甜菜硝酸还原酶的研究进展_陈志英

甜菜硝酸还原酶的研究进展

收稿日期：２００７－０９－０４基金项目：国家自然科学基金项目（３０５７１０９６）；教育部博士点基金项目资助作者简介：陈志英（１９６８－），女，吉林人，博士研究生，副教授，主要从事作物生理方面的教学与研究工作。＊通讯作者Ｅ－ｍａｉｌ：ｆｅｎｇｍｉｎｇ＿ｍａ＠ｓｏｈｕ．

ｃｏｍ陈志英，马凤鸣＊（东北农业大学农学院，哈尔滨１５００３０）摘要：施氮不当是影响甜菜产量、品质和生产效益的主要原因之一，而硝酸还原酶是氮素同化的关键酶，影响甜菜对氮吸收。文章分析了硝酸还原酶的特性及调控机理，阐述了甜菜硝酸还原酶的提取、纯化及一些基本特性、硝酸还原酶活力的测定方法和影响因素及其与产量质量的关系，并表述了结构基因表达调控的最新进展，这些研究内容对于提高氮肥利用率，提高甜菜的产量和品质具有重要意义。关键词：甜菜；硝酸还原酶；产量；品质中图分类号：Ｓ５６６．３；Ｑ５５４＋９文献标识码：Ａ糖用甜菜是我国两大糖料作物之一，年播种面积占糖料作物总播种面积的４０％，且主要分布在“三北”地区，在北方农业生产中占有重要地位。但是近十几年来，世界各主要甜菜生产国甜菜产量停滞，块根品质有下降的趋势。我国，特别是黑龙江省，甜菜单产不高，总产不稳，含糖率呈下降趋势，效益受国际市场影响波动大，甜菜制糖工业面临严峻挑战。从原料生产来看，除了品种和种子质量不过关外，施氮不当是影响甜菜产量、品质和生产效益的主要原因之一［１－３］。硝酸还原酶（ＮＲ）是氮素同化的关键酶，自从Ｅｖａｎｓ等发现ＮＲ后，人们就开始对其进行广泛的研究。甜菜ＮＲ的研究起步于２０世纪８０年代，目前对甜菜ＮＲ特性、硝酸还原酶活性（ＮＲＡ）生育变化规律有部分报道。本文介绍了甜菜ＮＲ的提取、纯化及一些基本特性、ＮＲＡ的测定方法和影响因素及其与甜菜产质量的关系、及其结构基因的表达调控，为提高氮肥利用率，提高甜菜产量和品质提供理论依据。１甜菜硝酸还原酶（ＮＲ）特性的研究植物的主要氮源是ＮＨ４＋和ＮＯ３－，ＮＯ３－进入体内后必须还原为ＮＨ４＋才能参与氨基酸、蛋白质的合成。在由ＮＯ３－转化为ＮＨ４＋的过程中，要经过

而硝酸还原酶活力的高低决定着硝酸盐同化成有机氮化合物的速度，Ｓｅｈｒａｄｅｒ等称硝酸还原酶为硝酸盐同化的限速酶。因此，硝酸还原酶是植物氮素代谢过程中的关键酶，与植物吸收利用氮素有密切关系。于海彬等对甜菜ＮＲ的特性作了大量的研究工作［４－７］。１．１甜菜ＮＲ的基本特性在甜菜的生育过程中，影响氮代谢的酶很多，其中硝酸还原酶是氮代谢中硝酸盐同化的限速酶、关键酶。在作物体内，硝酸还原酶位于根组织中和叶细胞的细胞质中，部分硝酸还原酶还可存在于膜上，如叶绿体外膜上有硝酸还原酶存在［８］。但甜菜主要是叶片中含有大量的硝酸还原酶，根中含量很少。Ｅｖａｎｓ和Ｎａｓｏｎ认为大豆子叶ＮＲ能利用ＮＡ－ＤＨ或ＮＡＤＰＨ作为电子供体。Ｈｅｇｅｍａｎ等认为ＮＲ在酶学分类上属于ＮＲ（ＥＣ．１．６．６．１），其电子供体主要是ＮＡＤＨ［９］。ＮＡＤＨ在低浓度时促进硝酸还原酶的活力（ＮＲＡ），高浓度时抑制ＮＲＡ。其ＮＲ的Ｋｍ［ＮＡＤＨ］为０．８５ｍｍｏｌ・Ｌ－１，最适ｐＨ为７．５。甜菜ＮＲ对ＮＯ３－亲和力较强，其Ｋｍ［ＮＯ３］为０．１８μｍｏｌ・Ｌ－１。离子强度影响甜菜ＮＲＡ，体外法测定ＮＲＡ时反应液无机磷最佳浓度为３５ｍｍｏｌ・Ｌ－１，最佳反应时间为１５ｍｉｎ，最佳反应温度为２５℃。甜菜ＮＲ极不稳定，ＮＲ粗酶液应在０℃保存，且保存时间不宜ＮＯ３－硝酸还原酶ＮＯ２－亚硝酸还原酶ＮＨ４＋谷氨酰胺合成酶谷氨酰胺谷氨酸合成酶谷氨酸……。第３９卷第７期东北农业大学学报３９（７）：１３１￣１３５２００８年７月ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｏｒｔｈｅａｓｔＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＪｕｌｙ２００８文章编号１００５－９３６９（２００８）０７－０１３１－０５－

过长。崔健等用ＢｌｕｅＤｅｘｔｒａｎ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析的方法，纯化了甜菜叶片ＮＡＤＨ－ＮＲ，测定出全酶分子量２８０ｋｕ，ＮＲ由４个相同亚基组成，亚基分子量６８ｋｕ，Ｋｍ［ＮＡＤＨ］＝０．８６ｍｍｏｌ・Ｌ－１，Ｋｍ［ＮＯ３］＝０．１８!ｍ及测酶活性的最适ｐＨ＝７．５，最佳Ｐｉ＝３５ｍｍｏｌ・Ｌ－１［７，１０］。这与李文华的测定结果基本一致［５］。并填补了Ｓｏｌｏ－ｍｏｓｏｎ在“ＡｓｓｉｍｉｌａｔｏｒｙＮｉｔｒａｔｅＲｅｄｕｃｔａｓｅ”一文中关于甜菜ＮＲ尚不能列出的空白内容［１１］。ＮＲ稳定性较差，操作过程都要求在０￣４℃下进行。小麦ＮＲ在２５℃下放置１ｈ，其活力损失６０％，在４℃下３０ｍｉｎ损失５％，水稻ＮＲＡ在２５℃下１ｈ损失５％。李文华试验表明甜菜ＮＲ在２５℃下放置１ｈ，活力损失６０％以上；在４℃下１ｈ损失４０％以上。可见，甜菜ＮＲ更不稳定。这可能与甜菜体内含有较多酚类物质有关［５］。１．２甜菜ＮＲ的提取特性ＮＲ的提取缓冲液６０年代多用１００ｍｍｏｌ・Ｌ－１Ｔｒｉｓ缓冲液，７０年代后普遍采用２５ｍｍｏｌ・Ｌ－１磷酸缓冲液。８０年代初有人提出用ＨＥＰＥＳ缓冲液（含２ｍｍｏｌ・Ｌ－１ＨＥＰＥＳ，５ｍｍｏｌ・Ｌ－１ＥＤＴＡ、５ｍｍｏｌ・Ｌ－１半胱氨酸，ｐＨ７．５）提取效果显著优于常用的磷酸缓冲液（含０．１ｍｍｏｌ・Ｌ－１ＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．５）。但目前人们多采用２５ｍｍｏｌ・Ｌ－１磷酸缓冲液。为保护巯基，防止内源酚类物质的干扰，人们在提取缓冲液中加入半胱氨酸、谷胱甘肽、二硫苏糖醇、咪唑、巯基乙醇（保护巯基）、聚乙烯吡咯烷酮。为防止ＮＲ亚基解离并与酚类物质结合，也有人在提取缓冲液中加入蛋白酶抑制剂苯甲磺酰氟，从而大大提高了提取效果［１２－１３］。１．３甜菜ＮＲ的纯化特性１９７５年以前，所有关于ＮＲ的研究都是用粗酶液或部分纯化的酶进行的。Ｓｏｌｏｍｏｎｓｏｎ用Ｂｌｕｅ－ＤｅｘｔｒａｎＡｇａｒｏｓｅ亲和层析法纯化出小球藻的硝酸还原酶，纯度达到电泳纯，并指出该方法本质是ＮＲ与Ｂｌｕｅ－Ｄｅｘｔｒａｎ能特异性结合，用高离子浓度的缓冲液也洗不下来，但用１００μｍｏｌ・Ｌ－１ＮＡＤＨ能迅速将ＮＲ洗脱下来［１１］。从此建立了纯化ＮＲ的亲和层析方法。Ｍａｒｇａｒｅｔ等用这种亲和层析法纯化玉米根中的ＮＲ，层析过程中，先后用含ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤＨ和ＫＮＯ３的缓冲液洗脱，洗下三部分硝酸还原酶。经进一步研究，用ＮＡＤＰＨ洗下的部分是ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ双专一的ＮＲ，ＮＡＤＨ洗下的是ＮＡＤＨ专一的ＮＲ。最后用ＫＮＯ３洗下的部分前两者都含有。林振武等用ＢｌｕｅＤｅｘｔｒａｎ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析法纯化出水稻叶片中的ＮＲ［１２］。纯化过程中，继１００μｍｏｌ・Ｌ－１ＮＡＤＨ洗脱出一个ＮＲ活力峰后，再用０．２５ｍｏｌ・Ｌ－１ＫＮＯ３洗脱又得到一个更高的ＮＲ活力峰，认为酶与配基有两个结合位点，可能就是酶与ＮＡＤＨ和ＫＮＯ３的结合位点［１４］。关于甜菜硝酸还原酶的纯化研究主要以崔健的相关研究为主。在甜菜硝酸还原酶纯化时，他采用ＢｌｕｅＤｅｘｔｒａｎ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析法，洗脱方法参照林振武。Ａ液（５ｍｍｏｌ・Ｌ－１ＥＤＴＡ、５ｍｍｏｌ・Ｌ－１－半胱氨酸的２５ｍｍｏｌ・Ｌ－１磷酸缓冲液，ｐＨ７．５）洗净杂蛋白后换含０．２５ｍｏｌ・Ｌ－１的缓冲液洗脱，最后又含０．２５ｍｏｌ・Ｌ－１ＫＮＯ３的缓冲液洗脱，结果ＮＲ纯化了近３００倍。收集到的酶液装入透析袋，在４℃下用聚乙二醇６０００吸水浓缩，低温保存备用。７．５％聚丙烯酰胺凝胶电泳检验纯度，达到单带纯［７］。２甜菜硝酸还原酶活力（ＮＲＡ）的测定方法研究Ｈｅｇｅｍａｎ在《酶学方法》中归纳出测定ＮＲ活力的体内法和体外法［９］。体内法即活体测定，能反映ＮＲ的实际还原能力，并且简便、快速，不需要贵重仪器、药品，但结果重复性往往不够理想，数据不太稳定。体外法是把酶从组织中分离出来，加入了外源电子供体和底物，反映的是酶的潜在还原能力，其优点是数据稳定、准确，但对温度控制要求严格，药品昂贵，需要一些较贵重的仪器，测定结果受酶反应时间、温度、缓冲液ｐＨ值和离子强度、电子供体浓度及对照等多种因素的影响［９，１５］。国内一些学者在８０年代对完善这两种方法做了有益的探讨。周树等提出几种改进体内法的方案并做了比较研究，确立了一种效果较理想的“改进常规法”［１６］。林振武等从取材、匀浆、离心等几个环节对体外法做了改进，使该方法条件简化，时间缩短，准确性也得到提高［１２］。甜菜ＮＲＡ体内法测定参考周树等改进常规法［１６］，体外法测定参考Ｈｅｇｅｍａｎ等［９］和林振武等的方法［１２］进行试验。测定结果表明，甜菜ＮＲＡ体外法测定高于体内法。且体外法更能反映出甜菜ＮＲ的还原潜力。不同生育时期，甜菜外源基质体外法测定・１３２・东北农业大学学报第３９卷－

ＮＲＡ与内源基质体内法测定ＮＲＡ的比例不同，且随外源基质的下降体外法测定的ＮＲＡ反而增大［５］。３甜菜ＮＲＡ的影响因素３．１内因３．１．１品种对ＮＲＡ的影响甜菜不同类型品种之间ＮＲＡ存在着差异。在甜菜块根分化形成期，高糖型品种的ＮＲＡ明显高于丰产型品种，这与以前的相关研究结果是一致的。但从甜菜整个生育期来看，丰产型品种的硝酸还原酶活性高于高糖型品种，这说明丰产型品种一生比高糖型品种吸收更多的氮素［１７］。３．１．２甜菜不同生育时期的ＮＲＡ研究表明，从全生育期来看，生育中前期ＮＲ活性较高，ＮＲ的峰值出现在叶丛形成期，生育后期活性减弱，这一变化动态符合甜菜体内氮代谢规律［５，７，１７－１９］。３．２外因３．２．１氮素对ＮＲＡ的影响３．２．１．１氮素形态对ＮＲＡ的影响不同的氮素形态对ＮＲＡ的影响不同。在单一ＮＯ３－－Ｎ培养下，无论内源基质还是外源基质条件ＮＲＡ都与氮素水平呈正相关；而在单一ＮＨ４＋－Ｎ培养的条件下，在内源基质条件下较低的氮素浓度（８ｍｍｏｌ・Ｌ－１以下）促进ＮＲ；在外源基质条件下则随氮素水平的增加而提高，这能否说明ＮＨ４＋对ＮＲ的活性潜力有促进作用，还有待于进一步地进行研究［１８，２０，２１］。３．２．１．２铵态氮与硝态氮的比值铵态氮与硝态氮的比值对ＮＲＡ有很大影响。对同一氮素水平不同ＮＯ３－／ＮＨ４＋比例培养的甜菜进行ＮＲＡ比较，结果显示，ＮＯ３－／ＮＨ４＋的比例不同对ＮＲＡ的作用不同。在甜菜整个生育期，不同ＮＯ３－／ＮＨ４＋在内外源条件下，活性的变化趋势相同，即在叶丛形成期达到高峰。这说明ＮＲ活性的变化与甜菜吸收氮素规律是一致的。ＮＲＡ并不随ＮＯ３－－Ｎ浓度的增加而增加，而以ＮＯ３－／ＮＨ４＋为３：１时最高，比单一施入ＮＯ３－－Ｎ的酶活性要高，随ＮＨ４＋－Ｎ浓度升高ＮＲ活性不断下降。目前相关研究还较少，还有待于进一步深入研究［１８，２０，２２－２３］。３．２．１．３氮素水平在内外源基质条件下，不同氮素水平处理的ＮＲ活性在整个生育期表现出相似的变化规律，随着ＮＯ３－比例的增加而增加，随着ＮＨ４＋比例的增加而减小；说明ＮＲ活性与ＮＯ３－和ＮＨ４＋浓度比例密切相关，这与前人的研究结论基本一致［１８］。李文华研究表明，在不同ＮＯ３－－Ｎ和ＮＨ４＋－Ｎ水平下，甜菜叶片内源基质和外源基质条件下ＮＲＡ随生育进程呈双峰曲线变化，第一峰值出现在叶丛快速生长中、后期，第二峰值出现在块根糖分增长末期到糖分积累初期。在不同的生育时期，均与施氮水平呈正相关［２４］。３．２．２ｐＨ对ＮＲＡ的影响ｐＨ对ＮＲＡ也有一定的影响，中性偏碱有利于ＮＲＡ活性，这符合甜菜较耐盐碱的特性［７］。也有研究表明，ｐＨ值对无土栽培甜菜苗期叶片的ＮＲ有明显的促进作用，ｐＨ在７（零水平）时无土栽培甜菜苗期叶片ＮＲ活性最高，ｐＨ对甜菜苗期叶片ＮＲ活性的影响呈抛物线状，即在最佳水平以下时，酶活性随该因素的增大而增加，当酶活性水平超过最佳水平时，活性出现下降趋势［２５］。而ｐＨ对ＮＲＡ分解方向和合成方向的影响顺序分别为：７．０＞７．５＞７．８＞６．５＞６．２和７．５＞７．０＞７．８＞６．５＞６．２［１９］。３．２．３温度对ＮＲＡ的影响温度是影响植物生长发育的重要因素，但是温度对植物ＮＲ表达的影响很少报道，温度对甜菜ＮＲ活性的影响的报道更少。Ｌａｗｌｏｒ等曾经比较了１３℃／１０℃和２３℃／１３℃两种温度范围内小麦生长时的一些生理指标，观察到较高的温度能刺激小麦叶片ＮＲ的活性并升高可溶性蛋白的水平。对于甜菜苗期ＮＲ来说从１５℃到３０℃，随着温度的升高酶活性呈直线下降［２５］。４ＮＲＡ与产量、产糖量和含糖率的关系由于硝酸还原酶在氮同化中的重要作用，引起人们对其与作物产量、蛋白质含量、可溶性糖及可溶性氮含量等关系的深入研究。从小麦、水稻、玉米、大豆、花生等作物上的研究结果表明ＮＲＡ可作为作物育种、营养诊断和品种对氮肥利用潜力的指标。甜菜功能叶片的ＮＲ活性的动态也能作为甜菜氮素营养诊断及产量和产糖量的指标。马凤鸣等研究认为，甜菜产量、产糖量与幼苗末期、块根增长初期功能叶片ＮＲＡ呈抛物线型相关（Ｐ＜０．０５）。提陈志英等：甜菜硝酸还原酶的研究进展第７期・１３３・