农杆菌感受态细胞的制备原理和实验步骤(精)

农杆菌感受态细胞的制备在科学的世界里，农杆菌这家伙可是个大明星，尤其是在植物基因工程中，简直就像是超级英雄一样的存在。

说到农杆菌，它是个很有趣的小家伙，特别是在我们想把新基因转移到植物里的时候，它的表现真是让人惊叹。

今天就来聊聊怎么准备感受态细胞，听起来有点高大上，其实就是让植物细胞准备好接受外来的基因，像小朋友期待新玩具一样，兴奋得不得了。

要准备的就是农杆菌的培养。

想象一下，咱们要给这些小家伙开个派对，当然要先让它们有个好环境。

选个合适的培养基，像是给它们铺一张舒适的床。

然后，温度、pH值、氧气这些条件也得一丝不苟，不能马虎。

温度太高，农杆菌可受不了，像人一样，热得直冒汗；温度太低，它们又会懒洋洋的，没精神。

要是培养基里的营养不够，嘿，那简直就是饿肚子的小朋友，没啥干劲。

就得让这些小家伙进入生长期，哈哈，听起来像在养宠物。

等它们长到合适的密度，咱们就准备好收割成果啦。

这时候，得小心翼翼地把它们从培养基里取出来，别把它们给弄伤了，像捧着刚出生的小宝宝一样。

取出的细胞要经过洗涤，洗去多余的培养基，确保它们干净得像新洗的衣服。

用生理盐水轻轻地重悬这些细胞，调成合适的浓度，让它们准备好迎接“客人”。

这里有个小窍门，嘿嘿，增加细胞的感受性。

可以用一些特殊的化合物，比如PEG，这玩意儿就像催化剂，能帮助细胞更好地接受外来的DNA。

想象一下，像是给小朋友加了点魔法，立马变得更加活泼，更有好奇心。

然后，得把想要转移的DNA和这些感受态细胞混合。

这个过程就像搭积木，得小心翼翼，别让它们散架。

把这个混合物在特定的条件下静置一段时间，让细胞慢慢适应，就像在等待一场盛大的聚会。

期间，要保持适宜的温度和环境，让它们尽情享受这个过程。

就要进行转化了。

这一步就像是给这些细胞送去了新玩具，兴奋得不得了。

把细胞和DNA一起放到农杆菌中，轻轻搅拌，别太猛，怕把小家伙们给搅晕了。

静置一段时间后，它们就会开始接受这些新基因，像在参加一场欢迎会一样。

感受态细胞的制备的实验步骤CaCl2感受态细胞的制备的实验步骤1．前夜接种受体菌（DH5α或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜（约16小时）；2．取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时（250-300rpm）；3．将0.1M CaCl2溶液置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上操作4．吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；5．4℃下3000g冷冻离心5分钟；6．弃去上清，加入100μl预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟；7．4℃下3000g冷冻离心5分钟；8．弃去上清，加入100μl预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；9．细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（15% - 20%甘油）后超低温冷冻贮存备用（－70℃）。

·电转化法制备大肠杆菌感受态细胞的实验步骤1．前夜接种受体菌（DH5α或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜；2．取2ml过夜培养物转接于200ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养至OD600=0.6（约2.5-3小时）；3．将菌液迅速置于冰上。

以下步骤务必在超净工作台和冰上操作4．吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；5．4℃下3000g冷冻离心5分钟；6．弃去上清，加入1500μl冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；7．4℃下3000g冷冻离心5分钟8．弃去上清，加入750μl冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；9．4℃下3000g冷冻离心5分钟10．加入20μl冰冷10%的甘油，用移液器轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；11．立即使用或迅速置于-70℃超低温保存。

感受态细胞的制备步骤和原理实验目的为了获得大量的质粒作为克隆载体，我们需要将购买来的质粒通过转化的方法导入细菌的细胞内。

制备出感受态的细胞，我们就可以方便的将需克隆的质粒导入其中，使其繁殖，就能获得大量质粒。

本次实验的目的就是增加质粒的数量。

同时，我们能掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的基本原理和实验技术方法。

实验原理及过程实验步骤1挑取一个JM109单菌落于3ml LB（无抗生素）培养基中，37℃，180rpm 培养过夜。

[ 让菌复苏，进入对数期的早中期。

此时更容易制得感受态细胞。

]2取0.4mL过夜培养物加入到40mL LB（无抗生素）培养基中，37℃250rpm大约2.5 小时。

[ 减少达到所需亮的均所需繁殖的世代数，以减少菌的变异。

]3 取培养物置于40mL的灭菌离心管中，冰浴10min，4000rpm 4℃离心10min，弃上清。

（将所有上清倒光，可以将离心管倒过来）[ 使细菌的生长停止，代谢减慢。

因为这时已经没有培养基了，如果细菌仍有很高的代谢效率，则有大量细菌死亡。

]4 菌体重悬于10mL 100mmol/L 冰冷CaCl2 中，轻吹，4℃ 30min ，4000rpm 离心5min 弃上清。

[ 细菌处于0 度，CaCl2 低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，外源DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸盐混合物黏附于细胞表面（羟基来源于细胞壁上的糖，磷酸来源于DNA），经短时间420C 热激处理，促进细胞吸收DNA复合物。

（一定要轻吹，这时细胞壁打开，十分脆弱）]5 菌体重悬于1mL 100mmol/L 冰冷的CaCl2 中，轻吹，用于转化。

[ 除去所有的LB 以及细胞破损后释放出来的细胞内含物。

防止细胞分裂，以致大量细胞死亡。

（一定要轻吹，这时细胞壁打开，十分脆弱）]6 取感受态细胞100uL，加入2uLpET-21a 质粒，冰浴30 min 受体菌：感受态细胞100uL ，加入 2 uL 无菌双蒸水阴性对照：0.1mol/LCaCl2 溶液100uL，加入 2 uL 阴性对照[ 第一个阴性对照是为了验证LB中的抗生素有活性；第二个阴性对照是为了验证CaCl2 溶液和pET-21a 质粒未被污染。

农杆菌的培养与感受态制备农杆菌感受态的制备与转化实验室根癌农杆菌感受态的制备：1.取保存于-70°LBA4404菌株在YEB（含125µg/ml链霉素或50mg/l利福平）或平板活化，挑取单菌落接种于5mlYEB（含125µg/ml链霉素或50mg/l利福平）或YEP(含50mg/l利福平)液体培养基中，28°C、200rpm培养24-28h。

2.取2ml菌液接种至50mlYEB（含125µg/ml链霉素或50mg/l利福平）或利福平)中，28°C、200rpm培养至OD600≈0.5左右。

3.菌液冰浴30min后，4°C、8000rpm离心10min收集菌液。

4.弃上清，用10ml0.15mol/lNacl重悬菌体，4°C、8000rpm离心10min收集菌液。

5.弃上清，用2ml20mmol/lCacl2重悬菌体，加入1ml60%无菌甘油(使其终浓度为20%），每管100μl分装，液氮冻存，-70°C保存。

重组质粒电转入农杆菌中：1.从大肠杆菌中提取重组质粒，将5μl重组质粒加入农杆菌感受态中，至于冰上30min。

2.将混合物加入电击杯中，选择“Agr”模式（电压2.2kv，时间4.9m）电击，加入800μlYEB培养基，28°C、200rpm振荡培养3-5h，8000rpm离心30S（实际操作中不离心，吸取菌液50、100、150ul等多做几个梯度，用无菌水稀释至180ul），弃上清，涂布于YEB平板（含农杆菌和质粒所带抗生素，如Kan和利福平）。

3.28°C恒温箱中倒置培养48h（24h以上）。

4.从农杆菌中提取质粒，双酶切，琼脂糖凝胶电泳检测；扩目的片段并测序验证。

5.转化烟草等实验材料。

YEB培养基：1.0.5%（w/v）蔗糖，0.1%（w/v）细菌用酵母提取物，1%（w/v）细菌用胰蛋白胨，0.05%（w/v）MgSO4·7H2O，调节pH7.0，121°C灭菌15min。

一、目的1.了解感受态细胞生理特性及制备条件，掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法。

2.掌握质粒DNA 转化大肠杆菌的方法，了解转化的条件和利用半乳糖苷酶基因插入失活选择重组质粒DNA 的原理。

二、原理〔一〕大肠杆菌感受态细胞制备的原理所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能承受外源DNA而不将其降解的生理状态。

感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA 的结合和加工等。

细胞外表正电荷增加，通透性增加，形成能承受外来的DNA 分子的受体位点等。

本实验为了把外源DNA〔重组质粒〕引入大肠杆菌，就必须先制备能吸收外来DNA分子的感受态细胞。

在细菌中，能发生感受态细胞是占极少数。

而且，细菌的感受态是在短暂时间发生。

目前对感受态细胞能承受外来DNA 分子的本质看法不一。

主要有两种假说：1、局部原生质体化假说――细胞外表的细胞壁构造发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA 分子能通过质膜进细胞。

证据有：〔1〕发芽的芽孢杆菌容易转化；〔2〕大肠杆菌的原生质体不能被噬菌体感染，却能受噬菌体DNA 转化；〔3〕适量的溶菌酶能提高转化率。

2、酶受体假说――感受态细胞的外表形成一种能承受DNA 的酶位点，使DNA分子能进入细胞。

证据是：〔1〕蛋白质合成的抑制剂如氯霉素，可以抑制转化作用；〔2〕细胞分裂过程中，一直有局部原生质化，但感受态只在生长对数期的中早期出现；〔3〕别离到感受态因子，能使非感受态细胞转变为感受细胞。

目前对感受态细胞的转化理论尚未有统一结论，但是许多实验室一直进展探索，试图从实验中获得明确答复。

有人根据pBR322 质粒DNA对E・coli K――12X1776菌株的转化结果，认为：近来，在许多研究室都发现CaCl2对受体菌处理，可提高转化效率几十倍，通常把细胞悬浮在pH6.0 的100mmol/L CaCl2中，在冰浴条件下，放置过夜，转化率转高，但一过24小时，转化率测恢复为原来的水平。

农杆菌感受态细胞的制备（以GV3101菌株为例）：1.在新铺制的加有20 mg/L Gen（庆大霉素）、50 mg/L Rif的YEB固体培养基上，用接种环或灭菌牙签“平板划线法”通过分区划线稀释分离得到农杆菌GV3101菌株的单克隆菌落。

2.挑选一个单克隆菌落，接种到5 mL新鲜的加有20 mg/L Gen、50 mg/L Rif的YEB液体培养基中，置摇床上28℃振荡培养过夜。

3.将过夜摇浓的GV3101菌液按1: 100比例接种到50 mL新鲜YEB液体培养基中，置28℃摇床，200 r/min振荡培养至OD600为0.5左右，将菌液转移至50 mL离心管，冰浴30 min。

4.集菌：将菌液置于4℃预冷的离心机中离心，4,000 r/min，10 min。

5.重悬：弃上清，加入10 mL预冷的0.15 M NaCl溶液，在冰上旋转震荡将菌块悬起，4,000 r/min，4℃离心10 min。

6.重悬：弃上清，加入1 mL预冷的20 mM CaC12溶液，在冰上旋转震荡将菌块悬起，分装至预冷的1.5 mL无菌离心管中，液氮速冻后，-80℃保存备用。

农杆菌感受态细胞的转化（冻融法）：将农杆菌感受态细胞从-80℃取出后置冰上自然解冻，在超净台中用无菌枪头吸取2 μL质粒加入到感受态细胞中，轻轻吹打混匀后于冰上静置30 min，再经液氮速冻2 min，37℃水浴热激5 min，在超净台内加入900 μL YEB液体培养基，置28℃摇床100 r/min慢速震荡复苏培养4-6 h。

复苏后的菌液离心，弃去约800灿上清，余下上清将菌体重悬起，均匀涂布到抗性筛选YEB固体培养基上，培养平板倒置于280C恒温培养箱内避光培养36—48 h。

菌落PCR初步鉴定阳性克隆：用灭菌牙签蘸一点菌落作为模板材料将其溶解在PCR反应体系中，PCR程序中的预变性时间相应延长，使细菌细胞壁裂解释放出核质。

通过比较电泳条带的大小，初步确定是否为阳性克隆。

一、目的及要求了解和掌握农杆菌感受态细胞制备的原理和方法。

二、实验原理在利用根癌农杆菌介导的基因转化中，首先要获得含有目的基因的农杆菌工程菌株。

在基因工程操作中，感受态细胞的制备和质粒的转化是一项基本技术。

感受态是细菌细胞具有的能够接受外源DNA 的一种特殊生理状态。

农杆菌的感受态可用CaCl2 处理而诱导产生。

将正在生长的农杆菌细胞在加入到低渗的氯化钙溶液中，0℃下处理便会使细菌细胞膜的透性发生改变，此时的细胞呈现出感受态。

制备好的农杆菌感受态细胞迅速冷冻于70℃可保存相当一段时间而不会对其转化效率有太大影响。

三、实验仪器、材料和试剂仪器：超净工作台，恒温摇床，冷冻高速离心机，高压灭菌锅，冰箱，70℃超低温冰柜，分光光度计，接种针，10ml 试管，50ml 离心管，1.5ml 离心管，冰浴，微量进样器及吸头。

以上玻璃仪器和离心管需在用前灭菌，灭菌条件：120℃，15分钟。

材料：土壤农杆菌LBA4404菌株或其它农杆菌菌株试剂：YEB液体培养基（1升）：酵母提取物1g，牛肉膏5g，蛋白胨5g，蔗糖5g，MgSO4.7H2O 0.5g, pH7.0，高压灭菌；链霉素（Sm）储液：125mg/ml0.15 N NaCl，高压灭菌。

20mM CaCl2，高压灭菌。

四、实验步骤1. 挑取根癌农杆菌LBA4404 单菌落于3ml 的YEB液体培养基（含Sm 125mg/l）中，28°C振荡培养过夜；2. 取过夜培养菌液0.5ml接种于50mlYEB(Sm 125mg/l)液体培养基中，28°C振荡培养至OD600为0.5；3. 5000rpm, 离心5min；4. 加入10ml 0.15N NaCl，使农杆菌细胞充分悬浮，5000rpm, 离心5min；5. 弃上清，置于冰上，加入1ml预冷的20mM CaCl2，充分悬浮细胞，冰浴中保存，24小时内使用，或分装成每管200ml，液氮中速冻1 分钟，置70°C保存备用。

版本一1.1农杆菌感受态细胞的制备1.1.1. 取-70 C保存的EHA105于含50用/ml链霉素平板划线，28 C培养。

1.1.2. 挑取单菌落接种于 5ml YM液体培养基中，220rpm 28 C振荡培养12-16 hr。

1.1.3. 取2ml菌液转接于100ml YM 液体培养基中，28 C 220rpm 振荡培养至 OD600=0.5。

1.1.4. 转入无菌离心管，5000rpm 离心5min,去上清液。

1.1.5. 加入10ml预冷的0.1M的CaCI2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min °4C 5000rpm离心5min，去上清。

1.1.6. 加入4ml预冷的含15%甘油的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮。

1.1.7. 农杆菌悬浮液分装于无菌Eppendof管中，每管200 M冻存于-70 C。

1.2.双元载体转化农杆菌 EHA105取1⑷左右的质粒 DNA加入到200ml EHA105 感受态细胞中，混匀后，冰浴30min , -70 C放置10min。

再在37 C水浴5min或42 C水浴1min，接着冰浴 2min，加入800mlYM 液体培养基 28 C, 175rpm 摇培3hr后涂在含50旧/ml Kanamycin 的YM平板上。

28 C培养到形成单菌落。

其中 YM 可以用LB代替，第一次的 CaCl2 溶液可用溶液（0.1MCaCI2 0.01Tris-HCI （7.0）0.01 DTT ）替代。

版本二普通农杆菌感受态制备与转化：1. 挑单菌落于2ml YEP培养基（含Rif20mg/ml ）中28 C过夜活化。

2. 取2ml过夜菌液接种于 50ml YEP培养基中28 C生长至 OD600约等于0.5左右（4hr ）。

3. 5k rpm离心5分钟。

4. 在10ml 0.15M NaCI 中悬浮细胞。

5. 5 krpm 离心5分钟，悬浮细胞于 20ml冰预冷的CaCI2。

版本一 1.1农杆菌感受态细胞的制备 1.1.1. 取-70℃保存的EHA105于含50μg/ml链霉素平板划线，28℃培养。

1.1.2. 挑取单菌落接种于5ml YM液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养12-16 hr。

1.1.3. 取2ml菌液转接于100ml YM液体培养基中，28℃220rpm振荡培养至OD600=0.5。

1.1.4. 转入无菌离心管，5000rpm离心5min,去上清液。

1.1.5. 加入10ml预冷的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min。

4℃5000rpm 离心5min，去上清。

1.1.6. 加入4ml预冷的含15%甘油的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮。

1.1.7. 农杆菌悬浮液分装于无菌Eppendorf管中，每管200μl冻存于-70℃。

1.2. 双元载体转化农杆菌EHA105 取1μg左右的质粒DNA加入到200ml EHA105感受态细胞中，混匀后，冰浴30min，-70℃放置10min 。

再在37℃水浴5min 或42℃水浴1min，接着冰浴2min，加入800mlYM液体培养基28℃，175rpm摇培3hr后涂在含50μg/ml Kanamycin的YM平板上。

28℃培养到形成单菌落。

其中YM 可以用LB 代替，第一次的CaCl2 溶液可用溶液（0.1MCaCl2 0.01Tris-HCl（7.0） 0.01 DTT）替代。

版本二普通农杆菌感受态制备与转化： 1. 挑单菌落于2ml YEP培养基（含Rif20mg/ml）中28℃过夜活化。

2. 取2ml 过夜菌液接种于50ml YEP培养基中28℃生长至OD600约等于0.5左右（4hr）。

3. 5k rpm离心5分钟。

4. 在10ml 0.15M NaCl中悬浮细胞。

5. 5 krpm离心5分钟，悬浮细胞于20ml冰预冷的CaCl2。

如不是马上使用，可以将之按200ul分装储存于-80℃待用。

制备感受态细胞的原理和方法1、感受态细胞的概念重组DNA分子体外构建完成后，必须导入特定的宿主（受体）细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。

在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。

所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。

cAMP可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的作用。

细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。

制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存（有效期6个月）。

二原理在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。

它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。

受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。

进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。

化学制备法：大肠杆菌的转化常用化学法（CaCl2法），该法最先是由Cohen于1972年发现的。

其原理是细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。

Ca2+处理的感受态细胞，其转化率一般能达到5×106~2×107转化子/ug质粒DNA，可以满足一般的基因克隆试验。

农杆菌感受态的制备农杆菌感受态的制备，这可算是微生物实验里的一个小挑战，就像要把一个调皮的小孩子哄得乖乖听话一样。

咱们先来说说农杆菌，这小家伙在基因工程里可有着大作用。

它就像是一个小小的快递员，能把我们想要的基因送到植物细胞里面去。

那感受态的制备呢，就像是给这个快递员打造一个合适的状态，好让它顺利接收包裹，也就是我们要转化的外源DNA。

要准备农杆菌感受态，材料可得备齐喽。

新鲜的农杆菌菌株就像是我们做菜的新鲜食材，那是必不可少的。

还有氯化钙溶液，这东西可神奇了，就像一把魔法钥匙，能帮助农杆菌打开一扇接收外源DNA的大门。

你要是少了它，就好比做饭没放盐，那可不行。

另外啊，冰也是个重要的角色，整个过程就像在冰天雪地里进行一场精密的手术，冰让农杆菌保持冷静，防止它太兴奋而乱了阵脚。

具体怎么做呢？咱们先把农杆菌从它原来的培养基里挑出来。

这就像从一群小伙伴里选出一个代表一样。

把它放到一个干净的离心管里，然后加入冰冷的氯化钙溶液。

这个时候啊，你得动作轻柔，就像对待一个脆弱的小婴儿。

因为农杆菌在这个时候是很敏感的，如果动作太粗暴，就像突然对小婴儿大喊大叫，它可能就被你吓出毛病了，那后面的实验就全泡汤了。

接着就是离心，离心机呼呼地转起来，就像一个小旋风，把农杆菌都聚集到离心管的底部。

这时候把上清液倒掉，留下的农杆菌沉淀就像被筛选出来的精华一样。

再加入冰冷的氯化钙溶液，让农杆菌在这个冰冷的环境里泡一会儿。

这感觉就像给它洗了个冷水澡，让它的状态变得更加适合接收外源DNA。

这个过程中啊，你得时刻保持警惕。

就像一个站岗的士兵一样，不能有丝毫的松懈。

温度要控制好，要是温度高了，农杆菌就像被热晕了的小动物，它的状态就不对了。

这跟我们人一样啊，在合适的温度下才会感觉舒服，农杆菌也是如此。

等农杆菌在氯化钙溶液里泡够了时间，这感受态也就差不多制备好了。

这时候的农杆菌就像一个严阵以待的小战士，随时准备接受我们给它的外源DNA这个特殊任务。

农杆菌感受态细胞的制备原理和实验步骤及验证农杆菌电击感受态的制备及电击转化表达载体pB-2mb-FRO-1.7A和pB-2mb-1.7A空载体的农杆菌（EHA105）电击转化（1）抽提纯化pB-2mb-FRO-1.7A和pB-2mb-1.7A空载体的重组质粒 pB-2mb-FRO-1.7A重组载体和pB-2mβ-1.7A空载体的（DH5α）菌种接种于5ml LB（含卡那霉素50mg/L）液体培养基中，37℃，200rpm震荡培养过夜。

按V-GENE公司的质粒提取试剂盒提取pB-2mb-FRO-1.7A重组质粒。

（2）取200ml型号的电击杯用无水乙醇浸泡，晾干。

（3）农杆菌EHA105电击预备处理。

I. 接种于5ml YEP（含链霉素Sm50mg/L）液体培养基中，28℃，200rpm震荡培养过夜至OD600值为0.4。

EHA105 II. 离心管中收集1ml菌液，4℃，8000rpm，离心30s。

1.5mlIII. 去残液，沉淀用200μl ddH2O充分悬浮，4℃，8000rpm，离心30s。

IV. 重复步骤�Ｈ�次。

V. 去残液，沉淀用200ml ddH2O充分悬浮，即为电击用农杆菌EHA105感受态。

加入200μl灭菌甘油混匀后置于-80℃备用。

（4）电击I. 分别取10ml pB-2mb-FRO1-1.7A和pB-2mb-1.7A重组质粒至200μl EHA105感受态中，轻打混匀，然后转移至电击杯中，置冰上。

II. 准备好电击装置（BioRad），电压为2.5V，用手按住电击按钮，直到啪的一声电击完毕。

III. 室温静置2min后加入800ml YEP培养液，28℃静置1h，然后28℃，200rpm培养2h。

IV. 离心30s，收集菌液，沉淀用200ml ddH2O悬浮，用玻璃棒涂布含含卡那霉素50mg/L和含链霉素Sm50mg/L的YEP固体培养基平板，28℃培养48h。

8000rpm1. 制备农杆菌电转感受态(1)挑取根癌农杆菌EHA 105单菌落，接种于5mlLB〔含利福平(Rif) 50mg/L,；链霉素100mg/L)液体培养基中，28'C, 220rpm震荡培养过夜。

实验五大肠杆菌感受态细胞的制备及转化一、实验原理体外连接的重组DNA分子导入合适的宿主细胞中才能大量的进行复制、增殖和表达。

研究发现，用含Ca2+ 的溶液处理大肠杆菌细胞会易于吸收外源DNA。

大肠杆菌吸收外源DNA的过程被称为转化。

细菌处于容易吸收外源DNA的状态称为感受态。

用理化方法可以诱导细胞进入感受态，如电转化法、CaCL2法。

CaCL2法是目前实验室常用的制备感受态细胞的方法，其原理是使细菌处于0°C 、CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，细胞膜的通透性发生改变，外源DNA附着于细胞膜表面，经42°C短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物。

宿主细胞一般是限制―修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，而质粒载体携带有某一抗生素抗性基因，如抗氨卞青霉素的基因（AP＋）。

若将转化的细胞涂布与于含氨卞青霉素的平板上，则只有那些含有被转化质粒的细胞才能生存并生长增殖。

从而可以筛选出哪个克隆含有质粒。

本实验以E.coli JM109菌株为受体细胞，用CaCl2处理受体菌使其处于感受态，然后与pUC18质粒共保温实现转化。

将经过转化后的全部受体细胞进行适当稀释，在含有氨卞青霉素的平板培养基上培养，只有转化体才能存活，而未有转化的受体细胞则因无抵抗氨卞青霉素的能力而死亡。

转化子经过扩增后，可将转入的质粒DNA分离提取出来，用于电泳分析、限制性内切酶图谱的制作以及DNA测序等实验。

二、仪器及试剂1. 仪器：恒温摇床、电热恒温培养箱、电热恒温水浴锅、超净工作台、分光光度计、高速冷冻离心机、台式离心机。

2. 材料E.coli JM109受体菌、质粒pUC18。

3. 试剂：LB培养液（1L）：胰蛋白胨 10g酵母粉 5gNaCl 10g（高盐）或5g（低盐）氨苄青霉素（Ampicillin） 100mg/ml在三角瓶中将胰蛋白胨 10g，酵母粉 5g以及 NaCl 5g溶于1L的重蒸水中并高压灭菌。

农杆菌感受态的制备和转化版本一1.1农杆菌感受态细胞的制备1.1.1. 取-70℃保存的EHA105于含50μg/ml链霉素平板划线，28℃培养。

1.1.2. 挑取单菌落接种于5ml YM液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养12-16 hr。

1.1.3. 取2ml菌液转接于100ml YM液体培养基中，28℃220rpm振荡培养至OD600=0.5。

1.1.4. 转入无菌离心管，5000rpm离心5min,去上清液。

1.1.5. 加入10ml预冷的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min。

4℃5000rpm 离心5min，去上清。

1.1.6. 加入4ml预冷的含15%甘油的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮。

1.1.7. 农杆菌悬浮液分装于无菌Eppendorf管中，每管200μl冻存于-70℃。

1.2. 双元载体转化农杆菌EHA105取1μg左右的质粒DNA加入到200ml EHA105感受态细胞中，混匀后，冰浴30min，-70℃放置10min 。

再在37℃水浴5min或42℃水浴1min，接着冰浴2min，加入800mlYM液体培养基28℃，175rpm摇培3hr后涂在含50μg/ml Kanamycin的YM平板上。

28℃培养到形成单菌落。

其中YM 可以用LB 代替，第一次的CaCl2 溶液可用溶液（0.1MCaCl2 0.01Tris-HCl（7.0）0.01 DTT）替代。

版本二普通农杆菌感受态制备与转化：1. 挑单菌落于2ml YEP培养基（含Rif20mg/ml）中28℃过夜活化。

2. 取2ml过夜菌液接种于50ml YEP培养基中28℃生长至OD600约等于0.5左右（4hr）。

3. 5k rpm离心5分钟。

4. 在10ml 0.15M NaCl中悬浮细胞。

5. 5 krpm离心5分钟，悬浮细胞于20ml冰预冷的CaCl2。

如不是马上使用，可以将之按200ul分裝储存于-80℃待用。

制备感受态细胞的原理和方法1、感受态细胞的概念重组DNA分子体外构建完成后，必须导入特定的宿主（受体）细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。

在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。

所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。

cAMP可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的作用。

细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。

制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存（有效期6个月）。

二原理在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。

它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。

受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。

进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。

化学制备法：大肠杆菌的转化常用化学法（CaCl2法），该法最先是由Cohen于1972年发现的。

其原理是细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。

Ca2+处理的感受态细胞，其转化率一般能达到5×106~2×107转化子/ug质粒DNA，可以满足一般的基因克隆试验。

农杆菌感受态细胞制备第一天晚至第三天晚： 1）取-80℃保存的GV3101于含50μg/ml 利福平的LB （千分之一的利福平）平板划线，28℃培养（一般要两天）。

注意：划线的时候要少沾一点原菌株，不必等到菌株融化就可轻轻沾一点，一定要少量，然后轻轻地划在板上。

挑得太多不容易长出单菌落，如果太用力也容易伤到菌株。

第三天下午或晚： 2) 挑取单菌落接种于灭菌的50ml 新管子加10ml 50μg/ml （千分之一）利福平的LB 液体培养基中，200rpm 28℃振荡培养12-16 hr （过夜可以）。

注意：管子最好用灭菌过的报纸包一下，摇菌时。

第四天早： 3) 取1-2ml （按1:50或者1:100的比例）菌液转接于含有50μg/ml （千分之一）利福平的100ml LB 液体培养基中（用500 ml 的三角瓶来摇菌28℃，200rpm 振荡培养至OD 600=0.5）。

注意：摇菌的过程可能需要3-4小时，要随时监控菌的浓度，可以平行的摇两瓶，其中一瓶用来测浓度，避免污染；并且为了保证检测菌液与未检测菌液的一致性，平行的两瓶菌液，最好来源于同一个50 ml 管子的菌液。

摇菌的过程中可以预先把NaCl 置于冰上预冷。

4) 转移菌液到新的灭过菌的50 ml 离心管中，冰上30min ； 5) 4℃，5000rpm 离心5min 。

6) 在超净台中弃上清，将管子倒立在灭过菌的吸水纸上，尽量倒干，可以用预冷的NaCl 快速冲洗一遍。

7) 加入10ml 预冷的0.15M 的NaCl 溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min 。

注意：要用5ml 枪调到3ml 挡，轻轻抽打。

8) 4℃，5000rpm 离心5min 。

9) 在超净台中弃上清，将管子倒立在灭过菌的吸水纸上，尽量倒干。

10）加入2 ml 预冷的含15%甘油的20mM 的CaCl 2溶液，轻轻悬浮。

注意：要用1ml 枪轻轻抽打。

11）按200ul 的量分装到1.5 ml 无菌Eppendorf tube 中，液氮速冻，-80℃保存，一般不要存放超过2-3个月。