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基因定位和图位克隆 ppt课件

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植物基因克隆的方法课件PPT

植物基因克隆的方法课件PPT
素合成酶基因。
技术支持：
差别筛选法（differential screening） 扣除杂交技术（subtractive hybridization） mRNA差异显示技术（ mRNA differential
display reverse transcription-PCR） 代表性差异显示（representational difference
1.2根据基因的表型突变互补功能
植物的许多基因与细菌或酵母的突变 能的mRNA序列,据此合成寡核苷酸探针从文
地分离了编码天麻抗真菌蛋白基因cDNA 记(EST)寻找新基上
◆ 此种方法只需检测基因表达库中每一cDNA的很短序列(9bp),建立基因表达图,根据基因表达图就可以发现新基因. 用植物偏爱的密码子，人工合成并克 1、筛选与目标基因连锁的分子标记
6、外显子的分离、鉴定
阳性克隆这些候选基因，再进行分离，时空 表达特点，同源性比较等分析确定目的基因。
定位克隆的优点和局限性
优点：不必知道基因产物的功能，也不需要
知道产生某表型的生化、生理和病理过程。 局限性：1、基因定位依赖分子标记。
未消失，发生转座的只是转座子的拷贝。 能的mRNA序列,据此合成寡核苷酸探针从文
1、筛选与目标基因连锁的分子标记 增，扩增的片段经纯化后连接到合适的
基因发生转座可引起插入突变，使插入位 3、构建目的基因区域跨叠克隆（contig）
常用载体：柯斯质粒、酵母人工染色体（YAC）、PI、BAC、PAC等。 要求分离一个纯度很高的蛋白质.
的隆插该入 基和因嵌。合来克隆置基因的。 基因失活并诱导产生突变型或在插入
常用载体：柯斯质粒、酵母人工染色体（YAC）、PI、BAC、PAC等。 能的mRNA序列,据此合成寡核苷酸探针从文

基因的图位克隆ppt课件

基因的图位克隆ppt课件

• G. Zhang et al等利用IR24和IRBB13杂交，得到的F2分离群体，利用BSA法，找 到了一个RAPD标记OPAC05，在抗病池和感病池之间有多态性。从而将 xa13定 位于OPAC05附近。
•
G. Zhang et al. 1996 , Theor Appl Genet 93:65 70
常发挥。
优点：目的明确，对由基因家族控制的相关形状，抑制表达能同 时降低此基因家族成员的功能；抑制表达和超表达是研究时空表 达的有力工具。
缺点：抑制表达和超表达会使相关基因的功能紊乱，常常很难判 断相关表型的改变是由于目标基因还是由于被紊乱的基因引起的。
葛莘. 高级植物分子生物学, 2004
•另外还有TILLING技术、芯片技术、比较基因组学、生物信息学……都被广泛的应 用于基因的克隆。
如果在xa13两侧都检测到有来自IR24的标记基因型， 则这个两个标记就是基因xa13的边界。
后来储朝晖博士，为了验证以上的结果，利用极端隐性分组分析法对来自IRBB13 和IR24杂交的250株极端抗病F2单株把 xa13 重新定位于S14003和RG163之间，同时 一个新发现的CAPS 标记E6a定位于标记RG136和xa13基因之间，从而以Ea6和 S14003作为构建物理图谱的起点。
• 3. 图位克隆和以 xa13为例介绍图位克隆的详细过程
• 原理：在减数分裂︱时期，同源染色体之间配对，非姊妹染色单体发生交换，与目
标基因距离越远，发生交换的频率就越大，距离越近，发生交换的频率就越小（遗传 学第三定律）。（王亚馥，戴灼华. 遗传学.1999，第三章：60-76）与基因发生最小交 换频率的两侧分子标记，就是与基因最紧密连锁的分子标记，这两个分子标记之间的 区段就是包含这个基因的目标区段。

基因定位常用的方法ppt课件

基因定位常用的方法ppt课件

4）原位杂交的步骤
制备中期染色体 DNA原位变性 变性 放射性或非放射性标记探针 杂交（在载玻片上） 洗膜 放射性标记：放射自显影 检测 非放射性标记：荧光染料与抗体或蛋白结合 记录杂交信号 结合染色体形态进行基因定位
DMD女性患者的核型
X染色体与常染色体易位时X染色体失活的结果
两个研究小组分别采用两种不同的方法克隆了DMD基因： 一组是通过X常染色体易位，克隆了该基因的一部分。 另一研究组使用有Xp21.1微小缺失的男孩的DNA，利用消减技术，获得了在正常X染色体存在而在这个男孩DNA中缺乏的DNA克隆片段。
遗传做图：是以研究家族的减数分裂，以了解两个基因分离趋势为基础来绘制基因座位间的距离，它表明基因之间连锁关系和相对距离，并以重组率来计算和表示，以厘摩（cM）为单位。 染色体定位：只把基因定位到某条染色体上。 细胞水平上的基因图又称细胞遗传图 区域定位：从细胞遗传学水平，用染色体显带等技术在光学显微镜下观察，将基因定位到染色体的具体区带。
5）荧光原位杂交 （florescence in situ hybridization，FISH）
用特殊荧光素（dig或Biotin）标记探针DNA（Nick translation 标记法），变性成单链后与变性后的染色体或细胞核靶DNA杂交。在荧光显微镜下观察并记录结果。 FISH 优点：可用来作基因或特定DNA片段的染色体区 域定位。 缺点：必须在已知探针的情况下方可进行。
HAT选择系统：
人的突变细胞株：缺乏HGPRT酶 小鼠细胞株：缺乏TK酶 两者融合培养于HAT培养基中 HAT培养基： H为次黄嘌呤，是HGPRT的底物，为DNA合成提供原料（核苷酸旁路合成原料） A可阻断正常的DNA合成（嘌呤及TMP合成受抑制） T在胸苷激酶（TK）的作用下生成胸腺嘧啶核苷酸，为DNA合成提供原料

基因定位与克隆PPT课件

基因定位与克隆PPT课件

基因分布在24种染色体上，它们在染色体上的位置可通过两
种制图方法来表示：
1、物理图谱(physical map)，即确定基因之间的绝对物
理学距离，通常用Mb(百万碱基对)或Kb(千碱基对)来表示
2、遗传图谱(genetic map)，即确定基因之间的遗传学
距离，用cM(centimorgen分摩)表示。
编辑版ppt
NLM8 G
体细胞杂种法
• 体细胞杂种通常由人和鼠的体细胞融合而成。这些 融合细胞在最初几代培养过程中具有选择性丢失人 类染色体趋势，而保留所有的鼠染色体。
• 保留在融合细胞中的染色体可以是多条，也可能只 有一条甚至某条染色体的一部分。
• 根据研究的需要可将含有不同人类染色体的人鼠杂 种细胞组合成人鼠杂种细胞板(hybrid panel)，结 合杂种细胞板和PCR的方法或基因剂量分析，或蛋 白质表达分析，可将相应的基因定位到特定的染色 体或染色体片段上，该杂种细胞板在人类基因定位 以及人类基因组计划中发挥过重要的作用。
• 染色体多态法（chromosome heteromorphism） • 染色体畸变法(chromosome abnormality) • 体细胞杂种法(somatic cell hybrids) • 染色体分类法(chromosome sorting ) • 原位杂交法（FISH） • 剂量分析法(dosage ananlysis) • 测序法（sequencing） • 家系分析法 （pedigree ananlysis）
编辑版ppt
13
连锁分析原理
生殖细胞在减数分裂时发生交换，一对同源染色体 上存在着两两相邻的基因座位，若两者之间距离较 远，发生交换的机会较多，则出现重组次数就多； 若两者之间距离较近，则重组机会较少。

图位克隆的基本原理和方法-PPT课件

图位克隆的基本原理和方法-PPT课件
7
将构建的BSA池分别用本室的255对在亲本ZH11/ZS97间存在多态性的SSR标 记进行PCR扩增，经过跑PAGE胶找到与目标性状紧密连锁的标记。
8
HL15(M )
HL15(W ) ZS97
ZH11
HL15(M ) HL15(W ) ZS97
ZH11
HL15(M) HL15(W) HY5(M) HY5(W) HY3(M) HY3(W) HY2(M) HY2(W) HY1(M) HY1(W) ZS97 ZH11
找到紧密连锁的分子标记之后我们就要进行一个“阳性”检测： 即检测这个找到的分子标记是不是真正的与目标性状连锁。 我们对F2代群体中随机选取一个200左右的小群体，将找到的分 子标记分别扩增这些样，看表型与基因型是否对应。 同时我们可以用这个小群体进行一个初步的基因定位。
9
一. 表型观察
Fine mapping
4
作图群体
将纯合突变体与ZS97进行杂交，对杂交的种子进行基 因型鉴定，找到杂合型种子（即种子能够发生分离）， 将杂合F1代种子种下去后就能得到F2代群体。
5
r/r
R/R
P1 纯合突变体
×
P2 ZS97
F1
R/r
F2
R/R
R/r
r/r
6
primary mapping method
Bulked Segregment Analysis：群组分离分析法。原理是将分 离群体(F2、BC1等)中的个体依据研究的目标性状(如抗病、 感病)分成两组，每一组取样8-15份，在每一组群体中将各个 体DNA等量（等浓度等体积）混合，形成两个DNA池(如抗 病池和感病池)。同时需要构建两个亲本（ZH11/ZS97）的 BSA池。由于分组时仅对目标性状进行选择，因此两个池间 理论上就应主要在目标基因区段存在差异。

图位克隆的基本原理和方法完整PPT

图位克隆的基本原理和方法完整PPT
找到候选基因后可对候选基因进行分析以排除非目标基因，可以通过比较扩增，测序，表达量检测及目标性状相关的生化和生理途径
等方法来排除。
BSA池。由于分组时仅对目标性状进行选择，因此两个池间 Functional analysis
primary mapping method and Mapping population
H AABA
AA
AA
A
将H 最后精A细体定A位D区N段BA在 等://Hri量ce. （A 等A浓度A 等体A 积B）混合，形成两个DNA池(如抗
SNPS标记:可以通过测序找到在ZH11/ZS97间存在单碱基差异的位点，或者找谢老师咨询。
病池和感病池)。同时需要构建两个亲本（ZH11/ZS97）的 同时需要构建两个亲本（ZH11/ZS97）的BSA池。
Qualitative traits
理论上就应主要在目标基因区段存在差异。
将构建的BSA池分别用本室的255对在亲本ZH11/ZS97间存在多态性的SSR标 记进行PCR扩增，经过跑PAGE胶找到与目标性状紧密连锁的标记。
HL15(M)
HL15(W)
ZS97
ZH11
HL15(M)
HL15(W)
ZS97
图位克隆的步骤：
Primary mapping Fine mapping Candidate gene
Complementation test Functional analysis
Primary mapping
primary mapping method and Mapping population
同时我们可以用这个小群体进行一个初步的基因定位。
一. 表型观察
Fine mapping

人类基因定位与克隆PPT课件

人类基因定位与克隆PPT课件

-
3
物理图谱是利用限制性内切酶将染色体切成片段，再根据重叠 序列确定片段间连接顺序，以及遗传标志之间物理距离〔碱基 对(bp) 或千碱基(kb)或兆碱基(Mb)〕的图谱。
以人类基因组物理图谱为例，它包括两层含义，一是获得分布 于整个基因组30 000个序列标志位点(STS，其定义是染色体定 位明确且可用PCR扩增的单拷贝序列)。将获得的目的基因的 cDNA克隆，进行测序，确定两端的cDNA序列，约200bp，设 计合成引物，并分别利用cDNA和基因组DNA作模板扩增；比较 并纯化特异带；利用STS制备放射性探针与基因组进行原位杂 交，使每隔100kb就有一个标志；
-
41
DNA指 纹
基因组中存在着多种重复序列，拷贝数从几个
到数十万个，可分为串联重复序列和分散重复序
列。根据个体重复序列拷贝的位置和数目的差异， 使 用 限 制 性 内 切 酶 ， 获 得 具 有 个 体 特 异 性 的 DNA 片段。可以作为亲缘关系或个人身份的鉴定。
绘制遗传连锁图的方法有很多，随着DNA多态性的开发， 使得可利用的遗传标志数目迅速扩增。早期使用的多态 性标志有RFLP(限制性酶切片段长度多态性)、RAPD(随 机引物扩增多态性DNA)、AFLP(扩增片段长度多态性)； 80年代后出现的有SSR(短串联重复序列，又称微卫 星)DNA遗传多态性分析和90年代发展的SNP(单个核苷 酸的多态性)分析。
2. 将以通过DNA序列分析确定导
致疾病的分子缺陷。
3.
绝大部分分子病、遗传性代谢缺陷（酶）病如白
化病（albinism）、苯丙酮尿症（phenylkeonuria， PKU）
和镰刀形细胞贫血病（sickle-cell disease）等，都是采取

图位克隆原理ppt课件

图位克隆原理ppt课件

交换次数 配子总数
×100%
3×2 + 7
= 19 × 2
×100% ≈34 cM
精选ppt
29
精选ppt
30
精选ppt
31
精选ppt
SSLPs 32
精选ppt
SSLPs 33
• 40.48% • 4.76%
• 20.00%
精选ppt
4.76% 12.5% 12.5% 36%
34
筛选 F2 代 短根 移栽
• 密度： 每 3.3kb 存在一个
精选ppt
9
精选ppt
SSLPs 10
•粗定位引物 精选ppt （更新） 11
•粗定位引物 精选ppt （混合） 12
精选ppt
13
精选ppt
14
父本染色体
F1
母本染色体
精选ppt
15
假设：
F1
Aa 突变位点
Bb Marker
突变为 隐性突变
精选ppt
• K14A17→MCE21 →MGD8 →MTO12 →MKP6 →MIG5 →MEB5 →MBG14 →MRC8
精选ppt
43
• STEP3: 把目标区域内的BAC名字分次键入 到AMP的Marker搜索栏
精选ppt
44
精选ppt
45
• 注意:
• 每个株系到精确定位后期可能用到数十上 百的MARKER，请将自己使用、订制过的 MARKER的相关资料清晰记录下来，便于 日后查看。
精选ppt
50
• 由于我们以短根为筛选突变体的指标，因 此下面提到的突变的基因都应该会导致幼
苗短根。
杂交F1代

实验七基因的图位克隆技术PPT课件

实验七基因的图位克隆技术PPT课件
第3页/共12页
标记1
基因
标记2
1
初步定位
标记1 3 基因 4 5 6 标记2
2 2
精细定位
3
BAC重叠群
4
BAC重叠群
5
6
第4页/共12页
第5页/共12页
亲本1 X 亲本2
F1
F2
1 23 4 56 789
100
gene
第6页/共12页
标记1
基因
标记2
1
初步定位
2 cM
1.2 cM
标记1
基因
图位克隆过程存在的问题：
1、需要有精确的遗传图谱； 2、遗传图谱上离目的基因很近的分子标记在物理图谱上还 相距甚远； 3、高等植物基因组极其复杂，存在大量重复序列，在实际 操作中会遇到走不动的难题。
第10页/共12页
第11页/共12页
感谢您的观看。
第12页/共12页
标记2
2
23
4 56
精细定位
0.02 cM 0.01 cM
第7页/共12页
标记1
基因
标记2
2
BAC重叠群
BAC Clone 基因1 基因2 基因3 基因4基因5 基因6 基因7
第8页/共12页
基因1 基因2 基因3 基因4基因5 基因6 基因7
转基因
突变体
单倍型分析
序列 - 功能
第9页/共12页
第2页/共12页
图位克隆的一般流程：
1. 建立目的基因的遗传分离群体 2. 找到与目的基因紧密连锁的分子标记 3. 用遗传图或物理作图将目的基因定位在染色体特群 7. 通过染色体步移或登陆，获得含有目标基因的大片段克隆 8. 通过亚克隆获得目标的小片段克隆 9. 测序获得候选基因碱基序列 10. 通过遗传转化和功能互补验证，最终确定目标基因的功能。
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5
2.理想的分子标记的界定
• 理想的分子标记必须达到以下几个要求： • (1)具有高的多态性； • (2)共显性遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型； • (3)能明确辨别等位基因； • (4)除特殊位点的标记外，要求分子标记均匀分布于整个基因组； • (5)选择中性（即无基因多效性）； • (6)检测手段简单、快速（如实验程序易自动化）； • (7)开发成本和使用成本尽量低廉； • (8)在实验室内和实验室间重复性好（便于数据交换）。
• 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你 是否会认为老师的教学方法需要改进？
• 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭
• “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我 笨，没有学问无颜见爹娘 ……”
• “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
1. 广泛使用的分子标记技术比较
标记技术 RFLP RAPD SCAR/CAPS AFLP SSR ISSR STS SRAP/EST IRAP/REMAP SNP
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7
• 当某个性状（基因）与某个（些）分子标记协同分离
时，表明这个性状（基因）与分子标记连锁。分子标
记与性状之间交换值的大小，即表示目标基因与分子
标记之间的距离，从而可将基因定位于分子图谱上。
分子标记克隆在质粒上，可以繁殖及保存。不同限制
性内切酶切割基因组DNA后，所切的片段类型不一样，
因此，限制性内切酶与分子标记组成不同组合进行研
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6
2.1 限制片段长度多态性
(RFLP ，Restriction Fragment Length Polymorphism)
• RFLP已被广泛用于基因组遗传图谱构建、基因定位以及生物进化 和分类的研究。RFLP是根据不同品种（个体）基因组的限制性内 切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插 入、缺失，导致酶切片段大小发生了变化，这种变化可以通过特 定探针杂交进行检测，从而可比较不同品种（个体）的DNA水平 的差异（即多态性），多个探针的比较可以确立生物的进化和分 类关系。所用的探针为来源于同种或不同种基因组DNA的克隆， 位于染色体的不同位点，从而可以作为一种分子标记(Mark)，构 建分子图谱。
第七章 基因定位和图位克隆
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1
一、主要分子标记分类
分
DNA杂交为基础
RFLP
子
标
PCR扩增
随机引物
RAPD、AFLP AP－PCR、ISSR
记
为基础
的
特异引物
SSR、STS、SCAR、CAPS SSCP、T
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2
精品资料
• 你怎么称呼老师？
究。常用的限制性内切酶一般是HindⅢ，
BamHⅠ,EcoRⅠ,EcoRV,XbaⅠ,而分子标记则有几个甚
至上千个。分子标记越多，则所构建的图谱就越饱和。
构建饱和图谱是RFLP研p究pt课的件 主要目标之一。
8
❖RFLP标记的特点
1) RFLP标记稳定可靠，检测不受环境条件和发育 阶段的影响。
2) RFLP标记在等位基因间是共显性的 。 3) 在非等位的RFLP标记之间不存在上位效应 。 4) RFLP标记源于基因组DNA自身的变异，在数
是否以PCR为基础 多态性
否
低/中
是
中/高
是
高
是
高
是
高
是
高
是
高
是
中
是
高
是
很高
遗传性
重复性
共显性
高
显性
低
共显性
高
显性
高
共显性
高
显性
高
共显性/显性 高
共显性
高
共显性
高
共显性/显性 高
自动化程度 低 中 中 中/高 中/高 中/高 中/高 中 中/高 高
使用成本 高 低 中 低 低 低 低 低 低 低
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11
• 通过对PCR产物检测即可检出基因组DNA的多 态性。分析时可用的引物数很大,虽然对每一个 引物而言其检测基因组DNA多态性的区域是有 限的,但是利用一系列引物则可以使检测区域几 乎覆盖整个基因组。因此RAPD可以对整个基 因组DNA进行多态性检测。另外，RAPD片段 克隆后可作为RFLP的分子标记进行作图分 析。
量上几乎不受限制。 ❖ 由于目前RFPL技术仍然昂贵而费力，操作复杂，
而 且 所 需 DNA 样 品 量 大 ， 对 于 涉 及 许 多 个 体 （200以上）的鉴定研究并不可取。
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9
2.2 随机扩增的多态性DNA (RAPD,Random amplified polymorphic DNA )
纯合体与杂合体的区别，标记本身也大多是完全显
性遗传；
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❖ RAPD技 术假阳性率高 ，在实验条件不很严格 的实验室，假阳性出现的机率更高；
❖ RAPD技术要求DNA纯度较高，对反应条件敏 感，重复性差；
❖对于实验已取得的标记，必须转化成其它类型 的标记，才能实现基因定位与丰富遗传图谱。
EB染色或放射性自显影来检测扩增产物DNA片段的多
态性,这些扩增产物DNA片段的多态性反映了基因组相
应区域的DNA多态性。
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10
• RAPD所用的一系列引物DNA序列各不相同，但对于 任一特异的引物，它同基因组DNA序列有其特异的结 合位点.这些特异的结合位点在基因组某些区域内的分 布如符合PCR扩增反应的条件，即引物在模板的两条 链上有互补位置，且引物3‘端相距在一定的长度范围 之内，就可扩增出DNA片段.因此如果基因组在这些区 域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变就可能导致这 些特定结合位点分布发生相应的变化，而使PCR产物 增加、缺少或发生分子量的改变。
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❖RAPD的特点：
➢ RAPD技术比RFLP简单，容易掌握。它既克服了同
工酶位点偏少的缺点，又避免了RFLP操作复杂的 弊端，更因其不需使用同位素进行分子杂交，从而 使得一般的实验室亦能操作。
❖ RAPD分子标记多为显性标记，只有少数可发展成
为共显性标记，提供的信息量有限，且掩盖了显性
• RAPD(Random amplified polymorphic DNA ，随机扩增
的多态性DNA) RAPD技术建立于PCR技术基础上,它是
利用一系列(通常数百个)不同的随机排列碱基顺序的寡
聚核苷酸单链(通常为10聚体)为引物,对所研究基因组
DNA进行PCR扩增.聚丙烯酰胺或琼脂糖电泳分离,经