棒状杆菌临床分离株药物敏感性及同源性分析

・　７８２　・　・基础实验研究论著・　国际检验医学杂志２０１２年４月第３３卷箍！塑　ｎｔ』　！垒　！　：望！　！　

棒状杆菌临床分离株药物敏感性及同源性分析　谢爱香　（河南省濮阳市中医院检验科４５７０００）　

摘要：目的　了解棒状杆菌感染在临床中的耐药状况及同源性。方法　用肉汤微量细菌定量法检测抗茵药物的最低抑茵　浓度（ＭＩＣ），随机扩增多态性ＤＮＡ（ＲＡＰＤ－ＰＣＲ）并对棒状杆茵进行基因分型。结果　１８４株棒状杆菌对青霉素、头孢噻肟、红霉　素、环丙沙星、四环素、克林霉素的耐药率均超过５Ｏ　，对多西环素、亚胺培南、庆大霉素、利福平的耐药率在６Ｏ　～８Ｏ　之间，未　发现对万古霉素和刺奈唑胺耐药。１８株纹带分离株可分成５型，其中Ａ型占１４株（７７．８　）。结论　棒状杆茵对多种抗茵药物　的敏感性降低，纹带棒状杆茵存在院内传播的趋势。　关键词：棒状杆菌属；耐药性；　聚合酶链反应；基因分型；序列同源性　ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７３—４１３０．２０１２．０７．００６　文献标识码：Ａ　文章编号：１６７３—４１３０（２０１２）０７—０７８２—０２　

Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ　ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ　ａｎｄ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ　Ｘｉｅ　Ａｉｘｉａｎｇ　（Ｄｅｐａｒｔｅｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　Ｐｕｙａｎｇ　Ｃｉｔｙ，Ｐｕｙａｎｇ　Ｈｅ　ｎａｎ　４５７０００，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｄｒｕｇ　ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ　ａｎｄ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｍｉｎｉｍａｌ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ（ＭＩＣｓ）ｏｆ　Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｏ　１２　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ　ｗｅｒｅ　ｔｅｓｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｈｏｍｅ－ｂｒｅｗ　ｂｒｏｔｈ　ｄｉｌｕ—　ｔｉｏｎ　ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｓ　ａｎｄ　ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ　ｏｆ　Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｗｅｒｅ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ　ｂｙ　ｒａｎｄｏｍ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　ＤＮＡ—‘ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅ　－　ａｃｔｉｏｎ（ＲＡＰＤ－ＰＣＲ）．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　ｄｒｕｇ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｏｆ　１８４　ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｏ　ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ，ｃｅｆｏｔａｘｉｍｅ，ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ，ｃｉｐ—　ｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ，ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ　ａｎｄ　ｃｌｉｎｄａｍｙｃｉ　ｗｅｒｅ　ｍｏｒｅ　ｔｈａｎ　５０　，ａｎｄ　ｔｏ　ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ，ｉｍｉｐｅｎｅｍ，ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ　ａｎｄ　ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ　ｗｅｒｅ　ａｂｏｕｔ　６Ｏ　一８０　，ｔｏ　ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ　ａｎｄ　ｌｉｎｅｚｏｌｉｄ　ｗｅｒｅ　０　．Ｅｉｇｈｔｅｅｎ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｔｒａｔｕｍ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｄｉｖｉｄｅｄ　ｉｎｔｏ　５　ｔｙｐｅｓ，ａ—　ｍｏｎｇ　ｗｈｉｃｈ　１４（７７．８　）ｓｔｒａｉｎｓ　ｂｅｌｏｎｇｅｄ　ｔｏ　Ａ－ｔｙｐｅ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｅ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｏ　ｖａｒｉｏｕｓ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ　ｍｉｇｈｔ　ｂｅ　ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ　ａｎｄ　ｔｈｅｒｅ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ａ　ｔｅｎｄｅｎｃｙ　ｏｆ　ｉｎ－ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｓｐｒｅａｄ　ｏｆ　Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｔｒａｔｕｍ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ；ｄｒｕｇ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ；ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ；　ｇｅｎｏｔｙｐｅ；　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ　

随着新发病原体的不断出现，感染性疾病在世界各国致死　性病因中的数量不断上升，以及多重耐药细菌和医院感染暴发　流行，临床微生物检验在临床医疗工作中的作用日益重要［１　］。　近年来棒状杆菌引起临床感染的报道越来越多，相关微生物指　标的准则也对其临床意义进行评价ｌ＿３］。现对棒状杆菌的耐药　情况及纹带棒状杆菌同源性进行研究，报道如下。　１资料与方法　１．１一般资料　收集２００６年１１月至２００８年１Ｏ月该院临床　标本分离的１８４株棒状杆菌。　１．２仪器与试剂２４００型ＰＣＲ扩增仪器（美国ＰＥ公司），电　泳仪（美国ＢＩＯ－ＲＡＤ公司），凝胶成像系统（美国ＢＩＯ－ＲＡＤ公　司）。５％羊血琼脂平板和微量细菌定量（ＭＩＣ）药敏试剂盒购　自天津金章科技发展有限公司，包括青霉素（ＰＧ）、头孢噻肟　（ＣＴＸ）、亚胺培南（ＩＰＭ）、环丙沙星（ＣＩＰ）、庆大霉素（ＣＮ）、红　霉素（Ｅ）、克林霉素（ＣＬＩ）、万古霉素（Ｖａ）、多西环素（ＤＯＸ）、四　环素（ＴＥ）、利福平（ＲＤ）、利奈唑烷（ＬＺＤ）等１２种抗菌药物。　Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶，１Ｏ×ｌｏａｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ，ＰＣＲ染料，４种ｄＮＴＰ　混合液（ｔ￣ｍｏｌ／Ｌ），染料ＧＯＬＤ　Ｖ和琼脂糖均为北京赛百盛公　司产品，ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ（２　０００　ｂｐ）为北京普博欣生物科技有限　责任公司产品。蛋白酶Ｋ、溶菌酶、ＳＤＳ均为上海生工生物工　程有限公司产品。　１．３引物合成按文献Ｅ４］设计，引物均由北京赛百盛生物技　术有限公司合成。见表１。　１．４药敏试验药敏试验使用肉汤微量细菌定量（ＭＩＣ）试剂　盒，操作按试剂盒说明书和标准规程完成　］。结果按ＣＬＳＩ　Ｍ４５一Ａ棒状杆菌ＭＩＣ判断标准。庆大霉素和环丙沙星用大　肠埃希菌ＡＴＣＣ２５９２２菌株进行质控，其他药物用肺炎链球菌　ＡＴＣＣ４９６１９菌株进行质控。　表１　６种引物序列　

引物　序列顺序　５＇－ＧＧＴＧＣＧＧＧＡＡ－３　５　一ＧＴＴＴＣＧＣＴＣＣ－３　５　一ＧＴＡＧＡＣＣＣＧＴ－３　５　一ＡＡＧＡＧＣＣＣＧＴ一３　５　一ＡＡＣＧＣＧＣＡＡＣ一３　５　一ＣＣＣＧＴＣＡＧＣＡ一３　

１．５基因分型　１．５．１　ＤＮＡ提取每个ＥＰ管中加入５Ｏ　Ｌ溶菌酶（５０　ｍｇ／　ｍＬ），再加入１环待检菌株的纯培养物，３７℃孵育３０　ｒａｉｎ；加　入５Ｏ肛Ｌ的蛋白酶Ｋ（２００／ｔｇ／ｍＬ）和１５０　Ｌ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ一７．５）　及２０　Ｌ　１Ｏ　ＳＤＳ，３７℃孵育３０　ｒａｉｎ，５２℃３０　ｍｉｎ，９５℃２　ｒａｉｎ。　１．５．２　ＤＮＡ纯化将２００　Ｌ　ＤＮＡ样本、２Ｏ　Ｌ　３Ｍ　ＮａＡＣ、　２５０“Ｌ异丙醇混匀，室温放置１　ｈ，１３　０００　ｒ／ｒａｉｎ离心１２　ｒａｉｎ，　去掉上清液；用无水乙醇洗涤２次；然后加入３５０　Ｌ无水乙　醇，稍混匀，１３　０００　ｒ／ｍｉｎ离心３　ｍｉｎ，弃上清液；晾干２～１Ｏ　ｍｉｎ，再加１５０　Ｌ　Ｔｒｉｓ，混匀后一２Ｏ℃冻存。　１．５．３　ＤＮＡ扩增扩增条件：反应体系２Ｏ“Ｌ，９５℃预变性５　垦际检验医学杂志２０１２年４月第３３卷第７期Ｉｎｔ　ＪｌａｂＭｅｄ，Ａｐｒｉｌ　２０１２，Ｖｏ１．３３，Ｎｏ．７　ｍｉｎ。循环参数：变性９５℃１　ｒｎｉｎ，退火４０℃１　ｍｉｎ，７２℃延伸　２　ｍｉｎ，４５个循环，末次循环后７２℃延伸７　ｍｉｎ。　１．５．４最佳引物筛选　将１Ｏ号菌分别用引物１、２、３、４、５、６　扩增及电泳筛选出最佳引物２。见图１。　１．５．５电泳将ＰＣＲ产物置１．２　琼脂糖凝胶电泳观察结　果，与ＤＮＡ标记物比较。其ＤＮＡ　ＰＣＲ扩增条带位置完全相　同，为同一基因型；主条带位置相同，副条带相差不大者为基因　型相似或密切相关；不满足上述条件者为不同的基因型。　１．５．６基因定型用引物２对１８株棒状杆菌进行基因分型。　２结　果　２．１　棒状杆菌的药敏试验　将分离的１８４株棒状杆菌对１２　种抗菌药物进行药敏试验，抗菌药物种类为８一内酰胺类抗菌药　物２种、头孢类１种、糖肽类１种、氨基糖苷类１种、四环素类２　种、喹诺酮类１种、大环内酯类１种、林可胺类１种、抗结核类１　种、恶唑酮类１种。见表２。　表２　１８４株棒状杆菌的耐药率结果比较［　（％）］　

抗菌药物　Ｓ　Ｉ　Ｒ　青霉素　头孢噻肟　亚胺培南　庆大霉素　红霉素　环丙沙星　多西环素　四环素　克林霉素　万古霉素　利福平　利奈唑烷　

４５（２４．５）　３３（１７．９）　１２７（６９．０）　１２６（６８．５）　１８（９．８）　２９（１　５．８）　７５（４０．８）　６９（３７．５）　１８（９．８）　１３９（７５．５）　１８４（１００．０）　１８４（１００．０）　８（４．３）　６（３．３）　８（４．３）　２０（１０．９）　３（１．６）　２７（１４．７）　２（１．１）　１（０．５）　４（２．２）　１４０（７６．１）　１４４（７８．３）　４９（２６．６）　３８（２０．７）　１　６６（９０．２）　１４２（７７．２）　８２（４４．６）　１１３（６１．４）　１６５（８９．７）　４１（２２．３）　

无数据；Ｓ：敏感；Ｉ：中介；Ｒ：耐药。　ｔａｐ　１∞　２５０　５００　

７ＳＯ　ｌ∞０　

ｉ　２Ｏ。。　

Ｍ　Ｉ　２　３　４　Ｓ　６　Ｍ　Ｍ：标记物；１～６：１０号菌株ＲＡＰＤ－ＰＣＲ扩增产物，对应引物序列　见表１中引物１～６。　图１　ＲＡＰＤ－ＰＣＲ方法学比较　

●■　

¨１　２　，４　Ｓ　●７　０●ｌｏ　ｕｌ２　Ｉ３１．１§１５　ｌ７　ｌ０　Ｍ　Ｍ：标记物；１～１８：１８株纹带棒状杆菌ＲＡＰＤ－ＰＣＲ扩增产物；１～　６、８～１３、１６～１７：Ａ型纹带棒状杆菌；７：Ｂ型纹带棒状杆菌；４：Ｃ型纹　带棒状杆菌；１５：Ｄ型纹带棒状杆菌；１８；Ｅ型纹带棒状杆菌。　图２　１８株纹带棒状杆菌ＲＡＰ【）ＩＰＣＲ电泳结果　

・　７８３　・　２．２基因分析及同源性分析　２．２．１方法学研究６对合成的随机引物进行ＤＮＡ扩增和　电泳，与其他引物比较，引物２的条带较多而且清晰，片段长度　２５０～３　０００　ｂｐ。见图１。　２．２．２　１８株纹带棒状杆菌基因分析　将１８株纹带棒状杆菌　进行基因分析，可分成５个类型：１、２、３、４、５、６、８、９、１０、１１、１２、　１３、１６、１７可归为Ａ型；７、１４、１５、１８分别为Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ型。见　图２。　３讨　论　棒状杆菌目前包括５９种（２个分类组），其中３６种与医学　相关。除白喉棒状杆菌外大多为条件致病菌，可引起人类组织　和血液感染＿６］。棒状杆菌引起的临床感染及耐药性常常被忽　视，而且因其菌属分类复杂，菌落形态多样，所需培养时间长短　不一，而多数细菌生长缓慢，超过一般实验室２４　ｈ培养时间而　经常被临床所忽视，出现漏报或不报情况，临床实际检出率应　该更高。棒状杆菌曾被认为是敏感菌，现在有越来越多的研究　表明，棒状杆菌对多种抗菌药物ＭＩＣ值有升高的趋势，棒状杆　菌的耐药基因的检出率也多有报道Ｅ　。　纹带棒状杆菌可引起伤口、呼吸道等多部位的感染，可通　过异体传播造成医院内感染［８　］。纹带棒状杆菌在棒状杆菌菌　种中占５６　，是明显的优势菌种ｌ＿】　。近两年来，该院纹带棒状　杆菌在临床的分离率越来越高，且集中在呼吸科和神经内科　病房。　老年人常患有多种基础疾病，组织器官功能退化，自身免　疫力较健康者低下，因此老年人常成为多种疾病的易感人群，　尤其是下呼吸道感染成为老年患者的常见病ｌ】　。本实验根据　国外Ｒｅａｄｙ－Ｔｏ—Ｇｏ试剂盒的６种引物序列，进行了方法学评价　试验，筛选出对纹带棒状杆菌最佳的引物序列，图１显示引物　２的条带多且较清晰明了，这也与有关文献报道一致［４］。因此　本组用引物２对ｌ８株纹带棒状杆菌ＲＡＰＩ）＿ＰＣＲ基因分析，发　现可分成５个类型，Ａ型菌株有１４株（７７．８　）。这１４株纹带　棒状杆菌中１、６、１６、１７号菌株来自同一病区，２、３、４、５、８、９、　１０、１１、１２、１３来自Ａ６病房，且同一病区不同病房问的菌株也　有同源性，表明Ａ型的纹带棒状杆菌在该院病房与病房、病区　与病区之间有传播。　目前，感染性疾病的患病率逐步上升，感染性病原体的种　类日益增加，以及抗菌药物的广泛使用，使微生物检验医师和　临床医师均面临更严峻的挑战＿】　。综上所述，临床棒状杆菌　感染越来越多，纹带棒状杆菌最常见，棒状杆菌对多种抗菌药　物的敏感性降低，多重耐药株在增加，该院存在棒状杆菌院内　相互传播的趋势，应该引起重视，采取积极措施防止棒状杆菌　的暴发流行。