感受态细胞的制备(DH5α大肠杆菌)

dh5a感受态细胞的制备简介感受态细胞是一类作为实验室工具广泛应用于基因工程和分子生物学研究的细胞系。

dh5a是其中一种常用的感受态细胞系，本文将介绍dh5a感受态细胞制备的步骤和相关实验技术。

1. 前期准备工作在进行dh5a感受态细胞的制备实验之前，我们需要准备以下材料和设备：•dh5a感受态细胞的培养基•dh5a感受态细胞的平板培养基•大肠杆菌感染物（包含目标DNA）•取消感染物（用于抑制非感兴趣的背景细胞的生长）此外，还需要以下设备和试剂：•培养箱•离心机•培养皿（包括平板和液体培养皿）•微量移液器和相关移液器头2. 制备dh5a感受态细胞步骤步骤1：准备感受态细胞培养基1.将dh5a感受态细胞培养基取出并放置在室温下静置，使其达到室温。

2.使用无菌技巧，打开培养基瓶盖并使用无菌移液器将适量培养基转移到培养皿中。

步骤2：感染dh5a感受态细胞1.取出dh5a感受态细胞的平板培养基，并在培养箱中孵育过夜（一般为37℃，孵育时间可根据实验要求略有调整）。

2.取出符合要求的感染物冻存管，使用微量移液器分配适量dh5a感受态细胞平板培养基到液体培养皿中。

3.加入相应的抗生素，以抑制非感兴趣的背景细胞的生长。

4.使用微量移液器将取出的感染物缓慢滴加到液体培养皿中。

5.轻轻摇晃液体培养皿，使感染物和细胞均匀混合。

6.将液体培养皿放回培养箱，进行孵育（37℃，孵育时间根据实验要求略有调整）。

步骤3：培养感染细胞1.孵育一段时间后，取出感染皿检查细胞的生长情况。

感染细胞的数量应明显增加。

2.打开培养箱门，用无菌移液器采集感染细胞。

3.将感染细胞转移到含有抗生素的培养基中，以便筛选转化的感受态细胞。

4.将细胞分裂到平板培养基上。

5.在液体培养基中孵育过夜后，将平板培养基转移到培养箱中进行孵育。

3. 结论通过以上步骤，我们成功制备了dh5a感受态细胞。

在实验室研究中，dh5a感受态细胞常被用于DNA克隆、转化和基因表达等实验。

大肠杆菌DH5α感受态细胞转化率的改进桓明辉摘要：针对实验材料E．coli DH5α，对该茵株在不同生长时期的转化效率进行测定，确立了一个能制备高转化率感受态细胞的实验方案。

结果表明：在细茵的生长繁殖过程中，其转化率有很大变化；结果：得到了E．coil DH5α茵株制备感受态细胞的最佳条件。

关键词：大肠杆茵；感受态；转化率DH5a是一种常用于质粒克隆的菌株。

E.coli DH5a在使用pUC 系列质粒载体转化时，可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补，可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。

感受态细胞的制备和转化是分子生物学实验室频繁使用的一项重要的常规操作。

对细菌而言，为达到高效转化，活细胞数务必少于l08细胞／m1。

对于大多数E.coli来说，相当与OD600为0.4左右，但由于转化是一个很复杂的过程，具体的作用机理仍在探究中。

有文献指出[1]，细菌的最佳感受态细胞制备期对于不同菌株是不同的，并不一定都是在活细胞浓度为l08细胞／ml的时候最适宜，有必要针对所使用的菌株确定其最佳转化条件。

1 材料与方法1.1 材料与试剂菌株与质粒：E．coli DH5α，pUC18质粒由本实验室保存。

X-gal，IPTG，LB培养基，氨苄青霉素溶液，0.1 mol／L CaCl2溶液，均按《分子克隆实验指南》的要求配制。

1.2 方法1.2.1大肠杆菌生长情况的测定：从平板上挑取单个菌落(直径2～3 mm)到含有30ml LB培养基的锥形瓶中，37℃下250 r／min培养过夜。

取出0.3 ml培养物到含有l5 ml LB培养基的摇菌试管中，继续振荡培养，每隔20 min 取出一支摇菌试管，放于冰箱．统一测定菌液的OD600，绘制生长曲线。

选取几个不同时相的菌液倍比稀释从lO-1～lO-6，各取0.1 ml 稀释液涂布LB平板培养基，37℃正向培养1 h后，倒置培养l2～16 h。

每个稀释度铺3个平板，计数，作OD600一活菌细胞浓度图。

大肠杆菌感受态细胞的制备
大肠杆菌感受态细胞是一种重要的细菌功能研究模型。

下面是制备大肠杆菌感受态细胞的步骤：
1. 选择适当的大肠杆菌菌株，通常使用DH5α或BL21(DE3)等菌株；
2. 选用适当的质粒载体（例如pET系列），根据需要将目标基因插入载体中；
3. 制备大肠杆菌的化学转化液（例如CaCl2转化法），转化质粒到大肠杆菌细胞中；
4. 通过筛选和鉴定，筛选出带有目标基因的单克隆菌株；
5. 将单克隆菌株培养至对数生长期，然后添加适当浓度的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），诱导目标基因的表达；
6. 培养细胞至感受态状态，通常需要1-2小时的诱导时间；
7. 用适当的方法分离并提取感受态细胞膜，例如超声法或离心法；
8. 在提取的细胞膜中添加目标配体或生理作用物质，检测感受态细胞的响应。

通过这些步骤，我们可以制备出高效的大肠杆菌感受态细胞，用于研究蛋白质的结构和功能、药物筛选等方面的研究。

制备和转化感受态大肠杆菌的Inoue方法：制备超级感受态细胞采用Inoue的方法（1990）制备大肠杆菌感受态细胞很好时甚至能达到Hanahan方法（1980）的转化效率。

但在标准的实验室条件下，达到l×108~3×108个转化克隆/ug质粒DNA的转化效率更为常见。

与Hanahan方法相比，这一方法的优点在于并不过分地讲究细节，但是重复性更好，而且更有预见性。

这一方法与其他方法有所不同的是细菌在18℃进行培养而不是通常的37℃。

否则这个方法也就没有什么特别之处，而不过是一个司空见惯的标准程序。

没有人知道为何在低温进行细菌培养会影响转化效率。

也许是18℃时合成的菌膜成分和物理性状更有利于攫取DNA，也许是低温使有利于高效转化的生长时相延长了。

在18℃进行细菌培养并非易事，大多数实验室缺乏在夏天和冬天能够准确保持18℃的摇床。

将摇床置于4℃冷室，用温控器加温至18 ℃是一个解决问题的方法。

也可使培养物的温度维持在20~23℃，这样做并不会造成转化效率降低，这一温度在很多实验室其实是室温。

在这一温度范围，细菌生长得很慢，倍增时间大约为2.5~4h。

如此缓慢的生长可能会导致培养失败，尤其是在晚间较迟的时候，这时细菌的OD600吸收值似乎永远不能达到理想的0.6。

解决这个问题的方法是晚上就进行培养，第二天一早收获细菌。

分子克隆中常用的很多大肠杆菌品系都适用于这种方法，如XL-Blue、DH1、JM103、JM108/109、DH5a 和HB101。

材料注息：标记〈！〉试剂的正确操作，请参见附录12。

缓冲液和溶液贮存液、缓冲液和试剂成分请见附录1。

使用时将贮存液稀释至适当浓度。

二甲亚砜DMSO 〈！〉二甲亚砜的氧化产物据推测为二甲硫醚，是转化的抑制物（Hanahan 1985）。

为避免上述问题，应购买高质量的DMSOInoue转化缦冲液（见步骤1)用前置于冰上预冷至0℃。

核酸和寡核苷酸质粒DNA (重组质粒〉构建方法采用本章方案17和22所提供的方法。

dh5a感受态细胞的制备DH5α感受态细胞的制备引言：大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，也是生物学实验中最常用的模式生物之一。

在分子生物学和基因工程领域，大肠杆菌被广泛用于蛋白质表达、基因克隆、DNA测序等实验中。

其中，DH5α感受态细胞是最常用的一种。

本文将介绍DH5α感受态细胞的制备方法。

一、实验前准备1.1 菌种选取首先需要选择适合自己实验需求的大肠杆菌质粒转化菌株。

DH5α感受态细胞是含有F-质粒（Fertility factor）的E. coli K12株系，具有高度敏感性和高转化效率，广泛应用于基因克隆、DNA测序等领域。

1.2 质粒DNA提取在进行质粒转化前，需要提取所需质粒DNA，并通过琼脂糖凝胶电泳等方法进行检测和纯化。

质粒DNA的提取方法有多种，如碱裂解法、酚/氯仿法等。

1.3 化学试剂准备进行DH5α感受态细胞制备的实验中，需要准备一些常用的化学试剂，如CaCl2、MgCl2、LB培养基等。

二、DH5α感受态细胞的制备方法2.1 菌株处理将DH5α感受态细胞从-80℃冰箱中取出，用无菌吸管取出适量菌液接种到含有LB培养基的50mL离心管中。

在37℃恒温振荡培养器中进行预培养，转速为200rpm，时间为8小时左右。

2.2 转化体系制备将质粒DNA加入到含有CaCl2和MgCl2的转化缓冲液中，并在室温下静置15分钟。

其中转化缓冲液的配方为：10mM Tris-HCl（pH 7.4）、100mM CaCl2、50mM MnCl2、100mM MgCl2。

2.3 转化处理将预培养后的DH5α感受态细胞进行离心处理，去掉上清液。

然后加入转化体系，并在室温下静置30分钟。

之后将样品加热至42℃水浴中进行热激处理，时间为45秒左右。

然后将样品放入冰水中进行冷激处理，时间为2分钟左右。

2.4 恢复处理将转化后的细胞加入到含有LB培养基的离心管中，并在37℃恒温振荡培养器中进行恢复处理，转速为200rpm，时间为1小时左右。

第1篇一、实验目的1. 了解感受态细胞的制备方法。

2. 掌握感受态实验的基本原理和操作步骤。

3. 学习感受态细胞在基因工程中的应用。

二、实验原理感受态细胞是指对DNA分子具有高亲和力和吸收能力的细胞。

在基因工程中，利用感受态细胞将外源DNA分子导入细胞内，是构建基因表达载体、基因克隆等实验的重要步骤。

感受态细胞的制备方法有化学法和电击法等。

三、实验材料1. 细菌：大肠杆菌（E. coli）DH5α菌株。

2. 质粒：pUC19载体。

3. 试剂：CaCl2、琼脂糖、DNA分子、限制性内切酶、DNA连接酶、T4 DNA聚合酶、Tris-HCl缓冲液、NaCl等。

4. 仪器：电热恒温培养箱、离心机、电泳仪、凝胶成像系统、紫外灯、移液器、无菌操作台等。

四、实验方法1. 感受态细胞的制备（1）将大肠杆菌DH5α菌株在LB液体培养基中培养过夜。

（2）次日，将过夜培养的细菌按照1:100的比例加入新鲜的LB液体培养基中，在37℃恒温培养箱中培养2小时。

（3）将培养好的细菌在冰浴中冷却5分钟。

（4）向冷却后的细菌中加入1ml的CaCl2溶液，混匀。

（5）将混匀后的细菌在冰浴中继续冷却30分钟。

2. 感受态实验（1）将质粒pUC19在限制性内切酶HindIII和EcoRI酶切，回收酶切片段。

（2）将回收的酶切片段与T4 DNA连接酶在16℃连接过夜。

（3）将连接好的DNA分子转化感受态细胞。

（4）将转化后的细胞在37℃恒温培养箱中培养1小时。

（5）将培养好的细胞涂布在含有氨苄西林的LB琼脂糖平板上，37℃恒温培养箱中培养过夜。

（6）观察菌落生长情况，挑取白色菌落进行PCR验证。

五、实验结果与分析1. 感受态细胞制备成功，细菌在LB琼脂糖平板上生长良好。

2. 转化后的细胞在氨苄西林平板上生长出白色菌落，说明转化成功。

3. PCR验证结果显示，白色菌落中含有目的基因，验证转化成功。

六、实验讨论1. 感受态细胞的制备过程中，冰浴和CaCl2溶液的使用是关键步骤，有助于提高转化效率。

大肠杆菌感受态细胞的制备原理步骤以及重组质粒转化一、目的1.了解感受态细胞生理特性及制备条件，掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法。

2.掌握质粒DNA 转化大肠杆菌的方法，了解转化的条件和利用半乳糖苷酶基因插入失活选择重组质粒DNA 的原理。

二、原理（一）大肠杆菌感受态细胞制备的原理所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能接受外源DNA而不将其降解的生理状态。

感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA 的结合和加工等。

细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的DNA 分子的受体位点等。

本实验为了把外源DNA（重组质粒）引入大肠杆菌，就必须先制备能吸收外来DNA分子的感受态细胞。

在细菌中，能发生感受态细胞是占极少数。

而且，细菌的感受态是在短暂时间内发生。

目前对感受态细胞能接受外来DNA 分子的本质看法不一。

主要有两种假说：1、局部原生质体化假说――细胞表面的细胞壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA 分子能通过质膜进细胞。

证据有：（1）发芽的芽孢杆菌容易转化；（2）大肠杆菌的原生质体不能被噬菌体感染，却能受噬菌体DNA 转化；（3）适量的溶菌酶能提高转化率。

2、酶受体假说――感受态细胞的表面形成一种能接受DNA 的酶位点，使DN A分子能进入细胞。

证据是：（1）蛋白质合成的抑制剂如氯霉素，可以抑制转化作用；（2）细胞分裂过程中，一直有局部原生质化，但感受态只在生长对数期的中早期出现；（3）分离到感受态因子，能使非感受态细胞转变为感受细胞。

目前对感受态细胞的转化理论尚未有统一结论，但是许多实验室一直进行探索，试图从实验中获得明确回答。

有人根据pBR322 质粒DNA对E?coli K――12 X1776菌株的转化结果，认为：近来，在许多研究室都发现CaCl2对受体菌处理，可提高转化效率几十倍，通常把细胞悬浮在pH6.0 的100mmol/L CaCl2中，在冰浴条件下，放置过夜，转化率转高，但一过24小时，转化率测恢复为原来的水平。

工程菌DH5a感受态细胞的制备及质粒pGEM的转化研究杜祯,马海利,陈瑞芳(山西农业大学,太谷　030801)摘要:绿色荧光蛋白(g reen fluo rescent pr otein,G FP)是源于海洋生物多管水母属(aequoia v icto ria)的一种发光蛋白,能够自身催化形成生色团并在蓝光激发下发出绿色荧光,能在活细胞内稳定表达,本试验首先从含有G FP的大肠杆菌中提取质粒,并利用胶回收试剂盒纯化质粒,采用氯化钙法将工程菌D H5a制成感受态细胞,然后将纯化后的质粒转入已制备好的感受态细胞中,使得工程菌DH5a转化成具有抗氨苄青霉素的大肠杆菌,并表达绿色荧光蛋白,接种于加氨苄青霉素的LB培养基上,筛选阳性克隆。

关键词:G FP;工程菌D H5a;质粒pG EM中图分类号:S852.61+2 文献标识码:A 文章编号:1671-7236(2007)05-0088-03 质粒pG EM是一长度为4.7kb的环形DNA,在其序列中有一编码绿色荧光蛋白的基因,它所表达的绿色荧光蛋白(g reen fluorescent protein, GFP)是源于海洋生物多管水母属(aequoia victori-a)的一种发光蛋白,能够自身催化形成生色团并在蓝光激发下发出绿色荧光,能在活细胞内稳定表达。

在pGEM的序列结构中有来自大肠杆菌T7及T3噬菌体(Studier等,1981;Davanlo o等,1984;Tabor 等,1985)的强启动子下游装置多克隆位点,组建成质粒载体(pGEM)就有可能合成高比活度的单链DNA探针。

工程菌株DH5a是实验室常用的一个宿主菌,常被用于质粒克隆和原核表达研究,本试验旨在研究该菌株的感受态细胞制备以及转化活性如何,为今后相关工作的开展,摸索条件。

大肠杆菌感受态细胞的制备和转化,是动物基因工程中最基本的试验技术,也是利用大肠杆菌介导法进行动物转化的重要前提,而感受态细胞制备的质量直接影响其转化率。

大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验反思【原创版3篇】目录（篇1）1.实验目的与原理2.实验步骤3.实验结果与分析4.实验反思正文（篇1）一、实验目的与原理大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验旨在通过转化方法将外源基因导入大肠杆菌中，从而实现目的基因的表达。

实验原理主要基于重组 DNA 技术，通过外源 DNA 与载体 DNA 的连接，形成重组表达载体，然后将载体转化入大肠杆菌细胞内，使外源基因得以在细胞内表达。

二、实验步骤1.制备大肠杆菌感受态细胞（1）将 500 ml DH5a 的培养物在 LB 中培养至 OD 0.4-0.5（2）将培养瓶在冰浴中摇动 1-2 分钟以预冷细胞（3）将细胞置于无菌预冷离心瓶中，在 5K、4 下旋转 10 分钟（4）弃上清，并将菌液重浮于 1/10 体积 (即 50 毫升) 的冰冷的TSS 中（5）将 05 ml 样品放入预冷的无菌 Eppendorf 试管中，在液氮中快速冷冻。

在一 70C 下储存 KCM 感受态细胞2.转化实验（1）加入 20ul 5XKCM，加入 DNA 和 dd H20 至总体积为 100ul，保持冰上（2）加入 100ul 感受态细胞，混合并在冰上保持 20 分钟（3）37 热激 90 秒（4）向试管中加入 1ml 预热的 LB，在 37 温育 40-60 分钟（5）离心，剩余 50uL 菌体涂布在选择性培养基 (LB-amp/kana) 上。

三、实验结果与分析实验结果主要观察转化后大肠杆菌菌落是否具有抗生素抗性。

将涂布后的培养基在适当条件下培养，观察菌落生长情况。

若菌落生长，说明转化成功；若无菌落生长，则转化失败。

四、实验反思本次实验中，制备感受态细胞及转化过程均较为顺利，但需要注意实验过程中的无菌操作，避免因操作不当导致实验失败。

目录（篇2）1.实验目的与原理2.实验步骤及操作要点3.实验结果与分析4.实验反思与建议正文（篇2）一、实验目的与原理大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验旨在通过转化方法将外源基因导入大肠杆菌，从而实现基因的表达和功能研究。

E.coli DH5α感受态细胞的制备大肠杆菌DH5α是一种诱变菌株，主要表现对外源DNA的免疫缺乏。

是用于基因工程的菌种，相比于正常菌种缺少了一定的免疫机制。

DH5α菌株是一种能够摄入外源DNA的受容菌，普通的大肠杆菌细胞内有一种“免疫”机制，即当外源DNA侵入时，会产生诸如限制性内切酶类的物质，将外源的DNA剪切掉，而其自身DNA因被修饰（如甲基化）所以不被限制酶识别，不会被剪切。

这样的菌是不能直接用于基因工程的，我们总不希望目的基因导入进去还来不及复制就被剪切掉。

DH5α菌株是一种经诱变的菌株，其基本特性是：Rˉ、Mˉ、AMPˉ。

Mˉ是指DH5α菌株缺乏DNA修饰，即其自身DNA不会被修饰。

Rˉ是指其缺乏“免疫”机制，不会对导入的外源DNA切割。

AMPˉ是指其对氨苄青霉素敏感。

DH5α菌株可以用于制作基因库、质粒克隆等，可用作基因工程的受体菌。

一、实验准备（一）实验材料大肠杆菌E.coli DH5α（二）试剂与耗材LB平板、LB液体培养基、50ml无菌离心管、1.5ml无菌离心管、无菌枪头、0.1M CaCl2、0.1M CaCl2+甘油、过滤器、无菌水。

（三）仪器与设备恒温培养箱、冷冻离心机、制冰机、超净工作台。

二、实验步骤（一）平板制备流程1.将超净工作台的紫外灯打开，将平皿、酒精灯、70%酒精、1000uL枪头放入超净工作台内，对超净工作台进行紫外灭菌30分钟；2.超净工作台灭菌后打开风机至3档并关闭紫外灯，风机运行5分钟后将已灭菌的固体培养基放在超净工作台上；3.准备进行无菌操作时，将70%的酒精喷洒在手套及袖口上和融化好的固体培养基（以不烫手为宜）、抗生素上，然后放入工作台中，待手套上酒精挥发完全后点燃酒精灯；4.将平皿的外包装胶袋拆开，将平皿皿底朝下摆放整齐；5.向培养基中加入一定量所需的抗生素（工作浓度为配置浓度的1/1000，例如300mL的培养基中加入300μL抗生素），轻轻摇匀，不要摇起气泡；若制备无抗平板，则此步骤省略；6.将培养皿放在火焰旁的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拔开无菌透气膜；7.右手拿锥形瓶，使瓶口迅速通过火焰；8.用左手将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将培养基倒入培养皿中（布满平皿底面积2/3即可），左手立即盖上培养皿的皿盖，轻轻摇匀，使培养基均匀分布在平皿上；9.等待平板冷却凝固（约需20min）后，将平板倒置，使皿盖在下，皿底在上，再将平皿用保鲜袋装好，标明倒板的日期和相应抗性后放入4℃冰箱保存。