酵母感受态细胞的制备与转化

毕赤酵母感受态细胞制作1、GS115活化：100ml三角瓶中装入20ml YPD培养基，接种100ul菌保，过夜活化。

2、转接：500ml三角瓶中装入100ml YPD培养基，取1ml活化菌液接种到100ml YPD培养基中，培养至OD约为1.3-1.5。

3、收菌：将菌放置冰上15min，或者放于4°冰箱冷却。

一般100ml菌液可以制备4份感受态细胞。

将无菌水和过滤除菌的山梨醇（1M）提前置于4°冰箱冷却。

4、用100ml离心管收集菌体，4000rpm/min离心5min去除YPD培养基。

5、用20ml预冷的无菌水洗菌体，4000rpm/min离心5min，重复一次。

6、用20ml预冷的山梨醇洗菌体，4000rpm/min离心5min。

7、每个离心管中加入3ml预冷的山梨醇，重悬菌体。

7、将菌体分装至1.5ml灭菌离心管中，分装4管，4000rpm/min离心5min，弃上清。

8、每管加入80ul预冷山梨醇，重悬菌体，置于冰上待用或加入10%DMSO保存于-80冰箱。

毕赤酵母电击法转化1、将感受态细胞在冰上融化，电转杯和山梨醇在冰上预冷。

2、将80ul感受态细胞与5-10ug线性化质粒混合，转移至0.2cm电转杯中，置于冰上5min。

3、根据电转仪选择合适的程序，进行电击。

4、电击后立即加入500ul预冷的山梨醇，将电击杯中液体全部转移至无菌的1.5ml离心管中，30℃水浴2h。

5、将菌体低转速离心5min，吸出多余上清，留100ul涂板即可。

6、将菌液均匀涂布于His缺陷型培养基，30℃培养1-2天。

要准备灭菌的有：水，1M山梨醇，滤器，大离心管，1.5ml离心管，大小枪头，所有的离心都是低温离心。

酵母感受态细胞的制备以下是酵母感受态细胞的制备流程：一、基因突变1. 细胞外DNA转化：将基因要进行突变的DNA提取出来，放到细胞外，同时加入一定量的外源DNA去促进转基因的完成；2. 高效增幅：将一定的量外源DNA通过吞噬电穿孔的方法把外源DNA效率的转入细胞内，从而加快基因突变。

二、诱导表达和突变检测1. 选择表达载体：根据要转入突变要表达的基因，选择匹配的表达载体；2. 诱导表达：通过加入不同的诱导因子或者培养条件来促使载体的表达；3. 突变检测：通过筛选、测序和碱基错配检测等方法来检测是否发生了突变。

三、表达筛选1. 抗药基因筛选：对突变的酵母细胞，加入不同程度的抗药性因子，筛选出能够生存的突变细胞；2. 免疫细胞筛选：检验突变后的酵母细胞中能够产生免疫识别和反应细胞因子的存在，因为普遍认为有可能产生免疫细胞的能力。

四、选择迁移1. 抗药性筛选：对抗药性筛选出的突变酵母细胞进行对比，以确定是否能够开花；2. 免疫细胞筛选：通过检测免疫细胞因子的存在，筛选出产生免疫细胞的能力最强的突变细胞，并将其迁移至感受细胞中保存。

五、酵母感受态细胞的制备收尾1. 养殖酵母细胞：选择最佳突变细胞，把其分段离心至细胞密度稀释到一定水平；2. 生长管理：按照不同的培养环境加以调节，保证其正常的增殖和生长；3. 继代培养：当突变酵母细胞进行繁殖增殖后，可以进行继代繁殖，以不断增加细胞数量；4. 收尾清理：当满足实验要求时，对细胞进行收尾，进行清洗和分装，并保存细胞，以便后续使用。

总结：酵母感受态细胞的制备，主要分为基因突变、诱导表达和突变检测、表达筛选、选择迁移、酵母感受态细胞的制备收尾等步骤。

通过这些步骤，可以有效的制备可用于实验的突变的酵母感受态细胞，从而为对基因的研究和开发提供了非常有价值的材料。

实验九 e.coli感受态细胞的制备和转化[实验目的]1. 学习分子生物学的实验操作技术。

2. 掌握 e. coli感受态细胞的制备和转化的方法。

[实验原理]未经处理的受体菌细胞对受纳重组分子不敏感，难以实现转化。

当用理化方法诱导细胞，使细胞处于最适摄取和容忍外来dna的生理状态一感受态后，才有较高的转化频率，这种细胞称为感受态细胞。

将重组dna转化受体菌，技术关键是通过化学方法诱导细菌进人感受态，以利于外源dna 被导入。

这项技术始于mandel和hiag1970年的观察。

他们发现细菌经过冰冷氯化钙溶液处理及短暂热休克（hea shock）后，容易被λdna感染；随后cohen于1972年进一步证明质粒dna用同样方法也能进入细菌。

其原理是：细菌处于0℃氯化钙低渗溶液中，细胞膨胀成球形。

转化混合物中的dna形成抗dna酶的羟基鸟磷酸复合物粘附于细胞表面；经42℃短时间热休克处理，促进细胞吸收dna复合物。

在丰富的培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。

被转化的细菌中，重组的基因得到表达，在选择性培养基平板上可筛选出所需的转化因子。

除化学法转化细胞外，还有电击法。

电击法不需要预先诱导细菌进人感受态，只依靠短暂的电击，促使dna进人细胞。

因其操作简单方便、转化率高，愈来愈为人们接受。

[实验用品]一、试剂1. lb（luria—bertani）培养基配制每升培养基，应在950ml去离子水中加入：细菌培养用胰化蛋白胨 10g细菌培养用酵母提取物 5g氯化钠 10g摇动容器直至溶质完全溶解，用5 mnaoh（约0.2ml）调至ph7.0，加人去离子水至总体积为1 000ml，高压灭菌20分钟。

2. lb（20％葡萄糖）100ml lb中加人20g葡萄糖3.1m cacl2cacl2·6h2o 54g去离子水 200mi用0.22µm过滤器过滤除菌，分装成1ml，贮存于-20℃。

毕氏酵母（Pichia pastoris）感受态细胞制备及转化1、毕氏酵母氯化锂转化法（1）试剂1M LiCl（用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌；必要时用消毒去离子水稀释）50% PEG3350（Sigma P3640 用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌，用较紧的盖子的瓶子分装）2mg/ml salmon sperm DNA / TE（10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA）-20℃保存注：醋酸锂对毕氏酵母无效，仅氯化锂有效；PEG3350可屏蔽高浓度LiCl的毒害作用；（2）感受态毕氏酵母的制备接种Pachia pastoris到50ml YPD培养基中，30℃摇菌过夜（约24～28h）培养到OD 值为0.8～1.0（约108 Cells/ml）；收获细胞，用25ml无菌水洗涤一次，室温下1500g离心10min；重悬细胞于1ml 100mM LiCl溶液中，将悬液转入1.5ml离心管；离心机最大速度离心15秒沉淀菌体，重悬菌体于400ul 100mM LiCl溶液中；按50ul/管分装，立即进行转化；注：不要将感受态酵母菌冰浴；（3）毕氏酵母的转化煮沸1ml鲑鱼精DNA 5min，迅速冰浴以制备单链担体DNA；将感受态酵母菌离心，以Tips去除残余的LiCl溶液；对于每一个转化，按以下顺序加入：50% PEG3350 240ul1M LiCl 36ul2mg/ml 单链Salmon sperm DNA 25ul5～10ug/50ul H2O 质粒DNA 50ul剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀（约1min）；30℃水浴孵育30min；42℃水浴热休克20～25min;6000～8000rpm离心收集酵母菌体；重悬酵母于1ml YPD培养基，30℃摇床孵育；1～4h后，取25～100ul菌液铺选择性培养基平板，于30℃培养2～3天鉴定；2、毕氏酵母PEG1000转化法（1）试剂缓冲液A：1.0M Sorbitol，10mM Bicine，pH8.35（sigma）,3%（v/v）ethylene glycol 缓冲液B：40%（w/v）PEG1000（sigma），0.2M Bicine，pH8.35缓冲液C：0.15M NaCl，10mM Bicine，pH8.35未污染的新鲜、试剂级DMSO，-70℃保存注：缓冲液A、B、C均用滤膜过滤，-20℃保存;将DNA直接加在冻结的酵母细胞上是本实验的关键之处（即使在冰上解冻的待转化细胞，其摄取外源DNA的能力也在解冻过程中迅速下降；如进行多样品的转化，建议按6样品/组进行）;（2）待转化毕氏酵母的制备接种环接种Pachia pastoris于YPD平板，30℃培养2d;挑取单克隆酵母菌株于10mlYPD培养基中，30℃振荡培养过夜；取步骤2中小量菌液接种到100mlYPD培养基中振荡培养，待其OD值从0.1升到0.5～0.8；室温下3000g离心收集酵母菌体，50ml缓冲液A洗涤一次；重悬菌体于4ml缓冲液A中，按0.2ml/管分装于1.5ml的离心管中，每管加入11ulDMSO，混合后迅速于液氮中冷冻，-70℃保存（3）毕氏酵母的转化将约50ug线性化质粒DNA溶于20ul TE或水中，直接加于冻结的酵母细胞中；加入担体DNA（40ug变性超声线性化鲑鱼精DNA）以获得最大转化率；37℃水浴孵育5min，中间混合样品1～2次；取出离心管，加入1.5ml缓冲液B，彻底混匀；30℃水浴孵育1h；室温下2000g离心10min，去除上清液，菌体沉淀重悬于1.5ml缓冲液C中；离心样品，去除上清液，轻微操作将样品重悬于0.2ml缓冲液C中；将所有转化液铺于选择性平板，于30℃孵育3～4天后，鉴定；3、毕氏酵母电转化法（1）E.coli TOP10F’感受态细胞的制备取10ul TOP10F’菌液，接种于200ml LB液体培养基中活化培养，37℃，200 rpm，16～18小时。

感受态细胞的制备方法（BL21）1．菌种纯化。

①在LB平板上，用接种环挑取大肠杆菌BL21，在平板上分级划线，以能够出现单菌落为宜。

②将上述划线的平板倒置于恒温培养箱中37℃过夜培养。

2．菌体培养。

①取20 ml LB培养基至100 mL三角烧瓶中，塞上棉塞后高温高压灭菌，然后冷却至室温。

②在划线平板培养基上挑取单菌落，接种到①中。

③ 37℃振荡（约120 rpm）培养。

④测定OD值，当OD值达到0.35～0.5时（培养约5小时）放置冰上停止培养（如果OD600值超出此范围将不能保证感受态细胞的转化效率）。

3．感受态细胞的制备①取上述冰上菌液1 mL于1.5 mL ep管中（根据需要量确定Microtube数量）。

② 1,500×g（微型离心机约4,000 rpm）4℃离心5分钟，弃上清（注意尽量除尽上清）。

③在每个ep管中加入100 μL冰预冷的Solution A，轻轻弹动ep使沉淀悬浮，禁止剧烈振荡。

④ 1,500×g 4℃离心5分钟，弃上清（注意尽量除尽上清）。

⑤在每个ep管中加入100 μL冰预冷的Solution B，轻轻弹动ep管使沉淀悬浮，勿剧烈振荡。

⑥感受态细胞制作完成。

本感受态细胞可以直接用于DNA的转化实验，也可以于-80℃中保存，以备以后使用。

在-80℃保存时，可以有效保存一年以上，但不能反复冻融，一旦融解后，不能再进行-80℃保存。

感受态细胞的DNA转化1．将-80℃保存的感受态细胞置于冰上融化10分钟。

2．向100 μl的感受态细胞中加入0.1 ng～10 ng（3 μl～10 μl，一般连接产物用10 μL，质粒用0.5 μL）的转化用DNA，轻轻混匀后冰中放置30分钟。

3．42℃水浴中放置45秒钟后，立即于冰中放置1～2分钟。

4．加入900 μL培养基。

5．37℃ 140-160 rpm振荡培养45 min。

6. 离心6000rpm，3min，弃上清，留约100 μL，混匀后涂平板。

酵母感受态YIp的制备是一个复杂的过程，涉及到细胞培养、细胞分离、基因转化等多个步骤。

下面将详细介绍酵母感受态YIp的制备过程、注意事项以及可能遇到的问题及其解决方法。

一、准备工作1. 器材和试剂：培养箱、离心机、灭菌锅、移液器、细菌培养皿、显微镜、PCR仪、氯化钙溶液、甘油、感受态细胞质提取液、酵母基因组DNA提取液等。

二、制备步骤1. 酵母细胞培养：选择酵母菌株，将菌株接种到适宜的培养基中，培养酵母细胞。

当酵母细胞生长到适当的密度时，停止培养，用移液器将酵母细胞收集到离心管中，进行离心操作。

2. 细胞分离：将离心后的酵母细胞用氯化钙溶液悬浮，并通过梯度离心法或其他分离方法，将细胞分离得到感受态细胞。

3. 基因转化：将目的基因或质粒DNA与酵母感受态细胞混合，在一定的温度下进行转化。

转化过程中，DNA分子进入酵母细胞并被复制，最终形成基因组整合。

4. 筛选鉴定：通过PCR或酶切等方法对转化细胞进行筛选鉴定，确定是否成功转化。

三、注意事项1. 培养基和环境的控制：要保证培养基的质量和适宜的温度、pH值等环境条件，以保证酵母细胞的正常生长和增殖。

2. 细胞的收集和离心：要确保收集到的酵母细胞数量和质量，以保证感受态细胞的制备效果。

3. 感受态细胞的制备：要保证细胞的活性，避免长时间离心或暴露在空气中，以保持细胞的感受态状态。

4. 转化过程的控制：要确保DNA进入酵母细胞并成功整合，需要控制转化过程中的温度、时间等因素。

5. 筛选鉴定的准确性：要确保筛选鉴定的准确性，需要建立有效的筛选方法和标准，并对筛选结果进行反复验证。

四、可能遇到的问题及其解决方法1. 酵母细胞生长不良：检查培养基的质量和配方，调整培养条件，如温度、pH值、渗透压等。

2. 感受态细胞活性不足：制备过程中要保证细胞的活性，可以尝试增加细胞的离心时间和温度等。

3. 转化效率低：可以尝试增加DNA的浓度、延长转化时间、优化转化条件等方法来提高转化效率。

毕氏酵母（Pichia pastoris）感受态细胞制备及转化1、毕氏酵母氯化锂转化法（1）试剂1M LiCl（用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌；必要时用消毒去离子水稀释）50% PEG3350（Sigma P3640 用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌，用较紧的盖子的瓶子分装）2mg/ml salmon sperm DNA / TE（10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA）-20℃保存注：醋酸锂对毕氏酵母无效，仅氯化锂有效；PEG3350可屏蔽高浓度LiCl的毒害作用；（2）感受态毕氏酵母的制备接种Pachia pastoris到50ml YPD培养基中，30℃摇菌过夜（约24～28h）培养到OD 值为0.8～1.0（约108 Cells/ml）；收获细胞，用25ml无菌水洗涤一次，室温下1500g离心10min；重悬细胞于1ml 100mM LiCl溶液中，将悬液转入1.5ml离心管；离心机最大速度离心15秒沉淀菌体，重悬菌体于400ul 100mM LiCl溶液中；按50ul/管分装，立即进行转化；注：不要将感受态酵母菌冰浴；（3）毕氏酵母的转化煮沸1ml鲑鱼精DNA 5min，迅速冰浴以制备单链担体DNA；将感受态酵母菌离心，以Tips去除残余的LiCl溶液；对于每一个转化，按以下顺序加入：50% PEG3350 240ul1M LiCl 36ul2mg/ml 单链Salmon sperm DNA 25ul5～10ug/50ul H2O 质粒DNA 50ul剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀（约1min）；30℃水浴孵育30min；42℃水浴热休克20～25min;6000～8000rpm离心收集酵母菌体；重悬酵母于1ml YPD培养基，30℃摇床孵育；1～4h后，取25～100ul菌液铺选择性培养基平板，于30℃培养2～3天鉴定；2、毕氏酵母PEG1000转化法（1）试剂缓冲液A：1.0M Sorbitol，10mM Bicine，pH8.35（sigma）,3%（v/v）ethylene glycol 缓冲液B：40%（w/v）PEG1000（sigma），0.2M Bicine，pH8.35缓冲液C：0.15M NaCl，10mM Bicine，pH8.35未污染的新鲜、试剂级DMSO，-70℃保存注：缓冲液A、B、C均用滤膜过滤，-20℃保存;将DNA直接加在冻结的酵母细胞上是本实验的关键之处（即使在冰上解冻的待转化细胞，其摄取外源DNA的能力也在解冻过程中迅速下降；如进行多样品的转化，建议按6样品/组进行）;（2）待转化毕氏酵母的制备接种环接种Pachia pastoris于YPD平板，30℃培养2d;挑取单克隆酵母菌株于10mlYPD培养基中，30℃振荡培养过夜；取步骤2中小量菌液接种到100mlYPD培养基中振荡培养，待其OD值从0.1升到0.5～0.8；室温下3000g离心收集酵母菌体，50ml缓冲液A洗涤一次；重悬菌体于4ml缓冲液A中，按0.2ml/管分装于1.5ml的离心管中，每管加入11ulDMSO，混合后迅速于液氮中冷冻，-70℃保存（3）毕氏酵母的转化将约50ug线性化质粒DNA溶于20ul TE或水中，直接加于冻结的酵母细胞中；加入担体DNA（40ug变性超声线性化鲑鱼精DNA）以获得最大转化率；37℃水浴孵育5min，中间混合样品1～2次；取出离心管，加入1.5ml缓冲液B，彻底混匀；30℃水浴孵育1h；室温下2000g离心10min，去除上清液，菌体沉淀重悬于1.5ml缓冲液C中；离心样品，去除上清液，轻微操作将样品重悬于0.2ml缓冲液C中；将所有转化液铺于选择性平板，于30℃孵育3～4天后，鉴定；3、毕氏酵母电转化法（1）E.coli TOP10F’感受态细胞的制备取10ul TOP10F’菌液，接种于200ml LB液体培养基中活化培养，37℃，200 rpm，16～18小时。

酵母感受态制备是一种通过培养酵母菌并在特定条件下进行处理，以获得酵母菌感受态的方法。

感受态酵母菌具有更高的DNA吸收能力，可以用于遗传转化或基因编辑等实验操作。

以下是一种常见的酵母感受态制备方法：
准备培养基：制备合适的培养基，例如YPDA培养基（酵母蛋白胨培养基加入葡萄糖和酵母提取物）。

培养酵母：在含有培养基的培养皿中培养酵母菌，通常在30°C温度下培养过夜，直到达到合适的生长阶段（一般为对数生长期）。

洗涤酵母：用无菌蒸馏水或缓冲液洗涤培养皿中的酵母菌，以去除培养基中的营养物质和代谢产物。

悬浮酵母：将洗涤后的酵母用合适的缓冲液悬浮均匀。

处理酵母：向悬浮酵母中加入聚乙二醇和DNA（转化质粒或目的基因），并进行短暂的热冲击（热激）。

恢复酵母：将处理后的酵母菌悬液进行恢复培养，可以在含有完整营养物质的培养基上进行培养，以让酵母菌恢复生长。

通过上述步骤，酵母菌就可以在感受态下吸收外源DNA，并进行转化。

这种方法常用于酵母菌基因组编辑、基因敲除、基因表达和功能研究等实验中。

不同实验目的和酵母菌菌株可能需要略微调整上述步骤中的条件和参数。

Y187 酵母感受态制作及转化1）挑新鲜单菌落Y187 于 8 ml YPDA 培养液， 30℃，250 rpm 培养 16-18h；2）至 OD600＞ 1.5， 1： 10 转接，此时OD600≈ 0.3；3）30℃， 250 rpm，4-7 h，每 2 h 检测一次，直到OD600=0.4-0.6；4）转入 2 个 50 ml 离心管， 5100 rpm,5 min,弃上清；5）加入 1/2 V ddH2O, 洗涤细胞， 5100 rpm,5min,弃上清；6）每管中分别加 1 ml 1 ×TE/LiAc ，冰上混匀， 10000 rpm，15 s，去上清；7）每管中分别加 0.5 ml 1 TE/LiAc×，冰上混匀， 10000 rpm，15 s，去上清；8）每管中分别加0.5 ml 1 TE/LiAc×，冰上混匀， 10000 rpm，15 s，去上清；9）每管中分别加0.4 ml 1 TE/LiAc×，每管 100 ul 分装；10）分别加入 100 ng 左右 DNA（ plasmid）和 0.1 mg 鲑鱼 DNA（10 mg/ml,10 ul） ,移液器抽吸混匀溶液；11）分别加入600 ul LiAc/PEG ，高速混匀（ 10 s-1 min 内）；12）30℃摇床恢复30 min；13）超净台（无菌条件下）加入70 ul DMSO, 轻轻颠倒混匀；14）42℃热激 15 min；15）冰上放置1-2 min；16）14 000 rpm,15 s,去上清；17）300 ul TE 重悬细胞；18）100 ul/1 ul 分别涂布于YPDA 平板；100 ul/1 ul 分别涂布于SD/-Trp 单缺陷平板；100 ul/1 ul 分别涂布于SD/ -Trp/ -His 双缺陷平板上， 30℃倒置培养48-72 h可见转化菌落。

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1、毕氏酵母氯化锂转化法（1）试剂1M LiCl（用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌；必要时用消毒去离子水稀释）50% PEG3350（Sigma P3640 用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌，用较紧的盖子的瓶子分装）2mg/ml salmon sperm DNA / TE（10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA）-20℃保存注：醋酸锂对毕氏酵母无效，仅氯化锂有效；PEG3350可屏蔽高浓度LiCl的毒害作用；（2）感受态毕氏酵母的制备接种Pachia pastoris到50ml YPD培养基中，30℃摇菌过夜（约24～28h）培养到OD值为0.8～1.0（约108 Cells/ml）；收获细胞，用25ml无菌水洗涤一次，室温下1500g离心10min；重悬细胞于1ml 100mM LiCl溶液中，将悬液转入1.5ml离心管；离心机最大速度离心15秒沉淀菌体，重悬菌体于400ul 100mM LiCl溶液中；按50ul/管分装，立即进行转化；注：不要将感受态酵母菌冰浴；（3）毕氏酵母的转化煮沸1ml鲑鱼精DNA 5min，迅速冰浴以制备单链担体DNA；将感受态酵母菌离心，以Tips去除残余的LiCl溶液；对于每一个转化，按以下顺序加入：50% PEG3350 240ul1M LiCl 36ul2mg/ml 单链Salmon sperm DNA 25ul5～10ug/50ul H2O 质粒DNA 50ul剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀（约1min）；30℃水浴孵育30min；42℃水浴热休克20～25min;6000～8000rpm离心收集酵母菌体；重悬酵母于1ml YPD培养基，30℃摇床孵育；1～4h后，取25～100ul菌液铺选择性培养基平板，于30℃培养2～3天鉴定；2、毕氏酵母PEG1000转化法（1）试剂缓冲液A：1.0M Sorbitol，10mM Bicine，pH8.35（sigma）,3%（v/v）ethylene gl ycol缓冲液B：40%（w/v）PEG1000（sigma），0.2M Bicine，pH8.35缓冲液C：0.15M NaCl，10mM Bicine，pH8.35未污染的新鲜、试剂级DMSO，-70℃保存注：缓冲液A、B、C均用滤膜过滤，-20℃保存;将DNA直接加在冻结的酵母细胞上是本实验的关键之处（即使在冰上解冻的待转化细胞，其摄取外源DNA的能力也在解冻过程中迅速下降；如进行多样品的转化，建议按6样品/组进行）;（2）待转化毕氏酵母的制备接种环接种Pachia pastoris于YPD平板，30℃培养2d;挑取单克隆酵母菌株于10mlYPD培养基中，30℃振荡培养过夜；取步骤2中小量菌液接种到100mlYPD培养基中振荡培养，待其OD值从0.1升到0. 5～0.8；室温下3000g离心收集酵母菌体，50ml缓冲液A洗涤一次；重悬菌体于4ml缓冲液A中，按0.2ml/管分装于1.5ml的离心管中，每管加入11ulD MSO，混合后迅速于液氮中冷冻，-70℃保存（3）毕氏酵母的转化将约50ug线性化质粒DNA溶于20ul TE或水中，直接加于冻结的酵母细胞中；加入担体DNA（40ug变性超声线性化鲑鱼精DNA）以获得最大转化率；37℃水浴孵育5min，中间混合样品1～2次；取出离心管，加入1.5ml缓冲液B，彻底混匀；30℃水浴孵育1h；室温下2000g离心10min，去除上清液，菌体沉淀重悬于1.5ml缓冲液C中；离心样品，去除上清液，轻微操作将样品重悬于0.2ml缓冲液C中；将所有转化液铺于选择性平板，于30℃孵育3～4天后，鉴定；3、毕氏酵母电转化法（1）E.coli TOP10F’感受态细胞的制备取10ul TOP10F’菌液，接种于200ml LB液体培养基中活化培养，37℃，200 rpm，16～18小时。

Y187 酵母感受态制作及转化1）挑新鲜单菌落Y187 于8 ml YPDA 培养液，30℃，250 rpm 培养16-18h；2）至OD600＞1.5，1：10 转接，此时OD600≈0.3；3）30℃，250 rpm，4-7 h，每2 h 检测一次，直到OD600=0.4-0.6；4）转入2 个50 ml 离心管，5100 rpm,5 min,弃上清；5）加入1/2 V ddH2O,洗涤细胞，5100 rpm,5min,弃上清；6）每管中分别加1 ml 1×TE/LiAc，冰上混匀，10000 rpm，15 s，去上清；7）每管中分别加0.5 ml 1×TE/LiAc，冰上混匀，10000 rpm，15 s，去上清；8）每管中分别加0.5 ml 1×TE/LiAc，冰上混匀，10000 rpm，15 s，去上清；9）每管中分别加0.4 ml 1×TE/LiAc，每管100 ul 分装；10）分别加入100 ng 左右DNA（plasmid）和0.1 mg 鲑鱼DNA（10 mg/ml,10 ul）,移液器抽吸混匀溶液；11）分别加入600 ul LiAc/PEG，高速混匀（10 s-1 min 内）；12）30℃摇床恢复30 min；13）超净台（无菌条件下）加入70 ul DMSO,轻轻颠倒混匀；14）42℃热激15 min；15）冰上放置1-2 min；16）14 000 rpm,15 s,去上清；17）300 ul TE 重悬细胞；18）100 ul/1 ul 分别涂布于YPDA 平板；100 ul/1 ul 分别涂布于SD/-Trp 单缺陷平板；100 ul/1 ul 分别涂布于SD/ -Trp/ -His 双缺陷平板上，30℃倒置培养48-72 h 可见转化菌落。