋白酶等，从而提高发酵产品的品质和产量。
龙源期刊网 http://www.qikan.com.cn 高产橙花叔醇的酵母细胞工厂创建 作者：张丽丽马晓琳王冬郁彭黄璐琦张学礼戴住波 来源：《中国中药杂志》2017年第15期
[摘要]橙花叔醇为萜类精油成分，具有抗菌、抗肿瘤和抗氧化等多种生物学活性。为了实现在酿酒酵母中异源生产橙花叔醇，该研究首先将猕猴桃Actinidia chinensis来源的橙花叔醇合酶（NES）基因通过密码子优化、人工合成后转入底盘菌株FPP001中获得工程菌株NES001，其橙花叔醇产量达到271 mg·L-1。在进一步工作中，橙花叔醇合酶的N端通过连接肽GGGS 融合法尼烯合酶（FPS）后得到橙花叔醇产量显著提高的工程菌NES002，其产量是NES001的5980倍，达到16207 mg·L-1。最终，通过恢复NES002中色氨酸生物合成缺陷基因TRP1得到工程菌NES003，该菌在高密度发酵体系中橙花叔醇产量能达到1 71153 mg·L-1。该研究为微生物发酵法生产橙花叔醇等倍半萜化合物提供了基础。
[关键词]精油；橙花叔醇；合成生物学；酿酒酵母 Construction of cell factories for high production of nerolidol in Saccharomyces cerevisiae ZHANG Lili1，2，3， MA Xiaolin1，2，3， WANG Dong2，3， YU Peng1， HUANG Luqi4， ZHANG Xueli2，3*， DAI Zhubo2，3*
（1 College of Biotechnology， Tianjin University of Science & Technology， Tianjin 300457， China；
2.Tianjin Institute of Industrial Biotechnology， Chinese Academy of Sciences， Tianjin 300308， China；
3.Key Laboratory of Systems Microbial Biotechnology， Chinese Academy of Sciences， Tianjin 300308， China；
4 State Key Laboratory Breeding Base of Daodi Herbs， National Resource Center for Chinese Materia Medica，
China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China） [Abstract]Nerolidol is an important constituent of terpenoid essential oil and has excellent antitumor， antibacterial， and antioxidative properties For realizing heterogenous production of nerolidol， our research firstly integrated the codonoptimized Actinidia sinensis nerolidol synthase gene （NES） into the terpenoid chassis strain FPP001， and obtained NES001 that could produce 龙源期刊网 http://www.qikan.com.cn 271 mg·L-1 nerolidol Then， the Nterminal of the NES was fused with FPS by linker peptide GGGS With this strategy， nerolidol production improved by 5980fold， reaching 16207 mg·L-1 Finally， by introduction of auxotrophic marker TRP1 in NES002， the resulting strain NES003 could produce 1 71153 mg·L-1 by high cell density fermentation method This study provides the basis for the fermentative production of nerolidol and other sesquiterpenoids
[Key words]essential oils； nerolidol； synthetic biology； Saccharomyces cerevisiae 橙花叔醇（nerolidol）是具有芳香性的倍半萜精油成分[1]，主要存在于中药降香，陈皮等100多种香料植物中[2]。由于橙花叔醇特殊的香味，可用于配制玫瑰型、紫丁香型等多种花香型日化香精，被广泛应用于化妆品和洗涤领域；同时橙花叔醇具有抗疟疾[3]，抗肿瘤[4]，抗溃疡[5]，抗氧化[6]和抗菌[7]等多种生物活性，已被美国食品和药物管理局批准作为食品调味剂[8]。目前，橙花叔醇的传统获得方法是从植物精油中浓缩、浸取而得，由于该方法存在提取效率低、浪费植物资源、破坏生态环境等问题，不符合可持续发展的要求[9]。
近年来，利用合成生物学的原理，设计和改造微生物菌株来生产青蒿素，人参皂苷等中药有效成分已被认为是一种很有潜力的方法[1012]。酿酒酵母由于其遗传背景清晰、遗传改造技术和发酵方法成熟，已经被广泛应用到构建合成萜类化合物的底盘菌中。在酿酒酵母中，乙酰辅酶A在MVA途径7个酶的催化下，可生成所有萜类化合物合成的前体物质异戊烯焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）。在倍半萜化合物生物合成途径中，IPP和DMAPP可在法呢基焦磷酸合成酶（FPS）的作用下生成倍半萜类化合物的合成前体法呢烯基焦磷酸（FPP），FPP可在不同倍半萜合成酶的催化作用下生成橙花叔醇等各种倍半萜化合物，见图1。
实验室前期，已构建了1株过表达MVA途径7个基因的底盘菌株NK2SQ，其可显著增加酿酒酵母内萜类化合物的合成通量[11]。在本研究中，底盘菌株NK2SQ中参与乙醇合成乙酰辅酶A的乙醇脱氢酶（ADH2）、乙醛脱氢酶（ALD6）和乙酰辅酶A合酶（ACS1）等酶基因的表达调控，猕猴桃Actinidia chinensis来源的橙花叔醇合酶（NES）基因（GenBank： JN2422431）密码子优化，NES与FPS酶蛋白融合，以及高密度发酵等策略进一步用于提高细胞工厂合成橙花叔醇的能力。相关结果为微生物发酵法生产橙花叔醇等倍半萜化合物奠定了基础。
1材料 11工具酶与试剂PrimeSTAR HS DNA聚合酶购自于大连宝生物工程公司；酵母基因组DNA提取试剂盒购自北京康为世纪有限公司；质粒小量快速提取试剂盒购自美国Axygen公司；氨苄青霉素、DNA清洁试剂盒与DNA回收试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司；酵母选择培养基购自北京泛基诺科技有限公司；麦角固醇、鲨烯和橙花叔醇标准品购自美国SigmaAldrich公司；其他试剂均为分析纯。
12质粒，菌株及引物本次研究所用的质粒，菌株及引物信息见表1，2。 龙源期刊网 http://www.qikan.com.cn HMGCoA 3hydroxy3methylglutaryl coenzyme A； IPP isopentenyldiphosphate； DMAPP dimethylallyldiphosphate； FPPfarnesyl pyrophosphate； ERG10 acetoacetylCoA thiolase； ERG13 HMGCoA synthase； HMG1 HMGCoA reductase； ERG12 mevalonate kinase； ERG8 phosphomevalonate kinase； ERG19 mevalonate pyrophosphate decarboxylase； IDI1 isopentenyl diphosphate isomerase 1； ERG20 FPP synthase； ADH2alcohol dehydrogenase； ALD6 acetaldehyde dehydrogenase； ACS1 acetylCoA synthetase； NES nerolidol synthase。
13培养基LB培养基：1% 蛋白胨，05% 酵母粉，1% 氯化钠，100 mg·L-1氨苄青霉素；SMUra筛选培养基：08% 酵母选择培养基（三缺，UraTrpHis），2%葡萄糖，001% Trp，0005% His；SMUraHis筛选培养基：08% 酵母选择培养基（三缺，UraTrpHis），2% 葡萄糖，001%Trp；SMUraHisLeu筛选培养基：08% 酵母选择培养基（四缺，UraTrpHisLeu），2% 葡萄糖，001% Trp。SMUraHisLeuTrp筛选培养基：08% 酵母选择培养基（四缺，UraTrpHisLeu），2% 葡萄糖。上述液体培养基加2% 的Agar可配成相应的固体培养基。
高密度发酵培养基和补料培养基参照人参皂苷高密度发酵培养基配方配制[12]。 2方法 21FPP001菌株的构建构建FPP001工程菌株所采用的方法为多片段同源重组。首先，模板和引物的搭配方案见图2和表3，用PrimeSTAR HS高保真聚合酶扩增和割胶回收得到用于同源重组的各
个片段。用SMUra培养基活化NK2SQ后将各个片段转入醋酸锂方法制备的感受态中，并用SMUraHis固体培养基筛选转化子。转化子再分别用SacⅡPGK1/ADH2Asc1，PacpTDH3/ACS1Asc1，SacⅡpTEF1/ALD6Asc1等 3对引物进行PCR验证和测序验证后，得到工程菌FPP001。
22NES系列菌株的构建用醋酸锂的方法制备FPP001感受态细胞，将质粒pRS313NES转入FPP001感受态细胞，并用SMUraHisLeu固体培养基筛选转化子。转化子再用SacIIpTEF1/NESAsc1引物进行PCR验证和测序验证后，得到工程菌NES001。
