实验三_硝酸还原酶活性测定

硝酸还原酶活性测定实验报告硝酸还原酶活性测定实验报告引言：硝酸还原酶是一种重要的酶类，在生物体内负责将硝酸盐还原为亚硝酸盐。

硝酸还原酶活性的测定对于研究生物体对硝酸盐的代谢和环境污染物的检测具有重要意义。

本实验旨在探究硝酸还原酶的活性测定方法，并通过实验验证其可行性和准确性。

材料与方法：1. 实验材料：- 0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH 7.0）- 0.1 mol/L 硝酸钠溶液- 0.1 mol/L 硫酸铵溶液- 1% 硫胺素溶液- 10% 硝酸盐还原酶提取液- 10% 硝酸盐还原酶抑制剂- 2% 硝酸盐还原酶底物溶液- 0.1 mol/L 硫酸铵铵铁硫氰化物溶液- 0.1 mol/L 醋酸溶液- 蒸馏水2. 实验仪器：- 分光光度计- 定量移液器- 离心机- 恒温水浴槽- 试管架- 显微镜实验步骤：1. 提取硝酸盐还原酶：a. 取一定量的样品（如细胞或组织），加入磷酸盐缓冲液，用搅拌器充分破碎。

b. 将破碎后的样品转移至离心管中，以12000 rpm离心10分钟。

c. 取上清液，即为硝酸盐还原酶提取液。

2. 硝酸还原酶活性测定：a. 准备一组空白对照组，加入相同体积的磷酸盐缓冲液代替硝酸盐还原酶提取液。

b. 准备一组实验组，加入一定体积的硝酸盐还原酶提取液。

c. 分别加入一定体积的硝酸钠溶液、硫酸铵溶液、硫胺素溶液和硝酸盐还原酶底物溶液。

d. 在恒温水浴槽中，将反应体系恒温30分钟。

e. 加入硝酸盐还原酶抑制剂停止反应。

f. 加入硫酸铵铵铁硫氰化物溶液，使反应产生红色沉淀。

g. 加入醋酸溶液，混匀后离心10分钟。

h. 取上清液，以分光光度计测定其吸光度。

结果与讨论：通过实验测定，我们得到了一组吸光度数据。

根据吸光度与硝酸还原酶活性之间的关系，我们可以计算出样品中硝酸还原酶的活性。

在本实验中，我们采用了硫酸铵铵铁硫氰化物法测定硝酸还原酶活性。

该方法利用硝酸还原酶将硝酸盐还原为亚硝酸盐，再与硫酸铵铵铁硫氰化物反应生成红色沉淀。

实验三预习报告硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性的测定实验三、硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性的测定一、硝酸还原酶的测定[原理]:硝酸还原酶(NR)是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，产生的亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸(或对-氨基苯磺酰胺)及α-萘胺(或萘基乙烯胺)在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。

生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定。

硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。

一般以每克鲜重含氮量表示，即以-1-1ug.g.h为单位。

NR的测定可分为活体法和离体法。

活体法步骤简单，适合快速、多组测定。

离体法复杂，但重复性较好。

[试剂]1(亚硝酸钠标准溶液:准确称取分析纯NaNO0.9857g溶于去离子水后定容至1 2-1000ml，然后再吸取5ml定容至1000ml，即为含亚硝态氮1ug.ml的标准液; 2(0.1molpH7.5的磷酸缓冲液:NaHPO.12HO30.0905g与NaHPO.2HO 2422422.4965g加去离子水溶解后定容至1 000ml;-13(1%(W/V)溶液:1.0g 对氨基苯磺酸溶于100ml 3 mol.LHCL中(25ml浓-1盐酸加水定容至100ml 即为 3 mol.LHCL);(0.02%(W/V)萘基乙烯胺溶液:0.020g萘基乙烯胺溶于100ml 去离子水中，4贮于棕色瓶中;-1-15(0.1mol.LKNO溶液:2.5275g KNO溶于250Ml 0.1mol.LPh7.5的磷酸缓冲33液中; -16(0.025mol.LPh 8.7 的磷酸缓冲液:8.864 0g NaHPO12HO，0.0570g 24.2KHOP.3HO，溶于1 000ml去离子水中; 2427( 30%三氯乙酸溶液:30g三氯乙酸。

水溶后定容至100ml。

[方法];1. 标准曲线制作:管号 1 2 3 4 5 6 7亚硝酸钠标准液 0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 试剂蒸馏水 2.0 1.8 1.6 1.2 0.8 0.4 0.0 (ml) 1%磺胺 4 4 4 4 4 4 40.02%萘基乙烯胺 4 4 4 4 4 4 4每管含亚硝态氮(ug) 0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0摇匀后在25度下保温30min，然后在540nm下比色测定。

首都师范大学生命科学学院实验报告实验题目硝酸还原酶活性的测定一、实验原理硝酸还原酶是植物氮素作用中的关键性酶，硝酸还原酶作用于NO 使之还原为NO 。

NO -+ NADH + H +— NO 2- + NAD ++ H 2O产生的NO 可以从植物组织渗透到外界溶液中，积累在溶液中。

因此，测定反 应液中NO 含量的增加即表明酶活性的大小。

NO 含量的测定----磺胺法NO 2-与磺胺和-萘胺在酸性条件下生成粉红色化合物，用比色法在520nm 下读 取光密度值。

—、实验用品1. 材料：完全营养的小麦苗，缺氮培养的小麦苗2. 仪器和用具：722型分光光度计，剪刀，真空泵，电子天平，温箱，烧杯，移液 枪，tip 头(两种规格：1000卩I ，200卩I ) 三、实验步骤1. 分别配制反应液于小烧杯中(1) 0.1M 磷酸缓冲液5ml +蒸馏水5ml(2) 0.1M 磷酸缓冲液 5ml + 0.2MKNQ 5ml 2. NO 2-的获得(1) 称取新鲜叶片0.5g 共四份,剪成小片，分别置于小烧杯内的反应液中。

(2) 在真空干燥器中抽气20min,使叶片沉于溶液底部，溶液即可渗入组织内取代其 中的空气，内部产生的NO 可渗透到外部溶液中。

3.将小烧杯转到30 r 温箱,使其不见光,保温20min 。

4.用5卩g/ml NaNQ 母液配制标准梯度溶液 5、4、3、2、1、0.5、0.1、 0 卩 g/ml 。

5.吸取不同浓度的NaNOmI 于试管中，加入磺胺试剂2ml 及a -萘胺试剂2ml ，混 合均匀，在60r 水浴中保温20min ，于比色杯中，在520nm 下进行比色，读取光 密度，然后做出光密度一浓度曲线，以光密度为纵坐标， 体步骤及结果如下表和下图所示。

课程名称植物生理实验 实验时间2010331成绩姓名唐倪文班级_3学号 1090800032NaNO 浓度为横坐标。

具试剂管号12 3 4 5 6 7 8 NaNO 母液(ml)0 0.02 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水（ml ） 1 0.98 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 1%磺胺(ml)22 2 2 2 2 2 2 0.2 %a -萘胺 (ml) 22 2 2 2 2 2 2 每管亚硝酸氮含 量（卩g ） 0 0.1 0.5 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 每管NaNO 浓度 （卩 g/ml ） 0 0.1 0.5 1.02.03.04.05.0 光密度0.0150.0520.1040.2020.3020.3960.493小麦幼苗完全培养液缺N 培养液KNOHO KNO HO 小麦鲜重（g ） 0.51 0.51 0.49 0.48 光密度0.178 0.176 0.065 0.039 亚硝酸钠浓度 （卩 g/ml ） 1.791 1.7710.6540.392亚硝态氮含量 （卩g ） 1.791 1.771 0.654 0.392 酶活性105.39104.1840.0424.505.吸取反应液各1 ml 于试管中加入磺胺和粉红色化合物.用比色法在520nm 下读取光密度值，从标准曲线上查得NO 的含量, 结果如下表。

硝酸还原酶活性的测定一．试验原理：硝酸还原酶是植物氮素代谢作用中的关键酶，与作物吸收和利用硝态氮的能力相关。

它催化NO3－还原为NO2－的反应：NO3－+NADH+H+→NO2－+NAD++H2O反应产生的NO2－可从组织内渗透到外界溶液中，定时测定一定的反应溶液中NO2－含量的变化情况则可了解此酶的活性大小。

NO2－的定量测定是用磺胺比色法。

此法简单易行而又非常灵敏，可测出0.5微克/ml NaNO2含量的变化。

二．试剂：磷酸缓冲液（Na2HPO4.12H2O NaH2PO4.2H2O） KNO3溶液磺胺试剂α－萘胺试剂 NaNO2标准溶液1. 0.1molpH7.5的磷酸缓冲液：Na2HPO4.12H2O 30.0905g与NaH2PO4.2H2O2.4965g加去离子水溶解后定容至1000ml；2. 0.2 mol/L KNO3：称取 KNO3 20.22 g，用蒸馏水溶解，移入100 mL 容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀。

3.磺胺（对氨基苯磺酸胺）试剂：1克磺胺溶于25毫升浓盐酸后再用蒸馏水稀释至100 ml 。

4.α－萘胺试剂：0.2克α萘胺溶于25 ml 浓盐酸中，再用蒸馏水稀释至100 ml 。

5.NaNO2标准溶液：1克NaNO2溶于1000ml 蒸馏水中配成NaNO2母液。

实验时按处理稀释成要求浓度。

如1微克/ ml ：取母液1ml ，用蒸馏水稀释成1000 ml 。

三．仪器721型分光光度计真空泵保温箱天平真空干燥器打孔器三角瓶移液管烧杯四．试验步骤1．将新鲜取回的材料叶片用水清洗后用吸水纸吸干水份。

用打孔器取下直径为1厘米的圆片，再用蒸馏水洗2－3次，将蒸馏水吸干。

在天平上称取等重的叶子园片两份：每份0.4克左右（或每份取50个圆片）。

将两份圆片分别置于下列两种溶液中，容器使用50ml 三角瓶。

（1）0.1 M 磷酸缓冲液5 ml +蒸馏水5 ml 。

（2）0.1 M 磷酸缓冲液5 ml +0.2 M KNO3溶液5 ml 。

硝酸还原酶活性的测定一、原理硝酸还原酶是植物氮素作用中的关键性酶，与作物吸收和利用N肥有关的不同品种，年龄、器官组织以及环境条件对硝酸还原活性都有影响，硝酸还原酶作用于NO3使还原为NO2NO3⎯+NADH+H→NO2⎯+NAD+H2O产生的NO2⎯可以从组织内渗到外界溶液中，并积累在溶液中因此测定反应溶液中NO2⎯的含量的增加，即表明酶活性的大小。

NO2⎯含量的测定用对氨基苯磺酸化比色法，亚硝酸对氨基苯磺酸和α-萘胺在酸性条件下生成红色化合物，颜色在2-3小时稳定，可用比色法定量，该法非常灵敏，能测定每毫升0.5微克的Na NO2。

二、仪器和药品721型分光光度计（或其他型号比色计），剪刀，真空泵（或注射器），小天平，温箱，烧杯，移液管，小烧杯（50ml）0.2MKNO3：将20、22克KNO3溶于100ml蒸馏水中。

0.1M磷酸缓冲液（PH=7.5）：将85.2%ml 1/15M磷酸氢二钠与14.8ml 1/15M磷酸二氢钾混合均匀。

1/15MNa2HPO4溶液：1000ml中含Na2HPO4•2H2O11.878克。

1/15M溶液：1000ml中含KH2PO49.078克。

对氨基苯磺酸试剂：1克对氨基苯硝酸加加25ml浓HCl，用蒸馏稀释至100ml.。

α–萘胺试剂，0.2克α–萘胺加25ml浓HCl，用蒸馏稀释至100ml。

NaNO2标准溶液：1克NaNO2用蒸馏水溶解至1000ml，然后吸取5ml，再加蒸馏水稀释成1000ml，该溶液每毫升含有NaNO2 5微克，用时稀释之。

三、实验步骤：1、将新鲜叶片（蓖麻、向日葵、小麦、棉花等），用水冲洗净，并用吸水纸吸干，用剪刀剪成小块(注意块小为宜)，然后在小天平上称取等重的两份叶片，每份约0.5克。

分别置于含有下列溶液的小烧杯中。

（1）1M磷酸缓冲溶液5ml+蒸馏水5ml（2）0.1M磷酸缓冲溶液5ml+0.2M KNO35ml然后将小烧杯置于真空干燥器中，接上真空泵抽气，放气后叶片便沉于底部（如没有真空泵，也可以20ml注射器代替，将反应液及叶片一起倒入注射器使之真空，如此进行抽气、放气反复多次，溶液即可渗入叶组织内取代了叶片内的空气，叶片便沉于溶液底部），取出小烧杯置于30℃温箱中，使不见光保温作用30分钟。

硝酸还原酶活性的测定实验报告硝酸还原酶活性的测定实验报告引言：硝酸还原酶是一种重要的酶类，在生物体内起着关键的作用。

它能够将硝酸根离子还原为亚硝酸根离子，参与到氮代谢中。

本实验旨在通过测定硝酸还原酶活性的方法，探究其在不同条件下的变化规律，从而深入了解这一酶的功能及其对生物体的重要性。

材料与方法：1. 实验材料：- 萝卜组织样品- 硝酸还原酶提取液- 硝酸还原酶底物溶液- 甲酚硫酸溶液- 氨水溶液- 高锰酸钾溶液- 氯化亚铁溶液- 硝酸铜溶液- 硫酸亚铁溶液- 硫酸铵铁溶液- 蒸馏水2. 实验方法：- 提取硝酸还原酶：将萝卜组织样品切碎并加入硝酸还原酶提取液，搅拌均匀后离心，取上清液作为硝酸还原酶提取液。

- 测定硝酸还原酶活性：将硝酸还原酶提取液与硝酸还原酶底物溶液混合，反应一段时间后，加入甲酚硫酸溶液停止反应。

然后，分别加入氨水溶液和高锰酸钾溶液，测定吸光度。

- 构建标准曲线：分别取一系列浓度的硝酸铜溶液，加入硫酸亚铁溶液和硫酸铵铁溶液，测定吸光度。

根据吸光度与浓度的关系，绘制标准曲线。

结果与讨论：通过实验测定，我们得到了硝酸还原酶活性的数据，并根据标准曲线计算了不同样品中硝酸还原酶的活性。

首先，我们观察到在不同温度条件下，硝酸还原酶活性的变化。

结果显示，在较低的温度下，硝酸还原酶活性较低，随着温度的升高，酶活性逐渐增加，但在一定温度范围内，酶活性会达到峰值后开始下降。

这表明硝酸还原酶对温度敏感，适宜的温度能够促进酶的活性，但过高的温度则会导致酶的变性和失活。

其次，我们研究了不同pH值对硝酸还原酶活性的影响。

结果显示，在中性pH范围内，硝酸还原酶活性较高，而在酸性或碱性条件下，酶活性明显下降。

这说明硝酸还原酶对于酸碱度有一定的适应范围，过高或过低的pH值都会影响酶的活性。

此外，我们还研究了不同浓度的底物对硝酸还原酶活性的影响。

结果显示，在一定范围内，随着底物浓度的增加，硝酸还原酶活性呈现出增加的趋势。

硝酸还原酶(NR)活性的测定硝酸还原酶是一种重要的酶，参与植物的氮代谢和植物的抗逆能力等生理过程。

硝酸还原酶的活性可以反映出植物对外界环境变化的适应能力和生长发育状态。

因此，硝酸还原酶活性的测定具有重要的生物学意义。

一、实验目的本实验主要目的是通过测定植物中硝酸还原酶活性的变化，探究外界环境对硝酸还原酶活性的影响。

另外，本实验还旨在掌握硝酸还原酶活性的检测方法。

二、实验原理硝酸还原酶 (NR) 是一种能将 NO3- 还原为 NO2- 的酶。

其催化反应的速率与硝酸还原酶的活性密切相关。

因此，硝酸还原酶活性的测定，是利用一定体系中 NO3- 还原成NO2- 的速率或反应产物的含量，来评价細胞內硝酸还原酶活性大小的一种生化方法。

实验中通常采用光度法来测定硝酸还原酶的活性。

光度法是将产生的 NO2- 与苯磺酸二苯胺 ( sulfanilamide) 反应生成硝基苯偶氮苯磺酸 (N-(1-naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride，NED) ，然后用紫外可见分光光度计测定产生的吸光度。

三、实验步骤3.1 实验前准备1）制备显色液：将 1g 苯磺酸二苯胺和 0.02 g NED 加入 10mL 硫酸中，用水稀释至100 mL 。

2）制备反应液：在无氧条件下，将浓硝酸滴入 50mL 去离子水中，制备100μM 硝酸钾溶液。

3）制备酶提取液：将新鲜植物组织（如叶片、幼芽等）用磨汁机研磨成细胞浆，加入0.05M 磷酸盐缓冲液 (PH=7.5) 中，按 1：5 的比例(即 1g 组织加 5mL 缓冲液) 收集悬液，离心 15 分钟，将上清液称取至 1mL，即为酶提取液。

3.2 检测方法1）在96孔板中加入100μL 酶提取液，40℃孵育20分钟。

2）加入100 μL 反应液，制备最终反应物质的浓度应为：10mM NaNO3、2mM Na2S2O4、0.05M 磷酸盐缓冲液 (pH 7.5)。