病毒的鸡胚培养
一、目的
掌握病毒鸡胚接种、收获、HA试验方法和原理
二、实验内容
1、种蛋选择、消毒与孵化：种蛋为健康未免疫ND疫苗、受精率为90﹪以上的新鲜种蛋。15g高锰酸钾、30mL甲醛/m3熏蒸消毒30分钟，气室向上38.5-39℃
孵化，相对湿度60-70%。每2小时翻番一次。
2、画蛋与打孔：孵化9-11日龄鸡胚，暗室内画出气室边缘和胚头位置。于胚头
一侧气室边缘上方0.5cm处打孔。
3、接种与封孔：NDV Lasota种毒以灭菌生理盐水作一定倍数稀释（20倍）,尿
囊腔内接种0.1ml/胚，以融化的石蜡封孔，继续孵化，不翻蛋。每日照蛋一次，
弃去72h内死亡鸡胚。至120h全部取出于4℃冰箱过夜。
4、收毒：无菌操作打开气室部位蛋壳，撕开壳膜、尿囊膜和羊膜,吸出尿囊液，
观察鸡胚肉眼变化。
5、HA效价测定：原理。1%鸡RBC制备：采取3只青年公鸡血液，抗凝，以生理
盐水离心洗涤3次，制成1%RBC悬液。血凝试验按下表操作。
病毒鸡胚培养
病毒培养可用动物接种、鸡胚培养和组织培养法。鸡胚接种培养是病毒学
的重要方法之一，来自禽类的病毒，均可在鸡胚中繁殖，哺乳动物的病毒如蓝舌
病病毒、流感病毒等也可在鸡胚中增殖。目前鸡胚尤其是SPF、鸡胚被广泛利用于分离病毒、制造疫苗和抗原等，其来源丰富，操作简便。除病毒外，衣原体、
立克次氏体也可用鸡胚来培养，衣原体可在鸡胚卵黄囊繁殖，致死鸡胚；部分立
克次氏体也可在卵黄囊中繁殖。
[目的要求]
(1)掌握鸡胚的孵化过程和不同日龄鸡胚的接种途径和接种方法。
(2)掌握新城疫病毒在鸡胚尿囊腔增殖过程，掌握接毒和收毒的方法。
[实验材料]
白壳鸡胚、孵化箱、1mL注射器、蛋架、新城疫工系和Ⅱ系弱毒苗等。 [实验准备]
1．鸡胚的选择和孵化应选健康无病鸡群或SPF鸡群的新鲜受精蛋。为便于照蛋
观察，以来航鸡蛋或其他白壳蛋为好。用孵卵箱孵化，要特别注意温度、湿度和
翻蛋。孵化条件一般选择相对湿度为60％，最低温度36℃，一般37．5℃。每
1 鸡胚培养法（病毒分离培养）
鸡胚是发育的机体，适合许多人类和动物病毒及立克次体的生长增值，常用于痘类病毒、粘液病毒、和疱疹病毒的分离、鉴定、抗原准备、疫苗生产以及病毒性质等方面的研究。鸡胚培养病毒，常用的接种途径包括绒毛尿囊膜，尿囊腔、羊膜腔以及卵黄囊接种四种。根据不同病毒，不同实验目的以及不同来源的标本，选择不同的途径接种鸡胚进行培养，即可达到分离培养病毒和传代病毒的目的。本片主要介绍尿囊腔和羊膜腔两种接种途径在病毒分离培养和传代中的应用。
鸡胚的接种方法、孵育及收获
一、 仪器和器材
SPF鸡卵或鸡胚、二级生物安全柜、孵卵箱或恒温箱、检卵灯、照蛋灯、开卵钻、卵盘、1ml、1次注射器、医用胶布、液体石蜡、无菌镊子、巴氏吸管、15 ml无菌离心管、试管架、96孔微量反应板、加样槽、移液器、75%酒精、生理盐水等。
二、 鸡胚的孵育
应选择保存温度在100左右，时间不超过10天，卵壳薄而色浅的鸡卵，用于鸡胚的孵育。特别脏的鸡卵需用清水清洗，用布擦干后孵育，干净的鸡卵不必做任何处理。 将鸡卵置于380C---390C孵卵箱，在孵卵箱底层盛水器中放入干净自来水，以保证鸡胚发育的湿度，病保持良好的通风，孵育至第四天，于检卵灯上检查鸡胚受精与否及发育情况。受精鸡卵可见清晰地血管小团和发育的鸡胚迹象，似蜘蛛壮，未受精鸡卵仅能看见模糊的卵黄黑影，无鸡胚迹象。在孵育过程中，应随时对鸡胚进行检查，淘汰濒死或已经死亡的鸡胚。若在恒温箱里孵育鸡胚，则应在恒温箱底层放入装满水的广口容器，并从孵育的第3天起，每天180度转到鸡胚1—2次，是鸡胚发育匀称。也可直接订购孵育9—11日龄的鸡胚。
如何判断鸡胚存活状态：1胎动：于检卵灯下可见活胎有明显的自然运动，但胎龄大于14天的胚胎，胎动不明显，甚至无胎动，死胎则无任何胎动，胎发红似出血样，有的呈现黑快。2血管：活胚可见清晰地血管，卵壳较薄者还可见血管的搏动。死胎血管模糊，成淤血带或淤血块。3绒毛尿囊膜发育界限：生活良好的胚胎可见密布血管的绒毛尿囊膜，与胚胎的另一面形成良好的界限 须将上面三个方面结合起来进行观察，如果胚胎活动呆滞或不能主动地运动，血管模糊扩张，或折断沉落，绒毛尿囊界限模糊，则可判断胚胎濒死或已经死亡。
病毒的鸡胚培养
一、目的要求
掌握鸡胚尿囊腔接种培养新城疫病毒的操作技术。
二、器材
1.鸡胚 应选用健康鸡群的受精蛋，接种鸡的鸡胚应无母源抗体，以免影响病毒在胚胎中的增殖。实验用的鸡胚多采用9—10日龄的活胚。
2.接种材料 新城疫I系疫苗
3.各种器械 孵卵器、照蛋箱、蛋架、打孔器、1ml结核菌素注射器、41/2号注射针头、镊子、3%碘酊、75%酒精棉球、铅笔、酒精灯、剪刀、眼科镊子、灭菌的疫苗瓶、灭菌滴管和固体石蜡等。
三、内容和方法
（一）接种前的准备
1.鸡胚的准备
本实验选择9—10日龄的鸡胚，在照蛋时以铅笔勾划出气室，于气室稍下方胚胎活跃而血管明显的区域中，在血管之间的间隙划上记号，作为接种部位；用0、 1%新洁尔灭把蛋壳搽洗干净并抹干，再以2%碘酊对接种部位进行消毒，用75%酒精再擦一遍，在接种定位出打孔，气室向上竖放于蛋架上。
2.病毒接种材料的准备
要分离培养的病毒材料应是无菌的，因此为达到材料无菌的目的，可在每ml接种物质中加青霉素和链霉素各100—500IU，置室温中1小时或冰箱中12—24小时处理。或经滤器除菌。
（二） 接种
绒毛尿囊腔内注射：用6号针头的1ml注射器吸取新城疫病毒材料，针头从已打好的小孔中向鸡胚方向插入0.5—-1cm,注入0、1ml （相当0、5羽份），再加氧化锌胶布贴封,再加融化的固体石蜡封口,放回孵化箱中进行孵化,每天翻蛋两次,照视一次.24小时内死亡的舍去。
（三）收获
新城疫I系病毒材料，在接种24—48小时即可收获。收获前应将鸡胚
置4度冰箱冷藏4小时或过夜，以免解剖时血管破裂。碘酒消毒蛋壳，用镊子去卵壳和尿囊膜，用吸头吸尿囊液于瓶内，可收集5-8ml，无菌检查，冰冻保存。
1 实验九 病毒的鸡胚培养
一、目的
掌握病毒鸡胚接种、收获、HA试验方法和原理
二、实验内容
1、种蛋选择、消毒与孵化：种蛋为健康未免疫ND疫苗、受精率为90﹪以上的新鮮种蛋。15g高锰酸钾、30mL甲醛/m3熏蒸消毒30分钟，气室向上38.5-39℃孵化，相对湿度60-70%。每2小时翻番一次。
2、画蛋与打孔：孵化9-11日龄鸡胚，暗室内画出气室边缘和胚头位置。于胚头一侧气室边缘上方0.5cm处打孔。
3、接种与封孔：NDV Lasota种毒以灭菌生理盐水作一定倍数稀释,尿囊腔内接种0.1ml/胚，以融化的石蜡封孔，继续孵化，不翻蛋。每日照蛋一次，弃去72h内死亡鸡胚。至120h全部取出于4℃冰箱过夜。
4、收毒：无菌操作打开气室部位蛋壳，撕开壳膜、尿囊膜和羊膜,吸出尿囊液，观察鸡胚肉眼变化。
5、HA效价测定：原理。1%鸡RBC制备：采取3只青年公鸡血液，抗凝，以生理盐水离心洗涤3次，制成1%RBC悬液。血凝试验按下表操作。
孔 号 1 2 3 ……… 11 12
稀释倍数 21 22 23 ……… 211
盐 水 0.025 0.025 0.025 ……… 0.025 0.025
收获尿囊液 0.025 0.025 0.025 ……… 0.025
1% RBC 0.025 0.025 0.025 ……… 0.025 0.025
弃0.025 2 振荡混匀15秒，37C感作10-20分钟。
三、实验报告内容
1、 病毒鸡胚培养的注意事项。
2、 鸡胚尿囊液NDV HA效价结果，原理，并用原理说明HA效价测定结果含义与意义。
