小麦TaeEF1β基因的克隆、同源性及表达分析
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作物学报ACTA AGRONOMICA SINICA 2021, 47(8): 1417-1426 / ISSN 0496-3490; CN 11-1809/S; CODEN TSHPA9E-mail: zwxb301@DOI: 10.3724/SP.J.1006.2021.01071小麦lncRNA27195及其靶基因TaRTS克隆及表达分析王娜1,2,**白建芳2,**马有志1郭昊宇2王永波2陈兆波2赵昌平2,*张立平2,*1中国农业科学院作物科学研究所, 北京 100087; 2北京市农林科学院北京杂交小麦工程技术研究中心 / 杂交小麦分子遗传北京市重点实验室, 北京 100097摘要: 长链非编码RNA (long non-coding RNA, lncRNA)是一种大于200 bp的非编码RNA, 大量存在于植物体中,其可通过调节基因表达或蛋白功能, 在植物生长发育与胁迫应答中发挥重要作用。
前期在研究光照和温度对小麦光温敏核雄性不育系BS366育性诱导中, 利用转录组测序筛选获得与育性相关的lncRNA (lncRNA2719)。
为研究小麦lncRNA27195的功能, 本研究在BS366中克隆lncRNA27195及其靶基因TaRTS, 并对TaRTS进行生物信息学分析, 结果显示, TaRTS基因全长315 bp, 编码104个氨基酸, 且发现该RTS蛋白仅存在于禾本科植物中。
通过实时荧光定量PCR, 对lncRNA27195及TaRTS基因在不同组织不同光温处理及茉莉酸甲酯处理下进行表达模式分析, 发现lncRNA27195和TaRTS均在雄蕊中高表达, 呈显著的正相关, 且两者在不同光温条件下呈现出不同的表达模式。
光照和温度均对lncRNA27195和TaRTS有调控作用, 适当浓度的MeJA促进两者的表达, SA抑制两者表达。
以上结果表明, 在光周期、温度和植物激素的诱导下, lncRNA27195正向调节TaRTS基因表达, 进而影响花粉育性, 本研究结果有助于促进对小麦光温敏核型雄性不育系的机理研究和生产应用。
冬小麦膨胀素基因TaEXPB8、TaEXPB10的克隆及低温表达分析王明晶;王晓磊;徐永清;李凤兰;王旭;彭丽娜;李飞;董佳敏;张俊峰【摘要】以冬小麦强抗寒品种东农冬麦1号为试验材料,从其根中克隆膨胀素基因TaEXPB8、TaEX-PB10,并分析其在低温条件下的表达情况,为研究膨胀素基因与植物抗寒性之间的关系奠定基础.结果表明,在冬小麦强抗寒品种东农冬麦1号根中克隆得到膨胀素基因TaEXPB8、TaEXPB10,二者分别编码273、271个氨基酸,二者序列与GenBank上公布的序列同源性分别达到99.2%、99.6%.4℃、-10℃和-20℃的低温胁迫处理均可诱导TaEXPB8、TaEXPB10基因在冬小麦强抗寒品种东农冬麦1号根中表达,尤其是TaEXPB10基因,其受诱导程度高于TaEXPB8;两基因在低抗寒品种济麦22号中总体上不受诱导,甚至受到抑制.综合比较发现,4℃、-10℃和-20℃低温胁迫下,TaEXPB8、TaEXPB10基因在强抗寒品种东农冬麦1号中的表达量均明显高于低抗寒品种济麦22号.据此推测膨胀素基因TaEXPB8、TaEXPB10与冬小麦根系的低温胁迫耐受能力具有重要的相关性,有助于进一步深入了解冬小麦根系的抗寒机制.%The cold-resistant winter wheat variety Dongnongdongmai No. 1 was used as experimental ma-terial. The expansin genes TaEXPB8 and TaEXPB10 were cloned from its roots,and their expression pro-files were analyzed under low temperature conditions,so as to lay a foundation for study of the relationship between expansin genes expression and the plant cold resistance. The results showed that the expansin genes TaEXPB8 and TaEXPB10 were cloned from cold-resistant winter wheat variety Dongnongdongmai No. 1,which coded 273 and 271 amino acids,respectively. In addition,they shared 99. 2% and99. 6%homology separately with the published sequence in GenBank. Besides,4 ℃,-10 ℃ and -20 ℃ could induce the expression of TaEXPB8 and TaEXPB10 in roots of Dongnongdongmai No. 1. Especially for TaEXPB10,it had higher inducing level than TaEXPB8. However,these two genes were not induced in Ji-mai No. 22 ( cold susceptible variety) on a whole,even were suppressed. Taken together,we found that under 4 ℃,-10 ℃ and -20 ℃,the expression level of TaEXPB8 and TaEXPB10 in Dongnongdongmai No. 1 (cold resistant variety) were all significantly higher than that in Jimai No. 22(cold susceptible vari-ety) . Thus,it had been postulated that the expansin genes TaEXPB8 and TaEXPB10 had great relevance with low temperature stress tolerance ability of the roots of Dongnongdongmai No.1. It also provided fur-ther understanding on the cold resistance mechanism in winter wheat root system.【期刊名称】《河南农业科学》【年(卷),期】2017(046)002【总页数】6页(P6-11)【关键词】冬小麦;膨胀素;低温处理;表达分析【作者】王明晶;王晓磊;徐永清;李凤兰;王旭;彭丽娜;李飞;董佳敏;张俊峰【作者单位】东北农业大学生命科学学院,黑龙江哈尔滨150030;哈尔滨学院,黑龙江哈尔滨150086;东北农业大学生命科学学院,黑龙江哈尔滨150030;东北农业大学生命科学学院,黑龙江哈尔滨150030;东北农业大学生命科学学院,黑龙江哈尔滨150030;东北农业大学生命科学学院,黑龙江哈尔滨150030;东北农业大学生命科学学院,黑龙江哈尔滨150030;东北农业大学生命科学学院,黑龙江哈尔滨150030;东北农业大学生命科学学院,黑龙江哈尔滨150030【正文语种】中文【中图分类】S512小麦是我国重要的粮食作物,可分为春小麦和冬小麦,我国以冬小麦的种植为主[1]。
·13·收稿日期:2022-05-30基金项目:国家自然科学基金项目(31860380,32160442);贵州省科技计划项目(黔科合平台人才〔2018〕5781号)通讯作者:张素勤(1974-),https:///0000-0001-9129-4937,教授,主要从事麦类作物遗传育种研究工作,E-mail :zsqin************第一作者:石鹿溪(1998-),https:///0000-0003-1060-0782,研究方向为小麦遗传育种,E-mail :*****************耐盐小偃麦乙烯受体基因TtETR1克隆及表达特性分析石鹿溪1,田怀志1,熊兴伟1,穆远航1,张菊1,何方1,2,张庆勤1,张素勤1,2*(1贵州大学农学院,贵州贵阳550025;2国家小麦改良中心贵州分中心,贵州贵阳550025)摘要:【目的】克隆耐盐小偃麦的乙烯受体基因TtETR1,并进行表达特性分析,为TtETR1基因的功能分析和小麦耐盐遗传育种提供理论参考。
【方法】以耐盐八倍体小偃麦为材料,根据小偃麦转录组数据筛选盐胁迫响应关键基因TtETR1,利用同源克隆技术获得其cDNA 序列,利用生物信息学软件进行分析,并通过实时荧光定量PCR (qRT-PCR )检测其在盐胁迫下的表达特性。
【结果】TtETR1基因的开放阅读框(ORF )长度为2310bp ,编码769个氨基酸残基,其上游2000bp 启动子包含茉莉酸甲酯与脱落酸信号响应、干旱和厌氧诱导、分生组织表达等作用元件。
TtETR1蛋白分子质量为85.76kD ,理论等电点(pI )为6.22,为含跨膜结构的分泌型蛋白,定位于细胞质膜上,二级结构主要由α-螺旋和无规卷曲构成,含有REC_ETR-like 、HATPase_ETR2_ERS2-EIN4-like 、cGMP 磷酸二酯酶-腺苷酸环化酶-FhlA (GAF )、组氨酸激酶(HisKA )等结构域,具有丝氨酸为主、苏氨酸为辅的乙烯信号转导进行磷酸化修饰与调控的位点。
沉默的小麦1By高分子量谷蛋白亚基的分子克隆的开题报
告
一、研究背景和意义
小麦是世界上主要的粮食作物之一,但是小麦过敏症在全球范围内也越来越严重,其中大部分过敏反应是由小麦谷蛋白引起的。
小麦谷蛋白是小麦籽粒中最主要的蛋白质,由若干个不同的组分组成。
其中,高分子量谷蛋白亚基是导致小麦过敏的主要成
分之一。
因此,了解高分子量谷蛋白亚基的分子结构和功能具有重要的理论意义和实
际意义。
二、研究目的
本研究旨在利用分子生物学技术对小麦高分子量谷蛋白亚基的分子结构进行克隆和分析,以期深入探究小麦过敏的发病机制,为解决小麦过敏问题提供科学依据。
三、研究内容和方法
1.收集小麦籽粒中高分子量谷蛋白亚基的基本信息和已有研究结果,明确研究方向和重点。
2.采用PCR技术从小麦基因组DNA中扩增高分子量谷蛋白亚基的编码序列,并
进行序列分析、比对和预测蛋白质结构。
3.将克隆得到的编码序列构建表达载体,利用大肠杆菌表达系统对高分子量谷蛋白亚基进行表达和纯化。
4.利用蛋白质生化分析技术对纯化后的高分子量谷蛋白亚基进行分析,并研究其生物学功能和作用机制。
四、预期结果和意义
通过本研究的开展,预计可以获得小麦高分子量谷蛋白亚基的完整编码序列和蛋白质结构信息,深入理解高分子量谷蛋白亚基在小麦过敏中的作用机制,并且有望为
未来解决小麦过敏问题提供科学支撑和理论指导。
小麦TaBS1转录因子基因的克隆、原核表达及Western blot检测小麦TaBS1转录因子基因的克隆、原核表达及Western blot检测摘要本文报道了一种小麦(Triticum aestivum L.)调控生长和抗逆性的转录因子TaBS1的克隆、原核表达和Western blot检测的方法,TaBS1被认为是一种ABA受体蛋白,其对水分胁迫的反应有重要的生物学意义。
采用RT-PCR技术,TaBS1编码序列被克隆并进行序列验证,随后将TaBS1序列直接克隆到pET30b(+)表达载体,在蓝细胞中表达出具有抗菌活性的TaBS1蛋白。
此外,TaBS1在水分胁迫条件下的表达水平得到了检验,通过Western blot实验证实,在降低水分时,TaBS1的表达水平显著增加。
本研究首次报道了这种小麦调控生长和抗逆性的转录因子的克隆、原核表达及Western blot检测的方法,这也为进一步探究TaBS1的生物学功能提供了重要的技术支持。
Introduction小麦(Triticum aestivum L)是一种重要的谷物作物,其发展及生长受水分胁迫影响。
ABF(ABA-related protein family)蛋白是一类ABAA-dependent receptor-like protein,是水分胁迫反应的关键性调节因子。
其中,TaBS1是一种ABF类蛋白,在小麦中起到调控生长和抗逆性的作用。
虽然TaBS1在水分胁迫条件下的表达有着重要的生物学意义,但是尚未有关于小麦TaBS1转录因子克隆、原核表达及Western blot检测的方法的报道。
Materials & Methods1. TaBS1 cDNA克隆采用实时PCR技术,从小麦中分离出TaBS1,序列信息并上传到NCBI数据库。
2. 原核表达使用引物5'-AAT TGC ACC TTA ATA GAT AAA GTC GGA-3'、5'-TTA GAA CTC CTA CCA ATG CCT GAG CAT-3'设计TaBS1引物,将TaBS1编码序列直接克隆到pET30b(+)表达载体中,以LB + Kanamycin (25ug/ml)培养蓝细胞表达TaBS1蛋白,经SDS-PAGE检测,TaBS1被正确表达,此外,TaBS1表达蛋白还具有抗菌活性。
拟南芥抗逆相关泛素连接酶SINA2的调控分析及小麦SINA同源基因的克隆干旱、盐、极端温度等非生物胁迫严重影响植物的生长和发育。
植物在长期的进化过程中形成了复杂而精准的信号网络,可以感知外界信号并做出响应。
在非生物胁迫下,植物可以调控胁迫相关基因的表达,从而提高植物的抗性。
探究植物胁迫响应机制对于提高植物抗性具有十分重要的作用。
植物泛素连接酶参与了多种信号传导途径。
SEVEN IN ABSENTIA(SINA)首次在果蝇中被发现,参与果蝇眼睛的形成。
SINA是一类含有RING保守域的泛素连接酶,RING保守域对于SINA的泛素连接酶活性具有决定性作用。
拟南芥中共发现18个SINA-like蛋白,其中SINA2不含有该家族其它成员共有的RING保守域。
本研究以拟南芥为研究材料,探究SINA2在非生物胁迫条件下的响应;通过原核表达系统获得His-SINA2融合蛋白,该蛋白在体外具有泛素连接酶活性;通过酵母双杂交系统筛库,获得SINA2的互作蛋白CDKG1,进一步研究SINA2与CDKG1之间的关系;分析CDKG1在非生物胁迫下的响应及其功能;研究同时克隆了小麦SINA同源基因TaSINA1,分析其进化关系及表达特性。
主要得到以下结果:1、氨基酸序列比对发现SINA2在N端缺失RING保守域,而含有一个不完全保守的B-box2保守域;进化树分析发现SINA2与其它SINA蛋白的亲缘关系较远,其通过原核表达系统获得His-SINA2融合蛋白;His-SINA2在体外可以催化自身泛素化,对于UbcH5a具有特异性。
2、SINA2定位在细胞核和细胞质中;在各个器官中均有表达,在花和果荚中的转录水平最高;SINA2在干旱、盐胁迫和ABA处理下的转录水平均有提高;sina2突变体对干旱、盐胁迫和ABA处理十分敏感,发芽率和子叶展开率均明显低于野生型。
3、通过酵母双杂交筛库获得SINA2的互作蛋白CDKG1;通过原核表达系统获得MBP-CDKG1,在体外SINA2可以与MBP-CDKG1结合;将表达YFPN-SINA2和YFPC-CDKG1融合蛋白的载体通过农杆菌注射法转化烟草叶片表皮细胞,在细胞核中发现黄色荧光信号。
小麦胁迫响应转录因子基因TaSNAC1的克隆与表达分析::,,.农业生物技术学报豳雕商厂嘲田■,::./..?...研究报告的克隆与表达分析小麦胁迫响应转录因子基因嬲单丽伟宋鹏刘夏燕张超卫晓彬韩兆雪郭蔼光范三红’旱区作物逆境生物学国家重点实验室,两北农林科技大学生命科学学院,杨凌通讯作者,加.摘要胁迫响应转录因子参与植物非生物胁迫过程,过表达水稻唧口西∞.可显著提高植株耐旱、耐冷和抗盐性。
本研究同源克隆了小麦‰“础砌“仇扎,基因登录号.,分析了其表达产物的亚细胞定位,并利用实时定量.分析了其在不同组织、和胁迫下的表达。
该基因包含一个内含子,编码个氨基酸残基的蛋白产物。
与其他禾本科植物蛋白高度相似,其与大麦『如口“函眦、二穗短柄草曰Ⅱ印。
以如∞、水稻、玉米磊口”和高粱.嘞“拓,序列相似性依次为.%、.%、引.%、.%和.%。
可能以二聚体形式存在,包含核定位信号和典型的结构域,位的“、Ⅳ.”核心基序处于一段折叠中,其弯曲产生的凹面可能直接参与结合。
瞬时转化拟南芥似曲幽如以叶肉细胞原生质体的实验表明,特异定位于细胞核中。
盐胁迫条件卜.,叶和根中删的表达量均升高,且表达模式相似,但根中响应更显著;胁迫下,根中瑚对胁迫的响应较快且幅度较大,而叶中响应较慢且幅度较小。
研究结果提示,蹦参与小麦的非生物胁迫响应过程,在耐早、抗盐遗传改良中具有潜在应用价值。
关键词小麦,蹦』,亚细胞定位,非生物胁迫,表达模式仃? 邱死. 』? ?一‘诅骶“, 曲仃黔, ,.℃’胁. 仃 . 船们嘶曲, 饥,乜仔西曲. ,‘陀~ ;Ⅱ础幻“鼢.舀 , ..笛. ,.死『』, %,.%,.%,.%基金项日:中央高校基本科研业务费专项.和围家转基冈号项.?收稿日期:.一接受口期:..万方数据篙篙盖慧四眦咖。
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盱踟.%毋谢山舶砘啪口“冶∽,眺埘印击啪如妞枷站,,屁口,瑚筘曲啪啦“ ,.、Ⅳ廿行舶鹊】湖∞仃‰,.订.?,啦加舶蛐帅叩缸.”①.”鹳自舐。
作物学报ACTA AGRONOMICA SINICA 2010, 36(12): 2091−2098/zwxb/ ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9E-mail: xbzw@DOI: 10.3724/SP.J.1006.2010.02091含CBS结构域的小麦TaCDCP1基因的克隆及其表达分析王晓敏1冯浩1孙燕飞1刘博1王晓杰1徐亮胜1于秀梅1魏国荣1黄丽丽1康振生1,2,*1 西北农林科技大学植物保护学院, 陕西杨凌 712100;2 西北农林科技大学 / 陕西省农业分子生物学重点实验室, 陕西杨凌 712100 摘要: 利用电子克隆和RT-PCR技术, 在本实验室前期构建的非亲和互作的SSH文库基础上, 从条锈菌侵染的小麦水原11叶片中首次分离出一个含CBS结构域蛋白的基因, 暂命名为TaCDCP1 (Triticum aestivum CBS domain containing protein 1)。
TaCDCP1包含一个完整的654 bp的开放阅读框, 编码217个氨基酸。
推测该基因拟编码的蛋白具有2个CBS保守结构域, 不含跨膜区且无信号肽, 定位在叶绿体基质内; 经过同源比对, 小麦TaCDCP1氨基酸序列与大麦、水稻和玉米等的同源序列的相似性较高; 该基因表达量在小麦叶中显著高于在根和茎中; 在小麦与条锈菌的非亲和、亲和组合中, TaCDCP1基因均受到条锈菌诱导, 分别在接种后18 h和96 h达到表达高峰, 非亲和组合表达量在侵染前期(接种后18~48 h)高于亲和组合, 而在侵染后期(接种后96~120 h)低于亲和组合; 外源植物激素脱落酸诱导该基因上调表达, 苄基腺嘌呤, 乙烯, 赤霉素, 茉莉酸甲酯和水杨酸处理后其表达量在不同程度上受到抑制; TaCDCP1在低温和干旱条件下表达量上升, 在机械伤害和高盐处理下表达量无明显差异。
表明TaCDCP1可能通过脱落酸等信号途径参与小麦对条锈菌的防御反应, 同时参与低温和干旱环境下的信号转导途径。
小麦ArfGAP基因的克隆、半定量RT-PCR分析及原核表达本文将介绍小麦ArfGAP基因的克隆、半定量RT-PCR分析及原核表达。
我们首先选取小麦(Triticum aestivum L.)材料,并对其进行全基因组DNA测序,经过BLAST分析,从中获得小麦ArfGAP基因的cDNA序列。
基于半定量RT-PCR分析,确定小麦ArfGAP基因的mRNA表达水平及其在小麦组织中的分布情况。
此外,针对获取的小麦ArfGAP基因序列,我们采用原核表达技术,将其表达在大肠杆菌中,经过SDS-PAGE电泳及Western blot分析,验证其表达情况。
最后,为进一步研究小麦ArfGAP基因的功能,我们以小麦米粒为原料,进行分子抑制实验。
通过本研究,我们获得了小麦ArfGAP基因的cDNA序列,并进行了半定量RT-PCR分析、原核表达和分子抑制实验,为研究小麦ArfGAP基因的功能提供了重要的基础。
围绕小麦ArfGAP基因的功能,我们考察了该基因在植物发育和生态过程中的作用机制。
首先通过qRT-PCR分析,确定在不同米粒发育时期小麦ArfGAP基因mRNA水平变化,结果显示该基因在米粒成熟期受抑制较多,而在初抽芽期受激活较多。
此外,我们进行的转录组表达分析也表明,该基因与植物环境适应性、光合作用、生长和发育相关的基因有关联。
最后,通过分子抑制实验,我们证实了ArfGAP基因的靶向抑制可以抑制小麦的生长发育,但不能够完全抑制它们的发育。
我们的研究为小麦ArfGAP基因及其在生态过程中的作用机制提供了重要的原始数据,这将有助于我们进一步研究小麦ArfGAP基因的功能,根据遗传信息调节植物的生长和发育。
小麦ArfGAP基因可以作为一种潜在的育种分子标记,帮助鉴定小麦品质相关基因。
此外,我们还通过对比不同品种的小麦ArfGAP基因序列差异,能够有效地发现和鉴定存在的遗传多态性。
在未来的研究中,我们将针对小麦ArfGAP基因所涉及的生物学过程,处理小麦重要性状如产量、品质和抗病性,并通过对该基因的功能分析,对小麦改良有重要意义。
小麦TaMICU1-6A基因的克隆、生物信息学及表达分析李欣;李鲁华;任明见;安畅;洪鼎立;赵鹏鹏;徐如宏【期刊名称】《江苏农业科学》【年(卷),期】2024(52)5【摘要】为了探讨线粒体稳态调节蛋白TaMICU1基因在小麦生长发育中的功能,以小麦中国春为材料,对其TaMICU1-6A基因进行克隆、生物信息学分析、表达分析研究,结果表明,小麦TaMICU1-6A基因全长为1 398 bp,编码465个氨基酸,定位于线粒体,具有2个EF-hand家族的保守结构域,启动子含3种激素响应元件、3种光响应相关反应元件、1个缺氧特异性诱导相关元件;多重序列比对发现,其与野生二粒小麦、乌拉尔图小麦、小麦中的同源蛋白或同源基因的亲缘关系比较近。
RT-PCR结果表明,TaMICU1-6A基因具有组织特异性,不同非生物胁迫、不同激素处理下在根、茎、叶中的表达水平不同。
黑暗处理下,TaMICU1-6A基因在根、茎、叶中的表达水平均在6 h时达到最低;低温处理下,TaMICU1-6A基因在根、茎中的表达水平呈先降后升的趋势;在赤霉素处理下,TaMICU1-6A基因在叶片中的表达水平在6 h时达到最高。
综上所述,推测TaMICU1-6A基因通过激素介导的信号途径参与不同的非生物胁迫。
期待本研究结果可为进一步探讨小麦TaMICU1基因在逆境下的生物学功能提供一定的参考价值。
【总页数】10页(P42-51)【作者】李欣;李鲁华;任明见;安畅;洪鼎立;赵鹏鹏;徐如宏【作者单位】贵州大学农学院;国家小麦改良中心贵阳分中心【正文语种】中文【中图分类】Q78;S512.101【相关文献】1.小麦胁迫相关基因TaLEA2的克隆、生物信息学及表达特性分析2.小麦TaWRKY71a基因克隆、生物信息学及表达分析3.小麦TaZFP33基因克隆、生物信息学分析、亚细胞定位与表达分析4.小麦丙氨酸-乙醛酸转氨酶基因(TaAGT2)的克隆、生物信息学预测及表达分析5.小麦Ta-UBX1基因克隆、表达及生物信息学分析因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。
小麦TaBS1转录因子基因的克隆、原核表达及Western blot检
测的报告,600字
本报告为小麦TaBS1转录因子的克隆、原核表达及Western blot检测的实验结果报告,根据该作物特点选用了相应的方法
进行检测。
首先对小麦TaBS1转录因子进行克隆,使用的克隆方法是PCR,首先以Genebank上的序列为模板,设计出适合进行PCR的引物,然后进行PCR反应,添加内切酶和外切酶分别
生成了转录因子TaBS1的cDNA序列,并将其克隆至T末端
接头质粒。
接着进行原核表达,采用大肠杆菌进行表达,利用IPTG诱导,将克隆好的转录因子TaBS1质粒转化给大肠杆菌,继而获得
胞外表达量高的表达株系,并在胞质中鉴定出该转录因子,进行细胞毒性试验后将其得到的融合蛋白用于Western blot检测。
最后进行Western blot检测,先将融合蛋白细胞悬液经过离心,获得蛋白质提取液,通过检测蛋白质浓度,确定每组液体的含量,然后将蛋白质放入Western blot的孔板,将它们迁移至膜,在膜上进行免疫荧光定位,最终获得正常的定位图。
通过本次实验,我们确定了转录因子TaBS1的克隆、原核表
达及Western blot检测数据,其结果表明转录因子TaBS1可以
正常进行克隆、表达及Western blot检测,可以用于鉴定小麦TaBS1转录因子的序列、结构与功能。
TcLr35小麦中病程相关蛋白1基因的克隆及分析王海燕;刘大群;杨文香;李亚宁;张娜;高倩【期刊名称】《植物遗传资源学报》【年(卷),期】2007(8)1【摘要】根据已发表的植物病程相关蛋白1基因设计引物,利用RT-PCR技术,从被小麦叶锈菌诱导的小麦抗叶锈病基因近等基因系材料TcLr35中获得一个病程相关蛋白1基因cDNA片段,长度为489bp,3′端包含21个poly(A),暂命名为PR12。
利用5′RACE技术获得了818bp的PR12全长,该基因包含495bp的开放读码框,147bp的5′非翻译区(non translated region,NTR),155bp的3′非翻译区和21bp的多聚腺苷酸尾。
编码164个通读的蛋白质氨基酸序列,基因产物具有植物防御体系中病程相关蛋白SCP保守结构域,与GenBank中多个植物病程相关蛋白1基因具有较高的同源性。
Southern杂交显示,该基因在小麦基因组中为单拷贝。
【总页数】6页(P16-20)【关键词】小麦抗叶锈病基因;病程相关蛋白;防卫反应基因;cDNA末端快速扩增【作者】王海燕;刘大群;杨文香;李亚宁;张娜;高倩【作者单位】河北农业大学植物保护学院/河北省农作物病虫害生物防治工程技术研究中心【正文语种】中文【中图分类】Q516【相关文献】1.TcLr35小麦β(1,3;1,4)葡聚糖苷酶基因cDNA全长的克隆及分析 [J], 王海燕;刘大群;杨文香;李在峰;张立荣;李星2.TcLr35小麦中抗病相关基因S2A2的抗叶锈性分析 [J], 张艳俊;张家瑞;栗小英;王海燕;刘大群3.条锈菌诱导的小麦病程相关蛋白TaPR10基因的克隆及特征分析 [J], 张岗;李依民;张毅;董艳玲;王晓杰;魏国荣;黄丽丽;康振生4.TcLr35小麦中抗病基因同源序列的克隆及分析 [J], 梁丽然;王海燕;刘大群5.小麦病程相关蛋白1基因的克隆及特征分析 [J], 于玲;牛吉山;马正强;李新燕;陈佩度;刘大钧因版权原因,仅展示原文概要,查看原文内容请购买。
浙江农业学报ActaAgriculturaeZhejiangensisꎬ2019ꎬ31(1):98-103http://www.zjnyxb.cn陈炫ꎬ张天烨ꎬ羊健ꎬ等.小麦TaeEF1β基因的克隆、同源性及表达分析[J].浙江农业学报ꎬ2019ꎬ31(1):98-103.
DOI:103969/j.issn.1004 ̄152420190113
收稿日期:2018 ̄03 ̄25基金项目:国家自然科学基金(3150160)ꎻ国家农业产业体系(CARS ̄3 ̄1)ꎻ国家小麦转基因专项(2016ZX08002001)作者简介:陈炫(1992—)ꎬ女ꎬ陕西咸阳人ꎬ硕士研究生ꎬ主要从事植物病理学研究ꎮE ̄mail:vivianccx@163.com∗通信作者ꎬ陈剑平ꎬE ̄mail:jpchen2001@126.com
小麦TaeEF1β基因的克隆、同源性及表达分析陈 炫1ꎬ张天烨1ꎬ羊 健2ꎬ张恒木2ꎬ陈剑平2ꎬ∗(1.浙江农林大学林业与生物技术学院ꎬ浙江杭州311300ꎻ2.浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所ꎬ浙江杭州310021)
摘 要:真核翻译延伸因子(eukaryotictranslationelongationfactorꎬeEFs)是一种重要的多功能调控蛋白ꎬeEF1β是eEF1的组成部分ꎬ在蛋白质生物合成过程中发挥着重要的作用ꎮ本文通过RT ̄PCR扩增克隆小麦
(TriticumaestivumL.)的eEF1β基因ꎬ并命名为TaeEF1βꎮ氨基酸同源性分析发现ꎬTaeEF1β具有高度保守
性ꎬ且其保守结构域位于137~226aa处ꎮqRT ̄PCR结果表明ꎬ中国小麦花叶病毒(Chinesewheatmosaicvi ̄rusꎬCWMV)侵染小麦植株后ꎬ可以诱导TaeEF1β基因转录水平的上调表达ꎮ另外ꎬ本文也进一步分析了
TaeEF1β基因在小麦根、茎、叶的表达水平和CWMV侵染不同时间点的表达情况ꎮ关键词:真核翻译延伸因子ꎻ中国小麦花叶病毒ꎻ同源性分析中图分类号:S43512文献标志码:A文章编号:1004 ̄1524(2019)01 ̄0098 ̄06
GenecloningꎬhomologyandexpressionanalysisofTaeEF1βinTriticumaestivumL.CHENXuan1ꎬZHANGTianye1ꎬYANGJian2ꎬZHANGHengmu2ꎬCHENJianping2ꎬ∗
(1.CollegeofForestryandBiotechnologyꎬZhejiangA&FUniversityꎬHangzhou311300ꎬChinaꎻ2.InstituteofVirolo ̄gyandBiotechnologyꎬZhejiangAcademyofAgriculturalSciencesꎬHangzhou310021ꎬChina)Abstract:Eukaryotictranslationelongationfactor(eEFs)isanimportantmultifunctionalprotein.eEF1βwassub ̄unitoftheeukaryotictranslationelongationfactor ̄1(eEFs ̄1)complexandplayedanimportantroleinproteinbio ̄synthesis.TheeEF1βgenewasobtainedbycloningwithRT ̄PCRfromwheatandnamedasTaeEF1β.TheaminoacidsequencesofTaeEF1βwerehighlyconservedandtheconserveddomainwaslocatedin137 ̄226aa.TheresultsofqRT ̄PCRshowedthatTaeEF1βwereup ̄regulatedintheCWMV ̄infectedplants.InthisstudyꎬtheexpressionofTaeEF1βinthestemsꎬleavesandrootsofwheatanddifferentstagesofCWMVinfectionwasalsodetectedbyqRT ̄PCR.Keywords:eukaryotictranslationelongationfactorꎻChinesewheatmosaicvirusꎻhomologyanalysis
真核翻译延伸因子(eukaryotictranslatione ̄longationfactorꎬeEFs)最早作为一个对噬菌体Qβ的依赖于RNA的RNA聚合酶(RNA ̄dependentRNApolymeraseꎬRdRp)活性具有重要作用的辅助因子被发现并鉴定[1]ꎮ在真核细胞中包括3类延伸因子ꎬ分别为eEF1α(eukaryotictranslationelongationfactor1α)、eEF1β和eEF2[2]ꎮEF1β在
真核生物中的结构比在细菌中更复杂ꎬ该蛋白由EF1β ̄alpha、EF1β ̄gamma和EF1β ̄beta三个亚基
组成ꎮ在蛋白质的合成过程中ꎬeEF1β主要作为EF家族的一种核苷酸交换因子ꎬ催化不活跃的eEF1αGDP重新变成具有活性的eEF1αGTP[3]ꎮ 近年来ꎬ越来越多的证据表明ꎬeEFs作为蛋白分子伴侣和RNA/actin结合蛋白参与病毒的转录、翻译、组装及其致病机理的过程[4-9]ꎮ已经报道的有eEF1α在番茄花叶病毒(Tomatomo ̄saicvirusꎬToMV)[10]和番茄丛矮病毒(TomatobushystuntvirusꎬTBSV)[11]中促进病毒复制复合体的形成ꎻ在人类免疫缺陷病毒1型(HIV ̄1)病毒中促进病毒粒子的组装[19]ꎻ在乙型肝炎病毒(hep ̄atitisBvirusꎬHBV)中作为X蛋白的分子伴侣[12]ꎻeEF1β与烟草花叶病毒(TobaccomosaicvirusꎬTMV)的RdRp互作影响其病毒的复制[13]等ꎮ中国小麦花叶病毒(Chinesewheatmosaicvi ̄rusꎬCWMV)是本实验室于20世纪末在我国山东冬小麦上鉴定的一种由禾谷多黏菌(Polymyxagraminis)传播的病毒[14]ꎮCWMV为单链正义RNA病毒(positive ̄sensesingle ̄strandedRNAvi ̄rusꎬ(+)ssRNAvirus)ꎬ包含两条基因组分别命名为RNA1和RNA2ꎮRNA1含有3个开放阅读框(openreadingframeꎬORF)ꎬ其中ORF1编码一个149~153ku的多肽ꎬ其UGA终止密码子能以一定比例通读(readthroughꎬRT)而使开放阅读框延伸至ORF2ꎬ产生一个RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)ꎮORF3编码一个36~37ku的运动蛋白(movementproteinꎬMP)[15]ꎮRNA2含有3个ORFꎬ分别编码19ku的CP蛋白、84ku的外壳蛋白基因通读区(CP ̄RT)蛋白、25ku的蛋白质(N ̄CP)和18~19ku的沉默抑制子蛋白[16]ꎮ前期本实验室通过蛋白质组学分析发现ꎬCWMV侵染小麦初期能够诱导TaeEF1β在蛋白质水平的上调表达(数据待发表)ꎬ据此ꎬ推测TaeEF1β可能通过某种途径参与病毒侵染寄主植物的过程ꎮ本研究首先用RT ̄PCR从小麦(Triticumaes ̄tivumL.)中克隆TaeEF1β基因ꎬ并对其进行生物信息学分析ꎬ并采用qRT ̄PCR分析TaeEF1β在小麦根、茎、叶等不同组织部位和CWMV不同侵染时期的转录表达水平ꎬ为进一步研究TaeEF1β对CWMV的影响机制提供依据ꎮ1 材料与方法1.1 材料本实验所用小麦烟农22由山东省烟台市农业科学研究院提供ꎬ并由本实验室于温室内培养ꎮ大肠埃希菌(Escherichiacoil)感受态细胞Trans5α购于北京全式金生物技术有限公司ꎻ基
因克隆所使用的反转录试剂盒FirstStrandcDNASynthesisKit购于TOYOBO公司ꎻExTaq酶购于
TaKaRa公司ꎻ限制性内切酶购于NewEnglandBiolabs(NEB)公司ꎻ实时荧光定量PCR(quantita ̄tivereal ̄timePCRꎬqRT ̄PCR)所用的反转录试剂
盒HiScriptQRTSuperMixforqPCR与ChamQU ̄niversalSYBRqPCRMasterMix购于南京诺唯赞
生物科技公司ꎻ凝胶回收GeneJETGelExtractionKit购于ThermoScientific公司ꎻ引物由杭州擎科
梓熙生物技术有限公司合成ꎮ1.2 总RNA的提取及cDNA合成
总RNA的提取:取健康小麦叶片075gꎬ使用液氮进行研磨后装入15mLRNasefreeEP管(以下步骤均使用RNasefreeEP管)ꎻ按照1g
mL-1
的量加入750μLTRIzolꎬ涡旋振荡混匀后于
4℃ꎬ14000rmin-1ꎬ离心10minꎻ小心吸取上清
到新的EP管中ꎬ按每1mLTRIzol加入200μL氯仿ꎬ涡旋振荡混匀后于室温静置10minꎬ4℃ꎬ14000rmin-1ꎬ离心10minꎻ吸取上清无色水相ꎬ
按每1mLTRIzol加入600μL异戊醇ꎬ涡旋振荡混匀后于室温静置10minꎬ4℃ꎬ14000rmin-1ꎬ
离心10minꎻ弃上清后ꎬ用预冷的无水乙醇悬浮沉淀(RNA)后于4℃ꎬ14000rmin-1ꎬ离心
10min(重复该步骤一次)ꎻ对RNA进行微干燥
后ꎬ使用30~50μLDEPC水进行溶解ꎬ用RNA琼脂糖凝胶电泳和NanoDropOne对RNA的完整性、浓度和纯度进行检测ꎬ于-80℃保存ꎮcDNA合成:取总RNA1μgꎬ以随机引物为
反转录引物ꎬ采用FirstStrandcDNASynthesisKit进行反转录ꎬ反应液配置及反应体系参照试剂盒说明书ꎬ进行反转录获得小麦cDNAꎬ以01×cD ̄NA为PCR扩增模板ꎮ
1.3 qRT ̄PCR
根据NCBI数据库中小麦eEF1β序列(登录号:AK3325291)ꎬ设计小麦基因TaeEF1β的PCR引物(表1)ꎮ使用诺唯赞公司的SYBR在荧
光定量仪PCR ̄7900(ABI)上进行qRT ̄PCR反应ꎬ
99陈炫ꎬ等.小麦TaeEF1β基因的克隆、同源性及表达分析