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硝酸还原酶活性测定实验报告硝酸还原酶活性测定实验报告引言：硝酸还原酶是一种重要的酶类，在生物体内负责将硝酸盐还原为亚硝酸盐。
硝酸还原酶活性的测定对于研究生物体对硝酸盐的代谢和环境污染物的检测具有重要意义。
本实验旨在探究硝酸还原酶的活性测定方法，并通过实验验证其可行性和准确性。
材料与方法：1. 实验材料：- 0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH 7.0）- 0.1 mol/L 硝酸钠溶液- 0.1 mol/L 硫酸铵溶液- 1% 硫胺素溶液- 10% 硝酸盐还原酶提取液- 10% 硝酸盐还原酶抑制剂- 2% 硝酸盐还原酶底物溶液- 0.1 mol/L 硫酸铵铵铁硫氰化物溶液- 0.1 mol/L 醋酸溶液- 蒸馏水2. 实验仪器：- 分光光度计- 定量移液器- 离心机- 恒温水浴槽- 试管架- 显微镜实验步骤：1. 提取硝酸盐还原酶：a. 取一定量的样品（如细胞或组织），加入磷酸盐缓冲液，用搅拌器充分破碎。
b. 将破碎后的样品转移至离心管中，以12000 rpm离心10分钟。
c. 取上清液，即为硝酸盐还原酶提取液。
2. 硝酸还原酶活性测定：a. 准备一组空白对照组，加入相同体积的磷酸盐缓冲液代替硝酸盐还原酶提取液。
b. 准备一组实验组，加入一定体积的硝酸盐还原酶提取液。
c. 分别加入一定体积的硝酸钠溶液、硫酸铵溶液、硫胺素溶液和硝酸盐还原酶底物溶液。
d. 在恒温水浴槽中，将反应体系恒温30分钟。
e. 加入硝酸盐还原酶抑制剂停止反应。
f. 加入硫酸铵铵铁硫氰化物溶液，使反应产生红色沉淀。
g. 加入醋酸溶液，混匀后离心10分钟。
h. 取上清液，以分光光度计测定其吸光度。
结果与讨论：通过实验测定，我们得到了一组吸光度数据。
根据吸光度与硝酸还原酶活性之间的关系，我们可以计算出样品中硝酸还原酶的活性。
在本实验中，我们采用了硫酸铵铵铁硫氰化物法测定硝酸还原酶活性。
该方法利用硝酸还原酶将硝酸盐还原为亚硝酸盐，再与硫酸铵铵铁硫氰化物反应生成红色沉淀。
植物体内硝酸还原酶活性的测定目的意义：硝酸还原酶是植物氮代谢中十分重要的一个酶，植物从土壤吸收硝酸盐后，首先催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，才能进一步转化变成有机含氮化合物。
在生产中可根据植物体内硝酸还原酶的活性变化，来确定氮肥的合理用量以及植物的氮素营养状况。
一、实验原理在酸性条件下，亚硝酸盐与重氮试剂对—氨基苯磺酸（或对—苯磺酰胺）及偶联试剂α-萘基乙烯二胺反应生成红色偶氮化合物。
红色偶氮化合物的颜色在2~3h内稳定，并在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定。
二、材料、设备及试剂1、材料川芎叶片、根茎和根。
2、设备冷冻离心机、分光光度计、天平、冰箱、恒温水浴锅、研钵、移液管、剪刀、离心管。
3、试剂(1) 0.1mol/L PH7.5磷酸缓冲液称取30.0905g Na2HPO4·12H2O和2.4965g NaH2PO4·2H2O 加去离子水溶后，定至1L；0.1mol/L KNO3溶液称取2.5275g KNO3溶于250mL 0.1mol/L PH7.5磷酸缓冲液中；（避光保存）0.025mol/L PH 8.7的磷酸缓冲液称取8.8640g Na2HPO4·12H2O和0.0570g K2HPO4·3H2O（很易吸水变潮）溶于1L去离子水中；(2) 亚硝酸钠标准溶液：准备称取分析纯NaNO20.9857g 溶于无离子水后定容至1000mL，然后再吸取5ml 定溶至1000mL，即为含亚硝态氮的1μg/mL的标准液。
(3) 1%磺胺溶液：1.0g无水对氨基苯磺酸溶于100mL 3mol/L HCl 中(25mL浓盐酸加水定容至100mL即为3mol/L HCl)；（注：磺胺比较难容，定容后最好用超声波促进溶解。
应避光保存！）(4) 0.02%萘基乙烯胺溶液：0.02g萘基乙烯胺溶于100mL无离子水中，贮于棕色瓶中。
(5) 提取缓冲液：0.1211g半胱胺酸、0.0372g EDTA溶于100mL 0.025mol/L PH 8.7的磷酸缓冲液中。
植物生理研究技术实验报告实验二硝酸还原酶活性的测定硝酸还原酶的诱导与活体测定硝酸还原酶的诱导与活体测定一、实验目的硝酸还原酶是一种诱导酶，广泛地存在于高等植物的根、茎、叶等组织中，它是植物氮素代谢中一个非常重要的酶，此酶还直接影响到土壤中无机氮的利用率，从而对植物的生长、发育以及产量和品质产生影响。
所以，作物栽培中，有人认为此酶活性的大小，可作为作物产量的生理指标。
本实验通过磺胺(或对氨基苯磺酸)比色法测定硝酸还原酶的活性，来了解植物生长发育期间氮素的营养水平，为合理施肥提供科学依据。
二、实验原理硝酸还原酶是植物氮素代谢作用中的关键性酶，与作物吸收和利用氮肥有关。
它作用于N03-使之还原为NO2-：N03-+NADH+H+→NO2-+NAD++H20产生的NO2-可以从组织内渗透到外界溶液中，并积累在溶液中，测定反应溶液中NO2-含量的增加，即表现该酶活性的大小。
这种方法简单易行，在一般条件下都能做到。
NO2-含量的测定用磺胺比色法。
在酸性条件下，对氨基苯磺酰胺与NO2-形成重氮盐，再与a一萘胺形成红色的偶氮染料化合物。
反应液的酸度大则增加重氮化作用的速度，但降低偶联作用的速度，颜色比较稳定。
增加温度可以增加反应速度，但降低重氮盐的稳定度，所以反应需要在相同条件下进行。
这种方法非常灵敏，能测定每毫升含0.5µg的NaNO2。
硝酸还原酶活性的测定可分为活体法和离体法。
活体法步骤简单，适合快速、多组测定。
离体法复杂，但重复性较好。
本次实验学习活体法对硝酸还原酶进行测定。
三、实验材料、设备和试剂1．实验材料小麦叶片2．设备(1)分光光度计(2)真空泵(或注射器) (3)天平(4)移液管(5)试管(6)离心管3．试剂(1)0．1 mol·L-1磷酸缓冲液，pH7.5。
贮备液A：称分析纯磷酸二氢钠(NaH2PO4)2.78 g，配成100mL，即成0.2 mol·L-1NaH2P04溶液；贮备液B：称Na2HPO4·12H2O 7.17 g，配成100 mL，即成0.2 mol·L-1 Na2HPO4溶液；用时取贮备液A 16 mL，贮备液B 84 mL混合，用蒸馏水稀释至200 mL，即成为0.1 mol·L-1的磷酸缓冲液。
硝酸还原酶活性的测定实验报告一、实验目的硝酸还原酶（NR）是植物氮代谢中的关键酶之一，其活性的高低与植物氮素利用效率密切相关。
本实验旨在掌握硝酸还原酶活性的测定方法，了解不同植物材料或不同处理条件下硝酸还原酶活性的差异，为进一步研究植物氮代谢机制和氮素营养调控提供依据。
二、实验原理硝酸还原酶能够催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐。
在一定条件下，产生的亚硝酸盐量与硝酸还原酶活性成正比。
通过测定反应体系中亚硝酸盐的含量，可以间接反映硝酸还原酶的活性。
本实验采用磺胺比色法测定亚硝酸盐含量。
在酸性条件下，亚硝酸盐与磺胺发生重氮化反应，生成重氮盐，再与 N（1-萘基）乙二胺盐酸盐（NED）偶联，形成红色偶氮化合物。
该化合物在 540nm 波长处有最大吸收峰，其吸光度与亚硝酸盐含量成正比。
三、实验材料、仪器与试剂1、实验材料选取新鲜的植物叶片，如小麦、玉米、大豆等。
2、仪器分光光度计、离心机、恒温水浴锅、移液器、研钵、容量瓶、刻度试管等。
3、试剂（1）01mol/L pH 75 的磷酸缓冲液；（2）02mol/L KNO₃溶液；（3）1%磺胺溶液（磺胺溶于 30%乙酸中）；（4）002% N（1-萘基）乙二胺盐酸盐溶液（NED）；（5）5μg/mL 亚硝酸钠标准溶液。
四、实验步骤1、酶液提取称取新鲜植物叶片 05g，剪碎后放入研钵中，加入 5mL 01mol/L pH 75 的磷酸缓冲液，在冰浴中研磨成匀浆。
将匀浆转移至离心管中，在4℃下以 10000r/min 离心 15min，上清液即为酶提取液。
2、反应体系设置取两支刻度试管，分别标记为对照管（CK）和测定管（T）。
对照管：加入 1mL 01mol/L pH 75 的磷酸缓冲液和 1mL 02mol/L KNO₃溶液。
测定管：加入 1mL 酶提取液和 1mL 02mol/L KNO₃溶液。
将两支试管置于 30℃恒温水浴锅中保温 30min。
3、终止反应保温结束后，向对照管和测定管中分别加入 1mL 磺胺溶液和 1mL NED 溶液，摇匀，以终止反应。
浙江农业学报Acta Agriculturae Zhejiangensis19(3):160~163,2007黄瓜硝酸还原酶cDNA片段的克隆及其在缺氮胁迫下的表达毛伟华1,2,龚亚明3,夏晓剑1,周艳虹1,喻景权1,*(1浙江大学园艺系,农业部园艺植物生长发育与生物技术重点开放实验室,浙江杭州310029;2浙江大学分析测试中心,浙江杭州310029;3浙江省农业科学院蔬菜研究所,浙江杭州310021)摘 要:以黄瓜叶片总RNA为模板,应用逆转录 聚合酶链式反应(RT PCR),首次扩增出黄瓜硝酸还原酶(NR)cDNA部分片段。
经过测序和同源性分析表明:该基因片段长度为395bp,与GenBank上所登录的笋瓜NR基因同源性达89%,根据所测序列推导该片段由131个氨基酸残基组成。
进一步检测其在缺氮胁迫下的活性和表达变化,结果表明缺氮胁迫下硝酸还原酶的活性和表达都明显下降,推测黄瓜NR在转录水平上调节其活性。
关键词:黄瓜;硝酸还原酶;RT PCR;序列分析;基因表达;缺氮胁迫中图分类号:S642.2 文献标识码:A文章编号:1004-1524(2007)03-0160-04Cloning of a cD NA fragment of nitrate reductase(NR)gene in cucumber and its ex pression analysis under nitrogen deficiency stressMAO Wei hua1,2,GONG Ya ming3,XI A Xiao jian1,ZHOU Yan hong1,YU Jing quan1,*(1Department of H orticulture,Zhe jiang University,Ke y Laboratory of Horticultural Plant Growth De velopment and Biotech nology o f Agricultural Ministry,H ang z hou310029,China;2Center o f A na lysis and Measure ment,Zhejiang University,H ang z hou310029,China;3I nstitute of H orticu lture,Zhe j iang A cademy o f Agricultu ral Sciences,H an gzhou310021,China)Abstract:A cDNA fragment encoding nitrate reductase(NR)was amplified by reverse polymerase chain reaction(RT PCR)with total RNA extracted from the leaf of cucumber.Sequencing and homology analysi s revealed that the gene frag men t was395bp in length and shared up to89%similarity wi th NR gene from winter squash.The deduced amino acid se quence for the fragment was composed of131amino acid residues.Further analysi s of changes in enzymatic activi ty and transcript level demonstrated that NR expression and activi ty declined significantly under ni trogen deficient condition.The results suggested that the cucumber NR activity was regulated at the mRNA level.Key words:cucumber;ni trate reductase;RT PCR;seq uence analysis;gene expression;nitrogen deficiency硝酸盐是大多数植物的主要氮源。
拟南芥提高硝酸还原酶表达的基因调控机制研究拟南芥是一种广泛应用于生物学研究中的模式植物，其基因组信息已经得到完整测序。
近年来，在农业生产和环境保护等领域，拟南芥的研究越发重要。
其中，拟南芥硝酸还原酶表达调控机制的研究是一个热点课题。
硝酸还原酶是拟南芥中重要的氮代谢酶，参与植物对硝酸盐的吸收和利用。
因此，研究硝酸还原酶表达调控机制对于深入了解拟南芥生长发育和氮素代谢具有重要意义。
目前，已经有许多研究表明，多种途径和环境因素都能够影响硝酸还原酶的表达水平。
生长素调控硝酸还原酶表达生长素作为植物生长发育的重要激素，其对硝酸还原酶表达水平的影响备受关注。
研究表明，生长素受体TIR1（Transport Inhibitor Response 1）可以促进拟南芥硝酸还原酶的表达。
在硝酸盐存在的条件下，硝酸盐可与TIR1结合形成复合物，从而促进硝酸还原酶基因NIA1的表达。
除此之外，生长素还可以通过调节拟南芥中微量元素的吸收和利用，进而影响硝酸还原酶表达。
研究表明，施用微量元素如锌、铁等能够增强拟南芥硝酸还原酶的表达，并提高其对硝酸盐的吸收效率。
光周期调控硝酸还原酶表达光周期是植物生长发育的重要环境因素之一，在拟南芥硝酸还原酶表达调控中也具有重要作用。
研究表明，长日照处理能够促进拟南芥硝酸还原酶的表达，而短日照则能够抑制其表达。
长短日照对硝酸还原酶表达的影响与FT（FLOWERING LOCUS T）基因相关。
在长日照条件下，FT基因表达上升，从而促进硝酸还原酶的表达。
短日照条件下，FT基因表达下降，导致硝酸还原酶表达水平下降。
此外，FT的表达还与SPL （SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE）家族的转录因子有关，这一机制也参与了硝酸还原酶表达的调控。
其他因素调控硝酸还原酶表达除以上因素外，拟南芥硝酸还原酶的表达还受到其他因素的影响。
例如，干旱、盐碱、温度等环境因素均能够影响硝酸还原酶表达水平；植物内源因子如ADA2b、HAT4、VIP1等也参与了调控硝酸还原酶的表达机制。
硝酸还原酶活性测定实验报告硝酸还原酶（nitrate reductase）是峰莱斯郎（Pierre van Laerzem）和卡尔·诺顿·塞尔西格（Carl Norton Searcy）于1943年发现的一种负责将硝酸还原为亚硝酸的酶。
该酶在许多生物体中都很常见，包括细菌、真菌、植物和动物等。
硝酸还原酶在土壤中特别重要，因为它可以将植物的主要氮源硝酸盐还原为植物可以利用的亚硝酸盐。
本实验旨在测定硝酸还原酶活性，从而了解该酶在样本中的含量及其催化亚硝酸盐的能力。
下面将详细介绍实验步骤和结果。
实验步骤：1. 取样本：从实验样本中获取合适的样品，如土壤样品、植物组织等。
2. 制备样品提取液：将样品加入合适的缓冲液中（一般为磷酸盐缓冲液），并进行均匀混合。
3. 离心：离心样品提取液，以去除悬浮的杂质及固体颗粒。
4. 超声处理：用超声波仪器对样品进行超声处理，破坏细胞结构，释放出硝酸还原酶。
5. 萃取：将样品提取液进行适度的萃取，以得到含有硝酸还原酶的萃取液。
6. 酶活性分析：将萃取液与适量的硝酸盐和辅助酶（如辅酶、酶辅酶等）混合，并在适合的温度和pH条件下孵育，一段时间后停止反应。
7. 颜色反应：使用格里希法或其他适当的方法，在反应停止后通过颜色反应测定亚硝酸盐的生成量。
亚硝酸盐的浓度与硝酸还原酶活性成正比。
8. 计算硝酸还原酶活性：根据样品的反应结果和标准曲线，计算出硝酸还原酶的活性。
实验结果：实验结果应包括标本中硝酸还原酶的活性以及对照组的活性值。
通常，对照组是以无酶萃取物为基准进行分析。
硝酸还原酶活性的测定单位为μmol/min/g（或μmol/h/g）。
讨论和结论：根据实验结果，可以比较不同样本之间的硝酸还原酶活性。
较高的活性值表明样本中含有较高水平的硝酸还原酶。
这可以用来评估土壤氮素转化能力、植物对硝酸盐的吸收能力等。
同时，本实验的成功与否也与实验流程相连。
在实验中，合适的采样技术、样品提取和超声处理等步骤对保证提取液中酶的完整性和活性至关重要。
菠菜硝酸还原酶基因的克隆与原核表达程祖锌;何海华;黄志伟;许明;黄昕颖;郑金贵【摘要】利用RT-PCR技术从低富集硝酸盐的菠菜品种中克隆得到硝酸还原酶(NR)基因,并进行了同源性分析；构建该基因的原核表达载体pET-NR,转入大肠埃希菌BL21(DE3)中,用IPTG进行诱导表达,为深入研究并揭示菠菜的硝酸盐富集机制奠定了基础.结果表明:获得的NR基因包含完整的开放阅读框(2 781 bp),编码926个氨基酸,与菠菜、甜菜NR核苷酸序列的同源性分别为99％、80％,与其氨基酸序列的相同性分别为99％、86％.SDS-PAGE电泳显示重组菌经IPTG诱导表达出104 ku左右的蛋白质,与预期大小一致.【期刊名称】《江苏农业科学》【年(卷),期】2012(040)012【总页数】4页(P19-22)【关键词】菠菜;硝酸还原酶;基因克隆;原核表达【作者】程祖锌;何海华;黄志伟;许明;黄昕颖;郑金贵【作者单位】福建农林大学农产品品质研究所,福建福州350002【正文语种】中文【中图分类】Q781硝酸盐是强致癌物亚硝胺的前体，过量摄入会诱发消化器官的癌变，严重危害人类健康。
人体摄入的硝酸盐大多来自蔬菜，叶菜类蔬菜属于易富集硝酸盐的作物，特别是喜氮类蔬菜(如菠菜)，是人们摄入硝酸盐的主要来源之一[1]。
硝酸还原酶(nitrate reductase，NR)是NO3-同化步骤中的第一个酶，也是整个硝态氮同化过程的关键酶，能将硝酸盐还原成无毒的NO2-。
提高蔬菜中的硝酸还原酶活性，不仅可以降低蔬菜硝酸盐的含量，还可以增加同等施肥条件下蔬菜的产量，提高肥料的利用率[2]。
利用基因工程技术提高蔬菜中的硝酸还原酶活性，降低叶片的硝酸盐含量，越来越受到育种家的重视。
有研究表明，硝酸还原酶基因的过表达可提高烟草和大白菜叶片中的硝酸还原酶活性，并降低硝酸盐含量[3-4]。
目前，科学家已相继在水稻[5]、棉花[6]、烟草[7]、马铃薯[8]、番茄[9]等多种植物中克隆了硝酸还原酶基因。
两个水稻硝酸还原酶基因的克隆及其在不同环境刺激下的表达分析赵丽华;豆献英;赵志光;蔡伟明【期刊名称】《华北农学报》【年(卷),期】2010(025)006【摘要】克隆并分析了水稻中两个可能的硝酸还原酶基因在多种非生物胁迫和重力刺激下的表达变化.AK102363(OsNR1)和AKl02178(OsNR2)是水稻中两个可能的硝酸还原酶基因.在盐胁迫处理下,两基因均下调表达.OsNR1在100 mmol/L NaCl处理24 h时表达下调最显著,而OsNR2也是在100 mmol/L NaCl处理24 h时表达下调最显著.用15%PEG模拟干旱处理,两基因表达下调,24 h时差异最显著.低温处理24 h后,基因OsNR1同样下调表达.不同浓度的NO供体SNP处理,两基因均受诱导而上调表达,在0.1 mmol/L的SNP处理12 h时表达量最高.向重性刺激处理0.5 h后基因OsNRl在地上部基部下部分表达高于在地上部基部上部分的表达.在处理6 h时地上部基部上下两侧表达量的差异达到最大.【总页数】7页(P57-63)【作者】赵丽华;豆献英;赵志光;蔡伟明【作者单位】兰州大学,生命科学学院,甘肃,兰州,730000;中国科学院,上海生命科学研究院,植物生理生态研究所,上海,200032;中国科学院,上海生命科学研究院,植物生理生态研究所,上海,200032;兰州大学,生命科学学院,甘肃,兰州,730000;中国科学院,上海生命科学研究院,植物生理生态研究所,上海,200032【正文语种】中文【中图分类】Q78【相关文献】1.缢蛏天然抗性相关巨噬蛋白2(Sc-Nramp2)基因克隆及其在副溶血弧菌刺激下的表达分析 [J], 林德海;刘晨珊;董迎辉;何琳;林志华2.青蛤(Cyclina sinensis)IκB基因的克隆及其在鳗弧菌(Vibrio anguillarum)刺激下的表达分析 [J], 魏星;张海静;潘宝平3.斑节对虾cyclin G2基因克隆及不同刺激下的表达分析 [J], 谢波波;郭松;傅明骏;赵超;杨其彬;焦宗垚;邱丽华4.青蛤(Cyclina sinensis)IKK基因的克隆及其在鳗弧菌(Vibrio anguillarum)刺激下的表达分析 [J], 侯梓园;高姗;潘宝平;闫春财5.青蛤(Cyclina sinensis)ERK基因的克隆及其在Poly I:C刺激下的表达分析 [J], 侯梓园;石雅峰;姚远;潘宝平;闫春财因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
硝酸还原酶研究进展探索摘要：硝酸还原酶在硝酸盐的同化作用中扮演着重要角色，能将进入植物体内的no3-还原为no2-，进一步在亚硝酸还原酶的作用下还原为氨，是陆生植物氮素代谢中的一个关键酶，它的活性高低直接影响到植物对土壤中硝态氮素的利用，影响作物的产量和品质。
文章分析了硝酸还原酶的特性及调控机理，阐述了硝酸还原酶的提取、纯化及一些基本特性，并表述了结构基因表达调控的最新进展，这些研究对于提高氮肥利用率，提高作物产量和品质具有重要意义。
关键词：硝酸还原酶植物氮代谢调控研究进展硝酸还原酶（nitrate reductase，nr）是高等植物氮代谢的关键酶。
植物的氮源主要是无机氮化物，而无机氮化物中又以铵盐和硝酸盐为主。
植物吸收铵盐后可直接用于氨基酸的合成，而吸收了硝酸盐，则必须通过硝酸还原酶进行代谢还原才能被植物利用，所以硝酸还原酶对植物氮营养是非常重要的。
硝酸还原酶是一种诱导酶，通常在有no3-存在时，会诱导硝酸还原酶的活性。
经过光照，硝酸还原酶活性也会大大提高，同时，光照还能通过加强植物对硝酸盐的吸收而提高硝酸还原酶活性。
在农业生产中，大量使用化肥特别是氮肥所引起的养分利用效率下降以及生产成本提高和水土污染等问题已经引起了人们的普遍关注，因此近年来硝酸还原酶活性的研究一直是个热点。
本文综述了硝酸还原酶对植物氮代谢调控的研究进展，以期为氮代谢和植物营养研究提供一些借鉴。
一、硝酸还原酶活性的调控（一）硝酸还原酶的基因调控植物硝酸还原酶的调控包括该酶基因的表达、蛋白的合成和降解及短期的活化/非活化（activation/inactivation）机制。
光和硝酸盐可以诱导硝酸还原酶基因的表达、酶蛋白和辅酶的合成及全酶的装配。
用细胞突变体的方法已从烟草、大麦等植物中得到了两类硝酸还原酶突变体，钼辅因子基因突变型和脱辅基蛋白基因突变型，它们的杂种细胞又可恢复硝酸还原酶活力，表明它们的基因型是互补的。
米勒的烟草硝酸还原酶突变体杂交试验结果指出：硝酸还原酶受到两个不连锁基因的控制，它们就是酶的脱辅基蛋白结构基因；谢拉德等指出小麦中7b和7d两条染色体参与硝酸还原酶活力的调节。
