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产超广谱b内酰胺酶大肠埃希菌是一种引起肠道感染的细菌，它能够产生一种名为产超广谱b内酰胺酶的酶，使得其对抗常用的β内酰胺类抗生素产生耐药性。
在临床诊断中，准确地检测产超广谱b内酰胺酶大肠埃希菌对于及时进行有效的治疗至关重要。
建立明确的诊断标准对于控制此类细菌感染具有重要意义。
下面将从不同角度讨论产超广谱b内酰胺酶大肠埃希菌的诊断标准。
一、临床症状与体征1.1 腹泻产超广谱b内酰胺酶大肠埃希菌感染的患者主要表现为腹泻症状，轻者为腹痛、腹胀，严重者可伴随腹泻、脓血便甚至休克。
1.2 发热患者可能伴有体温升高，并且持续时间较长。
1.3 其他症状部分患者可能出现恶心、呕吐等胃肠道症状。
二、实验室检查2.1 病原学检测在临床实验室中，通过对患者的粪便样本进行细菌培养，能够得到确诊的结果。
产超广谱b内酰胺酶大肠埃希菌对于氧化/发酵双重试验呈阳性反应，且在MacConkey琼脂培养基上有独特的菌落形态，附有特征性的粘附物。
三、分子生物学检测3.1 PCR检测通过聚合酶链反应（PCR）技术，能够快速、准确地检测出产超广谱b 内酰胺酶大肠埃希菌的存在。
PCR技术可针对该菌株的特异基因序列进行扩增，从而达到检测的目的。
四、耐药性测试4.1 药敏试验通过对产超广谱b内酰胺酶大肠埃希菌进行抗生素的药敏试验，能够明确该菌株对于常用抗生素的敏感性及耐药性。
由于该菌株对常用的β内酰胺类抗生素产生耐药性，因此对其进行耐药性测试尤为重要。
5. 临床诊断标准产超广谱b内酰胺酶大肠埃希菌感染的临床诊断标准应当综合考虑患者的临床表现和实验室检查结果。
具体而言，应当包括患者的临床症状与体征、实验室检查结果、分子生物学检测结果以及耐药性测试结果。
仅有一个方面的检测结果不能确定该菌株的存在，需要综合多种方法进行诊断。
针对产超广谱b内酰胺酶大肠埃希菌感染的诊断标准应当充分考虑到临床表现和实验室检查结果。
通过综合不同方面的检测方法，能够更加准确地判断该菌株的存在并确定对应的治疗方案，达到更好的治疗效果。
生鲜乳检测及判定方法（一）三聚氯胺可采用快速法进行初步筛选，快速方法的检出限原则上不高于O.05mg∕kg,高出检出限的样品采用《原料乳与乳制品中三聚氧胺检测方法》（GB/T22388-2008）第二法或第三法进行确证，并依据《卫生部工业和信息化部农业部国家工商行政管理总局国家质检总局公告》（2011年第10号）进行判定。
上报的检测结果为具体检测值。
（二）碱类物质依据《生乳中碱类物质的测定》（T/TDSTIA017-2019）进行检测，检测结果超出方法检出限即判定为不合格。
对不合格的样品，检测单位应书面告知受检单位。
受检单位如果对结果有异议，检测单位应在当地立即进行复检。
如复检仍不合格，则判定该项指标不合格，并书面通知当地畜牧兽医部门。
（三）B-内酰胺酶应在当地采用快速法进行检测筛选，生羊乳样品快速方法的检出限不高于3U∕m1.,生水牛乳样品快速法的检出限不高于lU/m1.、其他样品快速法的检出限不高于4U∕m1.o高出检出限的样品，依据《生乳中B-内酰胺酶的测定》（NY/T3313-2018）（第一法）进行确证，结果呈阳性即判定为不合格。
(四)硫氯酸钠依据《生乳中硫氟酸根的测定离子色谱法》(NY/T3513-2019)进行确证检测，上报的检测结果为具体检测值。
(五)铅依据《食品安全国家标准食品中铅的测定》(GB5009.12-2017)进行检测，根据《食品安全国家标准生乳》(GB19301-2010)进行判定,含量大于0.05mg∕kg即为不合格。
上报的检测结果为具体检测值。
(六)格依据《食品安全国家标准食品中辂的测定》(GB5009.123-2014)或《食品安全国家标准食品中多元素的测定》(GB5009.268-2016)进行检测，根据《食品安全国家标准生乳》(GB19301-2010)进行判定，含量大于O.3mg∕kg即为不合格。
上报的检测结果为具体检测值。
(七)汞依据《食品安全国家标准食品中总汞及有机汞的测定》(GB5009.17-2014)或《食品安全国家标准食品中多元素的测定》(GB5009.268-2016)检测总汞,根据《食品安全国家标准生乳》(GB19301-2010)进行判定，总汞含量大于0∙01mg∕kg即为不合格。
金属类β-内酰胺酶β-内酰胺酶是革兰阴性杆菌对内酰胺类抗生素耐药的主要机制，细菌产生的β-内酰胺酶大部分系活性部位带丝氨酸残基的酶类，也有一小部分是活性部位为金属离子的酶类，称为金属β-内酰胺酶（metallo-β-lactamase,MBL），简称为金属酶。
金属β-内酰胺酶，属Bush分类3群，Ambler分类B类，该群酶最大特点是可以水解碳青霉烯类等抗生素，而对哌拉西林和氨曲南影响较小。
酶活性中心需金属锌离子的参与而发挥催化活性，故称为金属β-内酰胺酶。
底物为包括碳青霉烯类在内的一大类β-内酰胺抗生素，其活性不被常见的β-内酰胺酶酶抑制剂如克拉维酸等所抑制，但可被离子鳌合剂乙二胺四乙酸（EDTA）、菲咯啉或硫基化合物抑制所抑制。
金属β-内酰胺酶可由染色体和质粒介导，可在铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌、粘质沙雷菌、肠杆菌属菌、肺炎克雷伯菌、嗜水气单胞菌和不动杆菌、脆弱类杆菌属、等细菌中检出此类酶。
一、发现和分布第一个报道的金属酶是从蜡样芽孢杆菌( Bacill us cereus) 中发现的，该酶为锌依赖酶。
20 世纪80 年代初期日本从嗜麦芽窄食单胞菌中鉴定出第二种锌依赖青霉素酶L1 型酶，随后又从嗜水气单胞菌和脆弱拟杆菌中鉴定出多种能水解亚胺培南的金属酶。
这些酶都由染色体基因编码。
该类金属酶分布在蜡样芽孢杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、脆弱拟杆菌、气单胞菌属和戈氏军团菌中，除嗜麦芽窄食单胞菌外,在临床上都极为罕见,而且都是单株散发的。
1991年日本学者在铜绿假单胞菌中发现了第一种质粒介导的金属酶( IMP21) ，不久又从脆弱拟杆菌中发现了一种可转移金属酶，这两个酶的发现意味着金属酶已经从单株散发向随机分布过渡。
现在已报道了10多种可转移金属酶: IMP21～8 和VIM21～3，分布在铜绿假单胞菌、不动杆菌和肠杆菌科细菌中，地域分布上已经不再局限于日本，现已分布至亚洲、欧洲和美洲的多个国家（见表1）。
碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌β-内酰胺酶检测和基因分型王靖;李杰;李春英;张悦娴;贾红兵;鄢盛恺;衣美英【摘要】目的探讨碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌产β-内酰胺酶情况和β-内酰胺酶基因分型研究.方法用Vitek-Ⅱ全自动微生物分析仪对本院临床标本中分离的对碳青霉烯类耐药的肺炎克雷伯菌进行菌种鉴定和药物敏感试验；用冻融法提取β-内酰胺酶,三维试验检测β-内酰胺酶[ AmpC酶、超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)、金属酶]；改良Hodge试验检测KPC酶；用PCR扩增TEM、SHV、CTX-M、PER、VEB、DHA、MIR/ACT、KPC、IMP、VIM、SPM、GIM和NDM-1基因,并对阳性基因进行测序分析确定其基因型；REP-PCR检测分析其同源性.结果 4株对碳青霉烯类抗生素耐药肺炎克雷伯菌均表现为多重耐药,其中2株菌对所有测试的抗菌药物均耐药；1株菌产金属酶,由IMP-4型金属酶基因编码；4株菌均产生DHA型AmpC酶,2株菌产CTX-M14型ESBLs;1株菌产TEM-71型ESBLs,均经测序证实；未检测出SHV、PER、VEB、M1R/ACT、KPC、VIM、SPM、GIM和NDM-1基因型.REP-PCR显示4株菌属于3个不同的克隆型.结论本院出现碳青霉烯类耐药的肺炎克雷伯菌,属于不同克隆型,产多种β-内酰胺酶(AmpC酶、ESBLs、金属酶),基因型为DHA、IMP-4、CTX-M-14、TEM-71.【期刊名称】《临床检验杂志》【年(卷),期】2012(030)003【总页数】4页(P201-203,206)【关键词】肺炎克雷伯菌;碳青霉烯类;β-内酰胺酶;耐药性;基因分型【作者】王靖;李杰;李春英;张悦娴;贾红兵;鄢盛恺;衣美英【作者单位】中日友好医院检验科,北京1000029;中日友好医院检验科,北京1000029;中日友好医院检验科,北京1000029;中日友好医院检验科,北京1000029;中日友好医院检验科,北京1000029;中日友好医院检验科,北京1000029;中日友好医院检验科,北京1000029【正文语种】中文【中图分类】R446.5亚胺培南和美罗培南是治疗革兰阴性杆菌感染的主要碳青霉烯类药物，特别是能有效治疗产超广谱β内酰胺酶(ESBLs)和持续高产头孢菌素酶 (AmpC酶)的革兰阴性杆菌感染,已成为重症监护室防治革兰阴性菌感染的主要抗菌药物。
B-内酰胺酶的检测方法牛乳中非法添加β-内酰胺酶检测方法随着国家对食品安全问题的关注和部分乳制品企业2010年无抗奶目标的提出，抗生素残留问题成为影响乳制品安全的重要因素之一。
目前，青霉素作为β-内酰胺类药物是治疗牛乳腺炎的首选药物，是牛奶中最常见的残留抗生素。
由于国内多数乳品企业对抗生素残留超标的牛乳采取降价收购的原则，出于经济利益的驱动，一些不法奶站为了谋求自己的经济利益，人为的使用一些生物制剂去降解牛乳中残留的抗生素，生产人造“无抗奶”。
2005年至今，已有数家公司公开宣称出售分解牛乳中残留抗生素的解抗剂。
迄今为止，还没有针对这种人造“无抗奶”的相应检测方法、检测标准，无法从源头上监测、把控原奶质量。
奶制品中三聚氰胺问题出现后，检科院按照国家局科技司的安排，对奶制品中可能的添加物进行了调查。
经过前期的调研工作，初步判断市售解抗剂的主要成分是β-内酰胺酶，它是由革兰氏阳性细菌产生和分泌的，可选择性分解牛奶中残留的β-内酰胺类抗生素。
β-内酰胺酶为我国不允许使用的食品添加剂,该酶的使用掩盖了牛奶中实际含有的抗生素。
β-内酰胺酶能够使青霉素内酰胺结构破坏而失去活性，导致青霉素、头孢菌素等抗生素类药物耐药性增高，从而大大降低了人们抵抗传染病的能力，给消费者的身体健康带来危害。
微生物方法和理化方法均利用β-内酰胺酶能够裂解青霉素的β-内酰胺环形成青霉噻唑酸的原理检测乳制品中是否添加解抗剂。
一、理化方法（一）高效液相色谱法1、间接法方法原理：利用β-内酰胺酶能够酶解青霉素的原理，向牛奶中添加一定量的青霉素，如果牛奶中存在一定浓度的β-内酰胺酶，那么青霉素经β-内酰胺酶酶解后浓度会减少，从而判断牛奶中是否存在β-内酰胺酶。
实验步骤：称取20g试样，在4℃、16000rpm条件下离心10min。
取下层清液10 g于50mL塑料离心管，并将塑料离心管置于37℃水浴锅中振荡孵育30min。
向孵育后的离心管中加入无水乙醇15mL。
振荡提取30min后离心，将上层清液过滤纸后收集于梨形瓶中。
减压浓缩蒸发掉乙醇。
向旋蒸后的梨形瓶中加入10mL磷酸盐缓冲液（pH=8.5），涡旋1min后调节pH为8.5。
以1mL/min的速度将提取液通过经过预处理的Oasis HLB固相萃取柱，用2mL磷酸缓冲液（pH=8.5）淋洗萃取柱，再用2mL水淋洗。
最后用3mL乙腈洗脱。
将洗脱液在40℃下氮气吹干，用0.025M 磷酸盐缓冲液（pH=7.0）定容残渣至1mL,待上机测定。
色谱条件：色谱柱Agilent Zorbax SB C18，4.6mm×150mm×5μm；流动相甲醇/0.004M磷酸二氢钾（pH=4.5）＝40/60；检测波长268nm讨论：该方法只能给出定性结论即牛奶中是否含有β-内酰胺酶，而无法给出确切定量结果即牛奶中含有β-内酰胺酶的量（U/ml）；前处理方法相对复杂、费时。
2、直接法方法原理：牛乳中的青霉素钾在β-内酰胺酶的作用下，主要生成青霉噻唑酸钾，并伴随生成少量的青霉胺、青霉醛等物质。
经去脂肪、蛋白等前处理后，可以将青霉噻唑酸钾提取出来，经高效液相色谱仪检测确认其是否存在，从而判定该牛乳是否为人造“无抗奶”。
实验步骤：称取20g试样，在4℃、16000rpm条件下离心10min。
取下层清液10g于50mL塑料离心管，加入无水乙醇15mL，振荡提取30min后离心，取清液经0.45μm的滤膜过滤，用高效液相色谱仪检测。
标准溶液配制：称取0.01g（精确至0.001g）青霉素钾于100ml容量瓶中，加入1ml市售抗生素分解剂，室温放置2h使青霉素钾酶解完全后用去离子水定容，得到青霉噻唑酸钾标准溶液，浓度100μg/mL。
根据实际情况稀释后使用。
色谱条件：色谱柱Agilent Zorbax SB C18，4.6mm×150mm×5μm；流动相甲醇/0.004M磷酸二氢钾（pH=4.5）＝40/60；检测波长230nm讨论：该方法通过检测酶解产物青霉噻唑酸，只能给出定性结论即牛奶中是否含有β-内酰胺酶，而无法给出确切定量结果即牛奶中含有β-内酰胺酶的量（U/ml）；青霉噻唑酸钾稳定性尚需进一步考察；实验成本较生物学方法高。
二）碘量法方法原理：如果牛奶中含有β-内酰胺酶，β-内酰胺酶分解青霉素后产生的青霉噻唑酸与淀粉竞争游离碘，破坏了碘与淀粉的蓝色复合物，使蓝色变为无色，从而判断牛奶中是否掺有抗生素分解酶。
实验步骤：取1ml牛奶于一小试管中，加入不同浓度β-内酰胺酶溶液，加入250ppm 青霉素V钾磷酸盐缓冲液（磷酸氢二钾2.0g、磷酸二氢钾8.0g，蒸馏水定容至1L，在115℃灭菌30分钟）40μl，在37℃水浴中放置30分钟，不时摇动，加入1%淀粉溶液500μl，摇匀，加入碘液(碘化钾20g，碘5g，蒸馏水定容至250ml)20μl，在37℃水浴中放置2分钟观察结果。
同时做空白对照实验。
结果判定：在2分钟内能使蓝色完全消退的为β-内酰胺酶阳性，不消退者为阴性。
即蓝色为阴性，白色为阳性。
讨论：碘量法作为快速筛选方法，每次实验均需要阳性和阴性对照；对反应时间等条件要求较严格，否则容易造成误判；不同牛奶样品实验现象差别较大，还需进一步研究。
二、微生物方法1材料1.1菌株藤黄微球菌（Micrococcus luteus）CMCC（B）28001购自国家医学菌种保藏管理中心，在营养琼脂上传代培养备用。
1.2培养基营养琼脂培养基、抗生素检测用培养基Ⅱ（低PH）购自陆桥。
1.3试剂试验用10U青霉素药敏纸片购自北京天坛药物生物技术开发公司；舒巴坦、青霉素G、β-内酰胺酶标准品、生鲜牛乳抗生素分解剂、脱脂奶粉、生理盐水1.4主要仪器牛津杯（外径8mm）2方法2.1预试验2.1.1抗生素检测用培养基制备90mm培养皿铺10ml抗生素检测用培养基Ⅱ（含1×108CFU/ml藤黄微球菌）。
2.1.2生鲜牛乳抗生素分解剂活性分析将10U青霉素药敏纸片均匀贴在抗生素检测用培养基表面，其中3片纸上滴加20ul 不同稀释度的抗生素分解剂（500万U/ml，50万U/ml，5万U/ml），同时做生理盐水和青霉素药敏纸片对照。
37℃培养18-22小时。
测量抑菌圈直径。
将不同稀释度的抗生素分解剂保存于4℃。
10天后重复试验。
2.1.3青霉素G浓度的选择在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯，在每个杯子中分别加入200ul含有不同浓度（0IU/ml，0.005IU/ml，0.05IU/ml，0.5IU/ml，5IU/ml）青霉素G的生理盐水，37℃培养18-22小时。
测量抑菌圈直径，以确定青霉素G使用浓度。
2.1.4β-内酰胺酶对菌生长的影响在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯，在每个杯子中分别加入200ul含有不同浓度（0U/ml，4U/ml，40U/ml，400U/ml，50万U/ml，75万U/ml，125万U/ml，250万U/ml）β-内酰胺酶的生理盐水，37℃培养18-22小时。
观察抑菌圈情况。
2.1.5β-内酰胺酶对青霉素抑菌效果的影响在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯，在每个杯子中分别加入200ul添加有0.5ug/ml青霉素G和不同浓度β-内酰胺酶（0U/ml，4U/ml，40U/ml，200U/ml，300U/ml，400U/ml）的10%脱脂奶，37℃培养18-22小时。
观察抑菌圈情况。
将不同稀释度的抗生素分解剂保存于4℃。
10天后重复试验。
2.1.6脱脂奶对实验效果的影响使用10%（w/v）脱脂奶代替生理盐水重复2.1.3、2.1.4、2.1.5实验。
观察实验结果。
2.1.7舒巴坦浓度的选择（未完成，实验参数待验证）有实验表明，在10%脱脂奶中添加12.5-800ug/ml舒巴坦进行测试发现，含有200ug/ml舒巴坦的脱脂奶在抗生素检测用培养基上不产生抑菌圈；含有25ug/ml舒巴坦可有效抑制10%脱脂奶中400U/mlβ-内酰胺酶对0.5ug/ml青霉素G的分解作用。
在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯，在每个杯子中分别加入200ul添加有不同浓度舒巴坦（0ug/ml，100ug/ml，200ug/ml，400ug/ml）的10%脱脂奶，37℃培养18-22小时。
观察是否产生抑菌圈，以确定舒巴坦最高可适用浓度。
在青霉素G浓度（～0.5ug/ml）和舒巴坦最高适用浓度（～200ug/ml）确定的基础上，在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯，在每个杯子中分别加入200ul 添加有0.5ug/ml青霉素G、400U/mlβ-内酰胺酶（高于推荐使用浓度100倍）和不同浓度舒巴坦（0ug/ml，25ug/ml，50ug/ml，100ug/ml）的10%脱脂奶，37℃培养18-22小时。
观察产生抑菌圈情况，以确定舒巴坦最终适用浓度。
2.1.8脱脂奶中β-内酰胺酶的测定（未完成，实验参数待验证）在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯，在每个杯子中分别加入200ul添加有不同成分的10%脱脂奶（添加成分见表1），37℃培养18-22小时，观察抑菌圈情况。
表1编号0.5ug/ml青霉素G400U/mlβ-内酰胺酶25ug/ml舒巴坦结果预测（是否产生抑菌圈）1＋－－有2＋－＋有3＋＋－无4＋＋＋有在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯，在每个杯子中分别加入200ul添加有不同成分的10%脱脂奶（添加成分见表1），37℃培养18-22小时，观察抑菌圈情况。
2.1.9β-内酰胺酶检测限的测定（未完成）在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯，在每个杯子中分别加入200ul添加有0.5ug/ml青霉素、25ug/ml舒巴坦和不同浓度β-内酰胺酶（0.4U/ml，4U/ml，40U/ml，400U/ml）的10%脱脂奶，37℃培养18-22小时，观察抑菌圈情况。
2.2牛奶样品中β-内酰胺酶的测定在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯，在每个杯子中分别加入200ul添加有不同成分的10%脱脂奶（添加成分见表2），37℃培养18-22小时，观察抑菌圈情况。
同时做脱脂奶中β-内酰胺酶的测定。
表2编号0.5ug/ml青霉素G400U/mlβ-内酰胺酶25ug/ml舒巴坦抑菌圈与1号比直径差异结果预测1＋－－有2＋－＋有≥3mm≤3mm含β-内酰胺酶不含β-内酰胺酶3＋＋－无4＋＋＋有5－－＋无6－－－有/无含抗生素/不含抗生素3实验结果与分析3.1预实验结果与分析3.1.1生鲜牛乳抗生素分解剂活性结果观察与分析第一次实验10天后第二次实验青霉素对照第一次实验5万U/ml抗生素分解剂部分分解青霉素，与青霉素对照组比较抑菌圈明显变小；50万U/ml抗生素分解剂可以完全分解青霉素，不产生抑菌圈。
