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硝酸还原酶活性测定实验报告硝酸还原酶活性测定实验报告引言：硝酸还原酶是一种重要的酶类，在生物体内负责将硝酸盐还原为亚硝酸盐。
硝酸还原酶活性的测定对于研究生物体对硝酸盐的代谢和环境污染物的检测具有重要意义。
本实验旨在探究硝酸还原酶的活性测定方法，并通过实验验证其可行性和准确性。
材料与方法：1. 实验材料：- 0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH 7.0）- 0.1 mol/L 硝酸钠溶液- 0.1 mol/L 硫酸铵溶液- 1% 硫胺素溶液- 10% 硝酸盐还原酶提取液- 10% 硝酸盐还原酶抑制剂- 2% 硝酸盐还原酶底物溶液- 0.1 mol/L 硫酸铵铵铁硫氰化物溶液- 0.1 mol/L 醋酸溶液- 蒸馏水2. 实验仪器：- 分光光度计- 定量移液器- 离心机- 恒温水浴槽- 试管架- 显微镜实验步骤：1. 提取硝酸盐还原酶：a. 取一定量的样品（如细胞或组织），加入磷酸盐缓冲液，用搅拌器充分破碎。
b. 将破碎后的样品转移至离心管中，以12000 rpm离心10分钟。
c. 取上清液，即为硝酸盐还原酶提取液。
2. 硝酸还原酶活性测定：a. 准备一组空白对照组，加入相同体积的磷酸盐缓冲液代替硝酸盐还原酶提取液。
b. 准备一组实验组，加入一定体积的硝酸盐还原酶提取液。
c. 分别加入一定体积的硝酸钠溶液、硫酸铵溶液、硫胺素溶液和硝酸盐还原酶底物溶液。
d. 在恒温水浴槽中，将反应体系恒温30分钟。
e. 加入硝酸盐还原酶抑制剂停止反应。
f. 加入硫酸铵铵铁硫氰化物溶液，使反应产生红色沉淀。
g. 加入醋酸溶液，混匀后离心10分钟。
h. 取上清液，以分光光度计测定其吸光度。
结果与讨论：通过实验测定，我们得到了一组吸光度数据。
根据吸光度与硝酸还原酶活性之间的关系，我们可以计算出样品中硝酸还原酶的活性。
在本实验中，我们采用了硫酸铵铵铁硫氰化物法测定硝酸还原酶活性。
该方法利用硝酸还原酶将硝酸盐还原为亚硝酸盐，再与硫酸铵铵铁硫氰化物反应生成红色沉淀。
植物体内硝酸还原酶活性的测定目的意义：硝酸还原酶是植物氮代谢中十分重要的一个酶，植物从土壤吸收硝酸盐后，首先催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，才能进一步转化变成有机含氮化合物。
在生产中可根据植物体内硝酸还原酶的活性变化，来确定氮肥的合理用量以及植物的氮素营养状况。
一、实验原理在酸性条件下，亚硝酸盐与重氮试剂对—氨基苯磺酸（或对—苯磺酰胺）及偶联试剂α-萘基乙烯二胺反应生成红色偶氮化合物。
红色偶氮化合物的颜色在2~3h内稳定，并在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定。
二、材料、设备及试剂1、材料川芎叶片、根茎和根。
2、设备冷冻离心机、分光光度计、天平、冰箱、恒温水浴锅、研钵、移液管、剪刀、离心管。
3、试剂(1) 0.1mol/L PH7.5磷酸缓冲液称取30.0905g Na2HPO4·12H2O和2.4965g NaH2PO4·2H2O 加去离子水溶后，定至1L；0.1mol/L KNO3溶液称取2.5275g KNO3溶于250mL 0.1mol/L PH7.5磷酸缓冲液中；（避光保存）0.025mol/L PH 8.7的磷酸缓冲液称取8.8640g Na2HPO4·12H2O和0.0570g K2HPO4·3H2O（很易吸水变潮）溶于1L去离子水中；(2) 亚硝酸钠标准溶液：准备称取分析纯NaNO20.9857g 溶于无离子水后定容至1000mL，然后再吸取5ml 定溶至1000mL，即为含亚硝态氮的1μg/mL的标准液。
(3) 1%磺胺溶液：1.0g无水对氨基苯磺酸溶于100mL 3mol/L HCl 中(25mL浓盐酸加水定容至100mL即为3mol/L HCl)；（注：磺胺比较难容，定容后最好用超声波促进溶解。
应避光保存！）(4) 0.02%萘基乙烯胺溶液：0.02g萘基乙烯胺溶于100mL无离子水中，贮于棕色瓶中。
(5) 提取缓冲液：0.1211g半胱胺酸、0.0372g EDTA溶于100mL 0.025mol/L PH 8.7的磷酸缓冲液中。
植物生理研究技术实验报告实验二硝酸还原酶活性的测定硝酸还原酶的诱导与活体测定硝酸还原酶的诱导与活体测定一、实验目的硝酸还原酶是一种诱导酶，广泛地存在于高等植物的根、茎、叶等组织中，它是植物氮素代谢中一个非常重要的酶，此酶还直接影响到土壤中无机氮的利用率，从而对植物的生长、发育以及产量和品质产生影响。
所以，作物栽培中，有人认为此酶活性的大小，可作为作物产量的生理指标。
本实验通过磺胺(或对氨基苯磺酸)比色法测定硝酸还原酶的活性，来了解植物生长发育期间氮素的营养水平，为合理施肥提供科学依据。
二、实验原理硝酸还原酶是植物氮素代谢作用中的关键性酶，与作物吸收和利用氮肥有关。
它作用于N03-使之还原为NO2-：N03-+NADH+H+→NO2-+NAD++H20产生的NO2-可以从组织内渗透到外界溶液中，并积累在溶液中，测定反应溶液中NO2-含量的增加，即表现该酶活性的大小。
这种方法简单易行，在一般条件下都能做到。
NO2-含量的测定用磺胺比色法。
在酸性条件下，对氨基苯磺酰胺与NO2-形成重氮盐，再与a一萘胺形成红色的偶氮染料化合物。
反应液的酸度大则增加重氮化作用的速度，但降低偶联作用的速度，颜色比较稳定。
增加温度可以增加反应速度，但降低重氮盐的稳定度，所以反应需要在相同条件下进行。
这种方法非常灵敏，能测定每毫升含0.5µg的NaNO2。
硝酸还原酶活性的测定可分为活体法和离体法。
活体法步骤简单，适合快速、多组测定。
离体法复杂，但重复性较好。
本次实验学习活体法对硝酸还原酶进行测定。
三、实验材料、设备和试剂1．实验材料小麦叶片2．设备(1)分光光度计(2)真空泵(或注射器) (3)天平(4)移液管(5)试管(6)离心管3．试剂(1)0．1 mol·L-1磷酸缓冲液，pH7.5。
贮备液A：称分析纯磷酸二氢钠(NaH2PO4)2.78 g，配成100mL，即成0.2 mol·L-1NaH2P04溶液；贮备液B：称Na2HPO4·12H2O 7.17 g，配成100 mL，即成0.2 mol·L-1 Na2HPO4溶液；用时取贮备液A 16 mL，贮备液B 84 mL混合，用蒸馏水稀释至200 mL，即成为0.1 mol·L-1的磷酸缓冲液。
硝酸还原酶活性的测定实验报告一、实验目的硝酸还原酶（NR）是植物氮代谢中的关键酶之一，其活性的高低与植物氮素利用效率密切相关。
本实验旨在掌握硝酸还原酶活性的测定方法，了解不同植物材料或不同处理条件下硝酸还原酶活性的差异，为进一步研究植物氮代谢机制和氮素营养调控提供依据。
二、实验原理硝酸还原酶能够催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐。
在一定条件下，产生的亚硝酸盐量与硝酸还原酶活性成正比。
通过测定反应体系中亚硝酸盐的含量，可以间接反映硝酸还原酶的活性。
本实验采用磺胺比色法测定亚硝酸盐含量。
在酸性条件下，亚硝酸盐与磺胺发生重氮化反应，生成重氮盐，再与 N（1-萘基）乙二胺盐酸盐（NED）偶联，形成红色偶氮化合物。
该化合物在 540nm 波长处有最大吸收峰，其吸光度与亚硝酸盐含量成正比。
三、实验材料、仪器与试剂1、实验材料选取新鲜的植物叶片，如小麦、玉米、大豆等。
2、仪器分光光度计、离心机、恒温水浴锅、移液器、研钵、容量瓶、刻度试管等。
3、试剂（1）01mol/L pH 75 的磷酸缓冲液；（2）02mol/L KNO₃溶液；（3）1%磺胺溶液（磺胺溶于 30%乙酸中）；（4）002% N（1-萘基）乙二胺盐酸盐溶液（NED）；（5）5μg/mL 亚硝酸钠标准溶液。
四、实验步骤1、酶液提取称取新鲜植物叶片 05g，剪碎后放入研钵中，加入 5mL 01mol/L pH 75 的磷酸缓冲液，在冰浴中研磨成匀浆。
将匀浆转移至离心管中，在4℃下以 10000r/min 离心 15min，上清液即为酶提取液。
2、反应体系设置取两支刻度试管，分别标记为对照管（CK）和测定管（T）。
对照管：加入 1mL 01mol/L pH 75 的磷酸缓冲液和 1mL 02mol/L KNO₃溶液。
测定管：加入 1mL 酶提取液和 1mL 02mol/L KNO₃溶液。
将两支试管置于 30℃恒温水浴锅中保温 30min。
3、终止反应保温结束后，向对照管和测定管中分别加入 1mL 磺胺溶液和 1mL NED 溶液，摇匀，以终止反应。
浙江农业学报Acta Agriculturae Zhejiangensis19(3):160~163,2007黄瓜硝酸还原酶cDNA片段的克隆及其在缺氮胁迫下的表达毛伟华1,2,龚亚明3,夏晓剑1,周艳虹1,喻景权1,*(1浙江大学园艺系,农业部园艺植物生长发育与生物技术重点开放实验室,浙江杭州310029;2浙江大学分析测试中心,浙江杭州310029;3浙江省农业科学院蔬菜研究所,浙江杭州310021)摘 要:以黄瓜叶片总RNA为模板,应用逆转录 聚合酶链式反应(RT PCR),首次扩增出黄瓜硝酸还原酶(NR)cDNA部分片段。
经过测序和同源性分析表明:该基因片段长度为395bp,与GenBank上所登录的笋瓜NR基因同源性达89%,根据所测序列推导该片段由131个氨基酸残基组成。
进一步检测其在缺氮胁迫下的活性和表达变化,结果表明缺氮胁迫下硝酸还原酶的活性和表达都明显下降,推测黄瓜NR在转录水平上调节其活性。
关键词:黄瓜;硝酸还原酶;RT PCR;序列分析;基因表达;缺氮胁迫中图分类号:S642.2 文献标识码:A文章编号:1004-1524(2007)03-0160-04Cloning of a cD NA fragment of nitrate reductase(NR)gene in cucumber and its ex pression analysis under nitrogen deficiency stressMAO Wei hua1,2,GONG Ya ming3,XI A Xiao jian1,ZHOU Yan hong1,YU Jing quan1,*(1Department of H orticulture,Zhe jiang University,Ke y Laboratory of Horticultural Plant Growth De velopment and Biotech nology o f Agricultural Ministry,H ang z hou310029,China;2Center o f A na lysis and Measure ment,Zhejiang University,H ang z hou310029,China;3I nstitute of H orticu lture,Zhe j iang A cademy o f Agricultu ral Sciences,H an gzhou310021,China)Abstract:A cDNA fragment encoding nitrate reductase(NR)was amplified by reverse polymerase chain reaction(RT PCR)with total RNA extracted from the leaf of cucumber.Sequencing and homology analysi s revealed that the gene frag men t was395bp in length and shared up to89%similarity wi th NR gene from winter squash.The deduced amino acid se quence for the fragment was composed of131amino acid residues.Further analysi s of changes in enzymatic activi ty and transcript level demonstrated that NR expression and activi ty declined significantly under ni trogen deficient condition.The results suggested that the cucumber NR activity was regulated at the mRNA level.Key words:cucumber;ni trate reductase;RT PCR;seq uence analysis;gene expression;nitrogen deficiency硝酸盐是大多数植物的主要氮源。
