下载文档原格式
^8S^•研究报告・拟南芥(Arabidopsis thaliana)DWF4基因克隆、生物学信息分析及过表达载体构建韦春，杨莉琴，秦利军(贵州大学农业生物工程研究院/山地植物资源保护与种质创新省部共建教育部重点实验室/生命科学学院,贵阳550025)摘要BRs(Brassinostcroids)是植物体内一种重要的类固醇激素，具有十分重要的生理功能。
DWF4是BRs生物合成的关键限速酶，显著影响BRs在植物体中的含量。
本研究以拟南芥(Araiidopsis thaliana)为材料，利用同源克隆技术从A.thaliana cDNA中克隆到全长为1542bp的特异性条带，测序结果表明该条带为ADWF4基因；生物学信息分析显示该基因可编码513个氨基酸(amino acid,aa),Proscalc在线预测该蛋白为亲水性蛋白，且SOPM分析表明DWF4蛋白含有c-螺旋(alpha-helix)、/?-折叠(beta-fold)、/?-转角(beta-angle)等多个二级结构。
同时，研究还构建了含AtDWF4基因的超量表达载体pRI201-RdI)wf4,并遗传转化烟草K326,已获得抗性愈伤组织及抗性芽。
本研究为进一步探究过表达ADWF4基因对烟草形态及抗逆胁迫能力的影响提供理想的实验材料。
关键词：拟南芥；BRs；DWF4基因；过表达载体构建DOI：10.16590,/ki.1001-4705.2021.01.001中图分类号：Q943.2文献标志码：A文章编号：1001-4705(2021)01-0001-06Cloning and Bioinformatics Analysis of Arabidopsis thaliana DWF4Gene and Construction of ADWF4-Overexpression VectorWEI Chun,YANG Liqin,QIN Lijun(Institute of Agro-Bioengineering,Key laboratory of Plant.Resources Conservation andGermplasm Innovation in Mountainous Region(Ministry of Education)and College ofLife Sciences,Guizhou University,Guiyang550025,China)Abstract：BRs(Brassinosteroids)is an important steroid hormone in plants,which has very importantphysiological functions.The DWF4is a key rate-limiting enzymein BRs biosynthesis,which significantly affects the content of BRs in plants.In this study,Arabidopsis thaliana was used as the material to clone the objective band.The results showed that a1542bp band from A.thaliana cDNA wascloned and the sequencing results showed that the band was AtDWF4gene.Bioinformatics analysisshowed that this gene encoded513amino acid(aa),and Proscale online predicted that this proteinwas a hydrophilic protein,and SOPM analysis showed that DWF4protein contained multiple secondary structures,including tough-helix,format-fold,and format-angle,etc.Meanwhile,the overexpression vector pRI201-RdDwf4containing AtDWF4gene was also constructed,and the resistant callus and resistant buds were obtained after the genetic transformation of tobacco variety K326.ThispaperprovidesanidealexperimentalmaterialforfurtherstudyingtheinfluenceofoverexpressionofAtDWF4on tobacco morphology and stress tolerance.Key words:Arabidopsis thaliana;BRs;DWF4gene;overexpression vector construction收稿日期2020-08-26基金项目贵州省科技计划项目“因草钾离子通道蛋白及BR对植株抗非生物胁迫研究”(黔科合LH：2016]7449号)；贵大人才培育项目“由菜素内酯介导的烟草抗TMV机理研究”(黔科合平台人才：2018]5781号)作者简介：韦春(1995—),女(壮族)广西河池人；在读硕士，主要从事植物基因工程相关研究(E-mail：*****************).通讯作者：秦利军(1982—)男(汉族)贵州遵义人；博士，副教授，硕士生导师，研究方向：植物生物技术与植物基因工程(E-nail：leequine_chin@126.com)。
基因图位克隆的策略与途径基因图位克隆的策略与途径拟南芥(Arabidopsis thaliana)是⼀种模式植物，具有基因组⼩(125Mbp ) 、⽣长周期短等特点，⽽且基因组测序差不多完成 (The Arabidopsis Genomic Initiative, 2000)。
同时，拟南芥属⼗字花科(Cruciferae),具有⾼等植物的⼀样特点，拟南芥研究中所取得成果专门容易⽤于其它⾼等植物包括农作物的研究，产⽣重⼤的经济效益，专门是⼗字花科中还有许多重要的经济作物，与⼈类的⽣产⽣活紧密有关，因此⽬前拟南芥的研究越来越多地受到国际植物学及各国政府的重视。
基因(gene是遗传物质的最差不多单位，也是所有⽣命活动的基础。
不论要揭⽰某个基因的功能,依旧要改变某个基因的功能,都必须第⼀将所要研究的基因克隆出来。
特定基因的克隆是整个基因⼯程或分⼦⽣物学的起点。
本⽂就基因克隆的⼏种常⽤⽅法介绍如下。
1 、图位克隆Map-based cloning, also known as positional cloning, first proposed b y Alan Coulson of the University of Cambridge in 1986, Gene isolated b y this method is based on functional genes in the genome has a relativel y stable loci, in the use of genetic linkage analysis or chromosomal abnor malities of separate groups will queue into the chromosome of a specific location, By constructing high-density molecular linkage map, to find mole cular markers tightly linked with the aimed gene, continued to narrow the candidate region and then clone the gene and to clarify its function and biochemical mechanisms.⽤该⽅法分离基因是按照⽬的基因在染⾊体上的位置进⾏的，⽆需预先明⽩基因的DNA 序列，也⽆需预先明⽩其表达产物的有关信息。
拟南芥表皮毛突变体abt2基因克隆及功能研究
王岩;张翔;安丽君
【期刊名称】《江苏农业科学》
【年(卷),期】2018(046)015
【摘要】植物表皮毛广泛地分布在陆生植物地上部分,是植物表皮组织的一种特化结构,具有多种重要的生物学功能.通过甲基磺酸乙酯(ethylmethanesulphonate,EMS)诱变获得了1个莲座叶表皮毛分支明显增加的突变体,将其命名为aberrant trichome 2(abt2).遗传分析结果表明,abt2突变体是由细胞核单基因控制的隐性突变.图位克隆和遗传互作结果显示,abt2的表型是由KAKTUS(KAK)基因第+6881处核苷酸发生突变所导致的,这为进一步研究植物表皮毛的发育调控机制提供新的遗传材料.
【总页数】5页(P23-27)
【作者】王岩;张翔;安丽君
【作者单位】旱区逆境生物学国家重点实验室 /西北农林科技大学生命科学学院,陕西杨凌 712100;旱区逆境生物学国家重点实验室 /西北农林科技大学生命科学学院,陕西杨凌 712100;旱区逆境生物学国家重点实验室 /西北农林科技大学生命科学学院,陕西杨凌 712100
【正文语种】中文
【中图分类】Q785
【相关文献】
1.拟南芥Mo敏感突变体基因克隆及功能分析
2.拟南芥抗旱突变体 cs m1-1的鉴定及其基因克隆
3.拟南芥衰老相关突变体lsm3的鉴定和基因克隆
4.拟南芥表皮毛发育突变体abt3-1的基因定位及表型分析
5.拟南芥干旱相关突变体的远红外筛选及基因克隆
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
拟南芥基因的克隆与功能分析研究随着生命科学的不断发展和深入，基因在生物学中扮演着非常重要的角色。
基因的研究可以揭示生命的本质和演化历程，也有助于阐明疾病的发生机理、揭示人类的不同特性及其遗传规律。
而在基因研究中，拟南芥（Arabidopsis thaliana）是非常重要的模式植物，因为其基因组已经被完全解析，是目前为止研究最广泛的环境适应植物之一。
拟南芥基因的克隆是研究拟南芥基因功能的基础，也是了解拟南芥基因调控及表达的方式的重要方法。
克隆基因一般包含三步：筛选源，提取基因，插入载体。
其中，筛选源是根据已有的序列信息，设计特异性引物，将所需的基因片段扩增出来。
提取基因则需要一些特殊的技术和设备，高纯度的DNA是成功克隆的前提条件。
插入载体则是将扩增出来的目标基因插到载体上，形成所需的重组DNA，进一步研究基因功能。
在拟南芥基因的克隆中，应注意设计合理的启动子、选择正确的载体和检验克隆的准确性等问题。
在拟南芥基因的功能研究中，基因敲除或突变分析是常见的方法之一。
基因敲除即是通过RNA干扰技术或CRISPR/Cas9基因编辑技术将目标基因转录水平降低或消除，进而探究该基因在生命活动中的作用。
突变分析则是通过人工诱导或大规模筛选，寻找具有特定表型的突变体，以此推测该基因在复杂环境中的生物学功能。
这些方法的特点是操作简单、可重复性强，且能够直接揭示基因的生物学重要性。
另外，表达谱分析也是研究拟南芥基因功能的重要方法。
通过高通量测序技术和差异表达分析，可以分析不同组织、不同时期、不同生物地位下基因的表达情况及其调控机制，从而了解基因在整个生长发育过程中的调控关系。
表达谱分析还可以揭示各种生物学过程中参与的基因网络，从而为基因互作网络的构建、复杂环境下基因调控及基因功能的深入研究提供重要依据。
最近几年的研究表明，拟南芥基因在植物进化、环境适应以及生命体系发育等方面起着非常重要的作用。
例如，SLR1基因在拟南芥花器官的形态发育中扮演着重要角色。
拟南芥基因的图位克隆技术浙江大学生命科学学院徐冰浙江杭州3100291 国内外研究现状拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种模式植物，具有基因组小（125 Mbp）、生长周期短等特点，而且基因组测序已经完成（The Arabidopsis Genomic Initiative, 2000）。
同时，拟南芥属十字花科（Cruciferae），具有高等植物的一般特点，拟南芥研究中所取得成果很容易用于其它高等植物包括农作物的研究，产生重大的经济效益，特别是十字花科中还有许多重要的经济作物，与人类的生产生活密切相关，因此目前拟南芥的研究越来越多地受到国际植物学及各国ZF的重视。
从遗传学的观点来看，基因克隆的途径可概括为正向遗传学和反向遗传学两种。
正向遗传学途径指的是通过被克隆基因的产物或表现型突变去进行；反向遗传学途径则指的是依据被克隆基因在染色体上的位置来实现。
虽然一些模式生物（如拟南芥）的基因组测序已经完成，但还有40%的基因（在拟南芥中）的功能还是未知的。
图1 图位克隆所需努力的比较（1995年和2002年）（Jander等，2002）图位克隆（map-based cloning）又称定位克隆（positional cloning），1986年首先由剑桥大学的Alan Coulson提出（Coulson等，1986），用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先知道基因的DNA序列，也无需预先知道其表达产物的有关信息。
它是通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础。
近几年来随着拟南芥基因组测序工作的完成，各种分子标记的日趋丰富和各种数据库的完善，在拟南芥中克隆一个基因所需要的努力已经大大减少了（图1）。
目前完成整个拟南芥的图位克隆过程大约需要一年时间。
在这个过程中，我们从筛选突变体开始，逐渐找到和表型相关的基因。
这和反向遗传学的方法正好相反。
拟南芥基因克隆及原核表达
要进行拟南芥 AtTCP4 基因的克隆和原核表达，可以按照以下步骤进行：
1. 获得目标基因序列：首先，需要获取拟南芥AtTCP4 基因的序列。
可以通过NCBI数据库或其他相关数据库搜索到目标基因的序列信息。
2. 购买引物：根据目标基因的序列设计引物，包括扩增该基因的起始引物和终止引物。
引物的设计应考虑适当的启动子和终止子，以便后续进行克隆和表达。
3. PCR扩增：使用目标基因的cDNA作为模板，使用合适的引物进行PCR扩增。
根据PCR反应条件，设置适当的温度和时间来实现特异性扩增。
扩增产物可以经过琼脂糖凝胶电泳检测，确认特定大小的DNA片段。
4. 克隆：将PCR扩增产物纯化，并将其连接到适当的质粒载体中。
质粒载体应包含合适的启动子、标签和抗生素抗性基因等元素。
使用大肠杆菌等宿主细胞进行转化，并培养在含有适当抗生素的培养基上，筛选出含有目标基因的克隆。
5. DNA测序：对选定的克隆进行DNA测序确认，以确保插入的基因片段没有错义突变或其他错误。
6. 准备原核表达系统：准备用于原核表达的适当宿主细胞（如大肠杆菌）并转化克隆。
选择合适的表达载体，并确保其包含适当的诱导子和选择标记。
7. 表达与纯化：培养转化后含有重组质粒的菌落，并在适当的条件下诱导表达目标基因。
收集细菌并通过细菌破碎、离心和层析等技术进行纯化。
以上步骤提供了一般的克隆和原核表达流程。
具体操作可能会因实验室和应用的不同而有所差异。
在进行实验之前，建议查阅相关的研究论文和方法手册，以获取更详细和具体的操作步骤和技术指导。
首都师范大学硕士学位论文拟南芥NO敏感突变体nob的鉴定及突变基因的初步定位姓名：***申请学位级别：硕士专业：分子细胞生物学指导教师：***20040601摘要ＮＯ是一种生物活性小分子，是～种普遍存在于原生动物、细菌、酵母和动、植物中的信号分子。
近年来的研究发现，它不仅在血管松弛、神经传导以及先天性免疫反应等动物生理代谢过程中是一种关键的第二信使，而且在植物中也起着非常重要的作用，是植物生长和发育的调节分子，能够对生物性和非生物性的胁迫作出反应，并且在植物体的抗病防御反应中也是一种重要的信号物质；更重要的是，近年来发现ＮＯ与各种植物激素的功能都有着重叠，因此有人预测ＮＯ可能是植物体内的一种新型激素。
本实验以拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）为材料，利用Ｔ－ＤＮＡ插入诱变和ＮＯ胁迫选择（ＳＮＰ为ＮＯ供体）的方法，筛选到一种对ＮＯ敏感且叶片丛生的突变体ｎｏｂ。
在ＮＯ作用下，ｎｏｂ突变体根的生长比野生型的受到更明显的抑制，说明突变体比野生型对ＮＯ更加敏感，其原因可能是Ｔ－ＤＮＡ插入诱变破坏了某个与激素代谢相关的基因，使得ｎｏｂ突变体内源激素的平衡失调，根的生长和发育受ＮＯ的影响更大。
故ｎｏｂ突变体的获得为研究ＮＯ和其它激素之间的关系提供了一个有效的工具。
本实验采用下胚轴切段的方法研究了外源ＮＯ和ＩＡＡ对不定根发生的影响，发现ＮＯ与ＩＡＡ都促进ｎｏｂ突变体不定根的发根数，而且都抑制不定根的发根长度，其作用效果是一致的：并且还发现植株的内源ＩＡＡ可能对外源ＮＯ和ＩＡＡ对不定根发生的影响起着抑制作用。
我们推测该突变体的内源ＮＯ浓度要高于野生型。
此外，遗传分析证明该突变是单基因隐性突变。
利用图位克隆技术，已将突变基因初步定位于拟南芥的第五条染色体上。
关键词：ＮＯ拟南芥突变体ＩＡＡ图位克隆ＳＳＬＰＡｂｓｔｒａｃｔＮｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅ（Ｎ０），ａｂｉｏａｃｔｉｖｅｍｏｌｅｃｕｌｅ，ｉｓｏｎｅｏｆｔｈｅｅａｒｌｉｅｓｔａｎｄｍｏｓｔｗｉｄｅｓｐｒｅａｄｓｉｇｎａｌｉｎｇｍｏｌｅｃｕｌｅｓｉｎｌｉｖｉｎｇｏｒｇａｎｉｓｍｓ．Ｉｎｐｌａｎｔｓ，ＮＯｈａｓｒｅｃｅｎｔｌｙｂｅｅｎｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄｔｏｂｅｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｇｒｏｗｔｈａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｉｎｔｈｅｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏａｂｉｏｔｉｃａｎｄｂｉｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓｅｓａｎｄｉｔｉｓａｋｅｙｓｉｇｎａｌｍｅｓｓｅｎｇｅｒｉｎｄｉｓｅａｓｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎｐｌａｎｔｓ．Ｍｏｒｅｉｍｐｏｒｔａｎｔ。
基因图位克隆的策略与途径拟南芥Ting Bao was revised on January 6, 20021拟南芥基因克隆的策略与途径拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种模式植物，具有基因组小（125 Mbp）、生长周期短等特点，而且基因组测序已经完成（The Arabidopsis Genomic Initiative, 2000）。
同时，拟南芥属十字花科（Cruciferae），具有高等植物的一般特点，拟南芥研究中所取得成果很容易用于其它高等植物包括农作物的研究，产生重大的经济效益，特别是十字花科中还有许多重要的经济作物，与人类的生产生活密切相关，因此目前拟南芥的研究越来越多地受到国际植物学及各国政府的重视。
基因(gene)是遗传物质的最基本单位,也是所有生命活动的基础。
不论要揭示某个基因的功能,还是要改变某个基因的功能,都必须首先将所要研究的基因克隆出来。
特定基因的克隆是整个基因工程或分子生物学的起点。
本文就基因克隆的几种常用方法介绍如下。
1、图位克隆Map-based cloning, also known as positional cloning, first proposed by Alan Coulson of the University of Cambridge in 1986, Gene isolated by this method is based on functional genes in the genome has a relatively stable loci, in the use of genetic linkage analysis or chromosomal abnormalities of separate groups will queue into the chromosome of a specific location, By constructing high-density molecular linkage map, to find molecular markers tightly linked with the aimed gene, continued to narrow the candidate region and then clone the gene and to clarify its function and biochemical mechanisms.图位（map-based clonig）又称克隆（positoinal cloning），1986年首先由剑桥大学的Alan Coulson提出。
用该方法分离基因是根据功能基因在中都有相对较稳定的基因座，在利用分离群体的遗传连锁分析或将基因伫到染色体的1个具体位置的基础上，通过构建高密度的分子连锁图，找到与目的基因紧密连锁的分子标记，不断缩小候选区域进而克隆该基因，并阐明其功能和生化。
用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先知道基因的DNA序列，也无需预先知道其表达产物的有关信息。
它是通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础。
近几年来随着拟南芥基因组测序工作的完成，各种分子标记的日趋丰富和各种数据库的完善，在拟南芥中克隆一个基因所需要的努力已经大大减少了（图1）。
目前完成整个拟南芥的图位克隆过程大约需要一年时间。
在这个过程中，我们从筛选突变体开始，逐渐找到和表型相关的基因。
这和反向遗传学（reverse genetics）的方法正好相反。
图位克隆能实现，关键在于全基因组测序计划的完成和各种分子标记的发现。
这些数据被储存在专门的数据库中（表1）（Lukowitz等， 2000）。
在拟南芥中的图位克隆，在很大程度上得益于对Col-0生态型测序的完成，因为它是在研究拟南芥时最常用的生态型。
实现基因图位克隆的关键是筛选与目标基因连锁的分子标记。
实质上，分子标记是一个特异的DNA片段或能够检出的等位基因，对其有效地利用即可达到图位克隆基因之目的。
迄今为止，已有几十种技术可用于分子标记的筛选（Wang等，2000）。
其中最为常用的是简单序列长度多态性（SSLPs）和单核苷酸多态性（SNPs）。
SSLP是基于PCR的分子标记，在拟南芥基因组中有较多分布，而且是共显性的，它的检测非常直接，但是我们需要设计引物来检测假定的SSLP标记；对SNPs标记的检测也比较直接，它是拟南芥不同生态型之间基因组中的单个核苷酸的差别，这些差别的核苷酸通常位于非编码区域（Peters等， 2003）。
最常见的用于检测SNPs标记的方法主要是剪切扩增多态性序列（CAPS），它也是基于PCR的。
另外，一种更为有效的方法衍生的CAPS（dCAPS）（Nam等，1989； Michaels 和 Amasino， 1998）可把任何已知的点突变作为分子标记，只要在PCR是引入不配对的引物，使扩增的序列在一个生态型中具有限制性酶切位点，而在另一生态型中没有，以形成多态性。
图位克隆法随着相关配套技术（序列数据库、分子标记等）的日渐成熟，许多拟南芥及一些农作物的基因已被成功的克隆（表2）。
本文拟对图位克隆的研究进展做一介绍，以期对植物遗传育种和分子生物学研究有所帮助。
2 图位克隆的一般过程因为有了拟南芥的基因组序列和高密度的遗传标记，图位克隆过程就变得相对直接。
图2例举了一种高效的拟南芥图位克隆方法。
从基于Col-0和L er 遗传背景的突变体出发，我们有可能在大约一年时间内找出与这个突变相关的基因，这其中主要耗时间的是五个植物（拟南芥）的生长周期（我们假定每个周期为两个月）。
作为作图过程的第一步，突变体植株将和另外一个生态型（Col-0或者L er）的植株杂交。
在大多数情况下，用于杂交的突变体植株是作为父本还是母本是没有关系的。
然后播种F1代种子。
在F1代植物的生长过程中，我们就有可能来对其表现型和基因型进行分析。
F1代植物的表型的出现或者消失将显示着我们所研究的突变是显性的还是隐性的。
最好通过对一些标记的分析来确认F1代植物是杂合体，而且在杂交过程中我们没有犯错误。
当然也有必要确认原来的生态型背景。
图2 图位克隆过程示意图（Jander等， 2002）F1代植物自交得到F2代种子，大约播种600个个体以进行突变基因的粗定位（first-pass mapping，图2）。
在其生长过程中，我们可确定其表型，大约有150个个体被认为是纯合体（在隐性突变的情况下是纯合突变体，在显性突变的情况下是纯合野生型）。
然后从这150个个体的叶子或者其它组织中制备DNA用于基因型分析。
起先用分布于拟南芥五条染色体上的25个标记（相邻的两个标记之间大约相距20 cM）进行分析，确定突变基因是和哪个或者哪几个标记是连锁的，然后用三点测交的方法来定义一个包含突变基因的大约20 cM的遗传间隔。
一旦这样的一个遗传间隔被定义之后，接下来的工作就是引入新的标记把这个间隔缩小到大约4 cM。
一般来说，利用150个F2代个体是在很大程度上能找到这样一个遗传间隔的，距离突变基因最近的两个分子标记将作为侧面标记而用于下面的进一步分析。
下一步我们将播种一个更大的F2代群体用于突变基因的精细定位（fine-resolution mapping，图2）。
最终目标是将包含突变基因的遗传间隔缩小到40 Kb甚至更小（这在拟南芥中大约是 cM）。
显然用于作图的F2代植物越多，就越能精确地定位突变基因。
一般需要3000~4000个F2代植物个体（包括粗定位时的600个F2代植物个体）来精确地定位突变基因。
但是也有很多图位克隆过程用了少于3000个F2代植物个体就成功地定位了突变基因（Lukowitz 等， 2000）。
但是这往往要冒因为作图群体不够大再一次种植F2代植物而延长整个作图过程的时间的风险。
在这个大约4 cM的遗传间隔内找到与突变更紧密连锁的分子标记，一般情况下能在突变两侧找到相距小于40 Kb的两个分子标记。
一旦这样的两个分子标记被找到之后，就可以通过测序来找到突变基因。
一种有效的方法是设计PCR引物来扩增覆盖这40 Kb的多个重叠的500 bp的片段。
将这些片段测序后拼接起来以得到整个40 Kb的序列，然后将它与野生型植物（Col-0或者L er）的序列进行比对，这就可以找到这个区域中的多个基因。
从一系列侯选基因中鉴定基因是定位克隆技术的最后一个关键环节。
现在最常用的方法是用含有目标基因的大片段克隆如BAC克隆或YAC克隆去筛选cDNA文库，并查询生物数据信息库，待找出侯选基因后，把这些侯选基因进行下列分析以确定目标基因：（1）精确定位法检查cDNA是否与目标基因共分离；（2）检查cDNA时空表达特点是否与表型一致；（3）测定cDNA序列，查询数据库，以了解该基因的功能；（4）筛选突变体文库，找出DNA序列上的变化及与功能的关系；（5）进行功能互补实验，通过转化突变体观察突变体表型是否恢复正常或发生预期的表型变化。
功能互补实验是最直接、最终鉴定基因的方法。
利用新兴的RNA干扰（RNAi）也可有效地确定目的基因。
同源克隆：生物的种、属之间编码基因序列的同源性高于非编码区的序列，基于此原理，在其他种属同源基因被克隆的前提下，构建cDNA文库或基因组文库，然后用已知分子高保守序列制备同源探针，经标记后从相应的文库中筛选阳性克隆，并经核酸序列分析鉴定所克隆的基因，当然在没有全同源探针的情况下，可以使用部分同源探针来筛选与探针序列相关但不完全相同的基因。
图位克隆同源克隆转座子标签表达序列标签(expressed sequence tags, EST)是从一个随机选择的cDNA克隆进行5′端和3′端单一次测序获得的短的cDNA部分序列, 代表一个完整基因的一部分。
DbEST，database EST 表达序列标签数据库。
1951年Barbara Mclintock首先在玉米中发现了控制元件，后来命名为转座元件或转座子(transposon)。
转座子是基因组中一段可移动的DNA序列，可以通过切割、重新整合等一系列过程从基因组的一个位置“跳跃”到另一个位置。
这一元件不仅可用于分析生物遗传进化上分子作用引起的一些现象，还为基因工程和分子生物学研究提供了强有力的工具，可以在不了解基因产物的生化性质和表达模式的情况下，分离克隆植物基因，即转座子标签(transposon tagging)，又称为转座子示踪法。
其原理是利用转座子的插入造成基因突变，以转座子序列为基础，从突变株的基因文库中筛选出带有此转座子的克隆，它必定含有与转座子序列相邻的突变基因的部分序列，再利用这部分序列从野生型基因文库中获得完整的基因〔1〕。
