Bop基因的克隆

B op基因的克隆摘要目的：通过选择克隆型载体pUC18为构建重组质粒的载体，质粒pUC19中的细菌视紫红质基因bop为目的基因，利用分子生物学相关技术构建pUC18－bop重组质粒，再将该重组质粒导入到大肠杆菌DH5α细胞中进行克隆，通过琼脂糖凝胶电泳鉴定，初步证实该实验是否实现了视紫红质目的基因（即bop基因）的克隆。

方法：用小量制备质粒DNA的方法分别提取克隆型质粒载体pUC18和含细菌视紫红质基因bop的质粒pUC19，分别用限制性内切酶BamH I和Hind Ⅲ进行双酶切后,在紫外透视仪上取酶切后pUC18质粒和Bop基因，在T4连接酶作用下，16℃恒温水浴过夜连接，再将连接后的产物导入到制备好的感受态细胞，将转化后的产物接种到含氨苄青霉素（0.1g/ml）LB琼脂平板，37℃恒温培养箱培养过夜，最后，挑取单菌落经PCR 扩增后，进行1％琼脂糖凝胶电泳筛选阳性单克隆。

结果：质粒DNA琼脂糖凝胶电泳检测后，初步断定已分离提纯出不含蛋白质、RNA、脂质等杂质PUC18、PUC19质粒。

酶切产物经电泳检测发现，PUC18只产生了一条荧光带，PUC19产生了两条荧光带，初步断定光带1是PUC18,光带2是Bop基因，可利用泳道②上的光带和泳道③上的光带1进行连接实验。

转化结果检测显示可直接从已形成菌落的平板中挑取单菌落进行PCR扩增实验。

最后，PCR回收产物检测，两泳道中的光带都位于1000-2000之间，与预测的bop基因电泳所处位置相符，初步断定bop 基因已成功转入到宿主细胞。

结论：成功构建pUC18－bop重组细菌视紫红质基因，经特异性PCR扩增鉴定，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，初步证实该实验实现了视紫红质目的基因（即bop 基因）的克隆。

关键词：Bop基因；pUC18质粒；琼脂糖凝胶电泳；PCR聚合酶链反应1 前言1.1Bop基因视紫红质是一种含视黄醛的膜蛋白，它位于动物视觉器官的感光细胞中，接受光讯号转变为电讯号。

20世纪60年代末到70年代初，Oesterhelt和Stoeckenius在盐生盐杆菌(Hbt．salinarum)内发现了一种含视黄醛、对光敏感的膜蛋白，命名为细菌视紫红质(bacteriorhodopsin，BR)[1]。

细菌视紫红质基因（bacteriorhodopsin gene ,简称bop 基因)是编码盐沼盐杆菌(Halobactrium salinarium)紫膜中细菌视紫红质分子(bacteriorhodopsin,BR)的一段DNA 序列，阅读框（ORF）全长786bp。

成熟的BR蛋白,分子量为26x103,在细胞膜上形成7个跨膜的α螺旋,一个BR分子含有一个视黄醛生色团,视黄醛分子通过希夫碱基与BR蛋白G螺旋第216位赖氨酸的ε氨基结合[2],BR的功能是一个质子泵，在吸收光子，向细胞外泵出质子后，其分子发生电荷分离和光致变色现象，并伴随有K、L、M、N、O等一系列光循环中间态的形成。

由于BR分子具有良好的热稳定性(140℃),高的空间分辨率 (>5000线/mm),高的光灵度(103 J/cm2),高的循环次数(>106次)，作为存储介质很轻，体积小，可防辐射，价格便宜，容易提取等优点，并且可以采用多种方法获得性能更为优良的突变体，因而被公认为是目前最有前途的生物分子光学器件材料[5][6]。

BR蛋白是一个光驱动质子泵，在光照条件下能将质子从膜内传递到膜外，产生跨膜的质子梯度，将光能转变为电化学势能，从而提供生命活动所需之能量。

它可以作为研究细胞膜受体蛋白的模型，有助于阐明药物与人体细胞靶受体以及信号传导途径中的受体与信号的相互作用机制；它的光驱动质子泵功能可应用在光电转换器，信号储存和光学检测等很多方面；随着生物化学、生物物理学和光学等学科的发展，BR的光致变色及光电响应特性在太阳能电池、人工视网膜、光信息存储、神经网络、生物芯片等应用领域具有广泛的应用前景，自从上世纪60年代末人们从嗜盐菌中发现BR以来，BR已成为研究得最热和最透彻的膜蛋白之一。

1.2Bop基因克隆原理1.2.1培养基配制、灭菌、无菌接种原理介绍培养基配制时，必须用PH试纸调节至7.0左右，保证细菌或细胞的正常生长，灭菌时必须注意保证灭菌锅内的水位，保证灭菌锅有一定的温度和压力，灭菌锅不能漏气，同时要注意将灭菌锅中的冷空气排放干净，无菌操作要在超净工作台上进行，同时需要点酒精灯，在酒精灯附近接种等，注意不要在无菌的台面晃动有菌的衣袖等。

1.2.2 SDS碱裂解法制备小量质粒[7]碱裂解法是较常用的提取方法。

十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性。

用SDS处理细菌后，会导致细菌细胞破裂，释放出质粒DNA和染色体DNA，两种DNA在强碱环境里都会变性，但是由于质粒和主染色体的拓扑结构不同，当溶液的PH降低至近乎中性的时候，质粒的两条小分子单链可迅速恢复双链结构，但主染色体却难以复性，离心时，大部分主染色体、细胞碎片和杂质等一起被沉淀，而可溶性的质粒DNA却留在上清液中，再由异丙醇沉淀、乙醇洗涤可以得到纯化的质粒DNA。

1.2.3 琼脂糖凝胶电泳原理琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。

琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。

蛋白质和核酸会根据pH不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此跑的速度不同，根据这个原理可将其分开。

电泳缓冲液的pH在6～9之间，离子强度0.02～0.05为最适。

常用1%的琼脂糖作为电泳支持物。

琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，而且它制备容易，分离范围广。

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。

DNA 分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。

由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。

经过电泳可以将不同分子量的DNA分离，EB插入到DNA双链中，在紫外灯的照射下发出红色或橙色的荧光，由此显示凝胶带中的DNA条带。

1.2.4 DNA的酶切与连接质粒载体和外源DNA片段经相同的限制性内切酶（限制性内切酶是一类能够识别双链DNA 分子中特定的核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶，限制性内切酶Ⅱ识别具有回文对称性质的核苷酸序列，并在识别序列内或侧旁特异性位点切开DNA片段，产生平齐末端和带单链突出端的DNA片段）切割后，形成相同的平末端或粘性末端，在DNA连接酶的催化下，外源DNA片段插入质粒载体，形成重组子。

1.2.5感受态细胞的原理感受态细胞是指受体细胞处于容易吸收外源DNA的一种生理状态（competence）,可通过物理化学方法诱导形成也可以自然形成（自然感受态），在基因工程中常用CaCl2诱导法。

体外重组的DNA分子按一定的方式导入宿主细胞，通过宿主细胞的复制而使目的基因得到大量扩增，重组分子导入适宜的宿主细胞的过程就是转化。

在基因克隆技术中，转化（transformation）是指质粒DNA或以它为载体构建的重组质粒导入宿主细胞的过程。

1.2.6质粒DNA的转化转化活性是检测质粒生物活性的重要指标。

转化由氯化钙诱导的感受态细胞的基本原理是：利用低温（0℃）和氯化钙（CaCl2）低渗溶液的理化处理使宿主细胞处于容易吸收外源DNA的状态，此时菌体膨胀成球形，细胞壁和膜的通透性增强。

重组DNA与Ca2＋,形成的羟基-磷酸钙复合物粘附于菌体表面，经42℃短暂的热冲击处理后，粘附表面的重组DNA被吸收进入宿主细胞，然后在营养丰富的培养基上生长1小时左右细胞形态复原，进入增殖分裂期。

1.2.7 PCR原理聚合酶链式反应PCR是一种级联反复循环的DNA合成反应过程，由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：在利用TaqDNA聚合酶进行PCR反应时，变性温度一般为94-95模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍.PCR反应体系中的七中基本成分：热稳定的DNA 聚合酶、一对寡核苷酸引物、四种脱氧核苷三磷酸（dNTP）、二价阳离子（Mg2＋）、维持PH体系的缓冲值、一价阳离子（K＋）和模版DNA。

根据文献[3,4]，设计两对端引物，引物含酶切位点，用于扩增目的基因bop基因。

上游引物为：5’’下游引物为：5’3’(小写部分为保护碱基，框中分分别为Bam HⅠ和Hin d Ⅲ酶切位点。

)1.2.8 转化子的筛选以大肠杆菌为供体细胞时，常采用抗生素抗性基因作为选择性标记。

本实验以含有氨苄青霉素的固体LB培养基进行筛选，氨苄青霉素可同一些与细胞壁合成有关的酶类结合并抑制其活性，阻止菌体生长。

由于pUC18载体上含氨苄青霉素抗性基因，可编码一种周质酶，即ß-内酰胺酶，该酶分泌到大肠杆菌的周质空间中，并催化ß-内酰胺环水解，从而解除氨苄青霉素对细胞生长的抑制。

1.3实验的目的和意义采用重组DNA技术，在体外将含有Bop基因的DNA片段同能够自我复制的载体PUC18质粒DNA连接，然后将其转入到宿主细胞进行表达。

为了探讨细菌视紫红质基因克隆工程，构建含该基因的重组质粒，本实验以含pUC18和pUC19－bop两种质粒为生物材料，通过克隆型载体pUC18为构建重组质粒的载体，选择质粒pUC19中的细菌视紫红质基因bop为目的基因，利用分子生物学相关技术构建pUC18-bop重组质粒，为细菌视紫红质基因的测序及细菌视紫红质基因的表达等后续实验做准备。

基因工程(gene engineering)又称离体DNA重组技术(recombinant DNA technology)。

该技术在分子水平上进行遗传操作，即将任何生物体(供体)的基因或基因组提取出来，或通过人工合成的目的基因，按照人们预先设计的蓝图，插入质粒或病毒复制子(载体)，而形成一杂合分子(DNA重组体)，然后将重组体转移到复制子所属的宿主生物体中复制，或转移到另一种生物体(受体)的细胞内(可以是原核细胞也可以是真核细胞)，使之能在受体细胞内遗传并使受体细胞获得新的性状。