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^8S^•研究报告・拟南芥(Arabidopsis thaliana)DWF4基因克隆、生物学信息分析及过表达载体构建韦春，杨莉琴，秦利军(贵州大学农业生物工程研究院/山地植物资源保护与种质创新省部共建教育部重点实验室/生命科学学院,贵阳550025)摘要BRs(Brassinostcroids)是植物体内一种重要的类固醇激素，具有十分重要的生理功能。
DWF4是BRs生物合成的关键限速酶，显著影响BRs在植物体中的含量。
本研究以拟南芥(Araiidopsis thaliana)为材料，利用同源克隆技术从A.thaliana cDNA中克隆到全长为1542bp的特异性条带，测序结果表明该条带为ADWF4基因；生物学信息分析显示该基因可编码513个氨基酸(amino acid,aa),Proscalc在线预测该蛋白为亲水性蛋白，且SOPM分析表明DWF4蛋白含有c-螺旋(alpha-helix)、/?-折叠(beta-fold)、/?-转角(beta-angle)等多个二级结构。
同时，研究还构建了含AtDWF4基因的超量表达载体pRI201-RdI)wf4,并遗传转化烟草K326,已获得抗性愈伤组织及抗性芽。
本研究为进一步探究过表达ADWF4基因对烟草形态及抗逆胁迫能力的影响提供理想的实验材料。
关键词：拟南芥；BRs；DWF4基因；过表达载体构建DOI：10.16590,/ki.1001-4705.2021.01.001中图分类号：Q943.2文献标志码：A文章编号：1001-4705(2021)01-0001-06Cloning and Bioinformatics Analysis of Arabidopsis thaliana DWF4Gene and Construction of ADWF4-Overexpression VectorWEI Chun,YANG Liqin,QIN Lijun(Institute of Agro-Bioengineering,Key laboratory of Plant.Resources Conservation andGermplasm Innovation in Mountainous Region(Ministry of Education)and College ofLife Sciences,Guizhou University,Guiyang550025,China)Abstract：BRs(Brassinosteroids)is an important steroid hormone in plants,which has very importantphysiological functions.The DWF4is a key rate-limiting enzymein BRs biosynthesis,which significantly affects the content of BRs in plants.In this study,Arabidopsis thaliana was used as the material to clone the objective band.The results showed that a1542bp band from A.thaliana cDNA wascloned and the sequencing results showed that the band was AtDWF4gene.Bioinformatics analysisshowed that this gene encoded513amino acid(aa),and Proscale online predicted that this proteinwas a hydrophilic protein,and SOPM analysis showed that DWF4protein contained multiple secondary structures,including tough-helix,format-fold,and format-angle,etc.Meanwhile,the overexpression vector pRI201-RdDwf4containing AtDWF4gene was also constructed,and the resistant callus and resistant buds were obtained after the genetic transformation of tobacco variety K326.ThispaperprovidesanidealexperimentalmaterialforfurtherstudyingtheinfluenceofoverexpressionofAtDWF4on tobacco morphology and stress tolerance.Key words:Arabidopsis thaliana;BRs;DWF4gene;overexpression vector construction收稿日期2020-08-26基金项目贵州省科技计划项目“因草钾离子通道蛋白及BR对植株抗非生物胁迫研究”(黔科合LH：2016]7449号)；贵大人才培育项目“由菜素内酯介导的烟草抗TMV机理研究”(黔科合平台人才：2018]5781号)作者简介：韦春(1995—),女(壮族)广西河池人；在读硕士，主要从事植物基因工程相关研究(E-mail：*****************).通讯作者：秦利军(1982—)男(汉族)贵州遵义人；博士，副教授，硕士生导师，研究方向：植物生物技术与植物基因工程(E-nail：leequine_chin@126.com)。
拟南芥基因的克隆与功能分析研究随着生命科学的不断发展和深入，基因在生物学中扮演着非常重要的角色。
基因的研究可以揭示生命的本质和演化历程，也有助于阐明疾病的发生机理、揭示人类的不同特性及其遗传规律。
而在基因研究中，拟南芥（Arabidopsis thaliana）是非常重要的模式植物，因为其基因组已经被完全解析，是目前为止研究最广泛的环境适应植物之一。
拟南芥基因的克隆是研究拟南芥基因功能的基础，也是了解拟南芥基因调控及表达的方式的重要方法。
克隆基因一般包含三步：筛选源，提取基因，插入载体。
其中，筛选源是根据已有的序列信息，设计特异性引物，将所需的基因片段扩增出来。
提取基因则需要一些特殊的技术和设备，高纯度的DNA是成功克隆的前提条件。
插入载体则是将扩增出来的目标基因插到载体上，形成所需的重组DNA，进一步研究基因功能。
在拟南芥基因的克隆中，应注意设计合理的启动子、选择正确的载体和检验克隆的准确性等问题。
在拟南芥基因的功能研究中，基因敲除或突变分析是常见的方法之一。
基因敲除即是通过RNA干扰技术或CRISPR/Cas9基因编辑技术将目标基因转录水平降低或消除，进而探究该基因在生命活动中的作用。
突变分析则是通过人工诱导或大规模筛选，寻找具有特定表型的突变体，以此推测该基因在复杂环境中的生物学功能。
这些方法的特点是操作简单、可重复性强，且能够直接揭示基因的生物学重要性。
另外，表达谱分析也是研究拟南芥基因功能的重要方法。
通过高通量测序技术和差异表达分析，可以分析不同组织、不同时期、不同生物地位下基因的表达情况及其调控机制，从而了解基因在整个生长发育过程中的调控关系。
表达谱分析还可以揭示各种生物学过程中参与的基因网络，从而为基因互作网络的构建、复杂环境下基因调控及基因功能的深入研究提供重要依据。
最近几年的研究表明，拟南芥基因在植物进化、环境适应以及生命体系发育等方面起着非常重要的作用。
例如，SLR1基因在拟南芥花器官的形态发育中扮演着重要角色。
位克隆技术的原理及其在分离玉米基因中的应用刘朝显2010.11.3 2 内容摘要图位克隆技术的基本原理1 图位克隆的技术环节 2 图位克隆在分离玉米基因中的应用 3 一. 图位克隆技术的基本原理 1. 图位克隆（Map-based cloning）: 定位克隆（position cloning）,1986 年首先由剑桥大学的Alan coulson 提出。
正常遗传学 2. 基本原理：根据功能基因在基因组中都有相对较稳定的基因座，在利用分子标记技术对目的基因精细定位的基础上，用与目的基因紧密连锁的分子标记筛选DNA文库，通过染色体步移(chromosome walking)逼近目的基因或通过染色体登陆(chromosome landing)方法最后找到包含有该目的基因的克隆，最后经遗传转化试验证实目的基因功能。
3 3. 图位克隆技术的优越性与局限性优点：不需要事先了解目的基因的表达产物，这为克隆许多有重要经济价值的农作物基因提供了有效的手段，因为这些基因的产物大多都是未知的。
缺点：基因组中的重复序列导致染色体步移困难，甚至将步移引入歧途。
4 一. 图位克隆技术的基本原理 4. 图位克隆示意图 5 一. 图位克隆技术的基本原理M1 M2 Gene 连锁标记的筛选M1 M2 Gene 初定位M3 M2 Gene 精细定位M3 M4 M5 M6 M7 M8 合成探针筛选基因组文库转基因功能验证BSA，NIL 300左右5000左右二. 图位克隆的技术环节 6 1.定位群体的构建⑴亲本选择原则:选择高度纯合，遗传差异大，DNA多态性丰富的亲本（实现基因精细定位的重要前提）可选用多个亲本进行多态性筛选⑵定位群体的组配：基因的定位是基于分离后代中交换单株出现的频率大小而实现的，因此组配一个遗传信息多群体大小适中的分离群体尤其重要。
BC1,F2 非永久性群体群体类型RIL,DH，NIL 永久性群体 2. 初定位(玉米：100-350株) 近等基因系（near-isogenic line,NIL ）法: 近等基因系是指几乎仅在目标性状上存在差异的两种基因型个体, 这可通过连续回交的途径获得。
拟南芥基因克隆及原核表达
要进行拟南芥 AtTCP4 基因的克隆和原核表达，可以按照以下步骤进行：
1. 获得目标基因序列：首先，需要获取拟南芥AtTCP4 基因的序列。
可以通过NCBI数据库或其他相关数据库搜索到目标基因的序列信息。
2. 购买引物：根据目标基因的序列设计引物，包括扩增该基因的起始引物和终止引物。
引物的设计应考虑适当的启动子和终止子，以便后续进行克隆和表达。
3. PCR扩增：使用目标基因的cDNA作为模板，使用合适的引物进行PCR扩增。
根据PCR反应条件，设置适当的温度和时间来实现特异性扩增。
扩增产物可以经过琼脂糖凝胶电泳检测，确认特定大小的DNA片段。
4. 克隆：将PCR扩增产物纯化，并将其连接到适当的质粒载体中。
质粒载体应包含合适的启动子、标签和抗生素抗性基因等元素。
使用大肠杆菌等宿主细胞进行转化，并培养在含有适当抗生素的培养基上，筛选出含有目标基因的克隆。
5. DNA测序：对选定的克隆进行DNA测序确认，以确保插入的基因片段没有错义突变或其他错误。
6. 准备原核表达系统：准备用于原核表达的适当宿主细胞（如大肠杆菌）并转化克隆。
选择合适的表达载体，并确保其包含适当的诱导子和选择标记。
7. 表达与纯化：培养转化后含有重组质粒的菌落，并在适当的条件下诱导表达目标基因。
收集细菌并通过细菌破碎、离心和层析等技术进行纯化。
以上步骤提供了一般的克隆和原核表达流程。
具体操作可能会因实验室和应用的不同而有所差异。
在进行实验之前，建议查阅相关的研究论文和方法手册，以获取更详细和具体的操作步骤和技术指导。
拟南芥基因的图位克隆技术浙江大学生命科学学院徐冰浙江杭州3100291 国内外研究现状拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种模式植物，具有基因组小（125 Mbp）、生长周期短等特点，而且基因组测序已经完成（The Arabidopsis Genomic Initiative, 2000）。
同时，拟南芥属十字花科（Cruciferae），具有高等植物的一般特点，拟南芥研究中所取得成果很容易用于其它高等植物包括农作物的研究，产生重大的经济效益，特别是十字花科中还有许多重要的经济作物，与人类的生产生活密切相关，因此目前拟南芥的研究越来越多地受到国际植物学及各国ZF的重视。
从遗传学的观点来看，基因克隆的途径可概括为正向遗传学和反向遗传学两种。
正向遗传学途径指的是通过被克隆基因的产物或表现型突变去进行；反向遗传学途径则指的是依据被克隆基因在染色体上的位置来实现。
虽然一些模式生物（如拟南芥）的基因组测序已经完成，但还有40%的基因（在拟南芥中）的功能还是未知的。
图1 图位克隆所需努力的比较（1995年和2002年）（Jander等，2002）图位克隆（map-based cloning）又称定位克隆（positional cloning），1986年首先由剑桥大学的Alan Coulson提出（Coulson等，1986），用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先知道基因的DNA序列，也无需预先知道其表达产物的有关信息。
它是通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础。
近几年来随着拟南芥基因组测序工作的完成，各种分子标记的日趋丰富和各种数据库的完善，在拟南芥中克隆一个基因所需要的努力已经大大减少了（图1）。
目前完成整个拟南芥的图位克隆过程大约需要一年时间。
在这个过程中，我们从筛选突变体开始，逐渐找到和表型相关的基因。
这和反向遗传学的方法正好相反。
图位克隆能实现，关键在于全基因组测序计划的完成和各种分子标记的发现。
这些数据被储存在专门的数据库中图2 图位克隆过程示意图（Jander等，2002）F1代植物自交得到F2代种子，大约播种600个个体以进行突变基因的粗定位（first-pass mapping，图2）。
在其生长过程中，我们可确定其表型，大约有150个个体被认为是纯合体（在隐性突变的情况下是纯合突变体，在显性突变的情况下是纯合野生型）。
然后从这150个个体的叶子或者其它组织中制备DNA用于基因型分析。
起先用分布于拟南芥五条染色体上的25个标记（相邻的两个标记之间大约相距20 cM）进行分析，确定突变基因是和哪个或者哪几个标记是连锁的，然后用三点测交的方法来定义一个包含突变基因的大约20 cM的遗传间隔。
一旦这样的一个遗传间隔被定义之后，接下来的工作就是引入新的标记把这个间隔缩小到大约4 cM。
一般来说，利用150个F2代个体是在很大程度上能找到这样一个遗传间隔的，距离突变基因最近的两个分子标记将作为侧面标记而用于下面的进一步分析。
下一步我们将播种一个更大的F2代群体用于突变基因的精细定位（fine-resolution mapping，图2）。
最终目标是将包含突变基因的遗传间隔缩小到40 Kb甚至更小（这在拟南芥中大约是0.16 cM）。
显然用于作图的F2代植物越多，就越能精确地定位突变基因。
一般需要3000~4000个F2代植物个体（包括粗定位时的600个F2代植物个体）来精确地定位突变基因。
但是也有很多图位克隆过程用了少于3000个F2代植物个体就成功地定位了突变基因（Lukowitz等，2000）。
但是这往往要冒因为作图群体不够大再一次种植F2代植物而延长整个作图过程的时间的风险。
在这个大约4 cM的遗传间隔内找到与突变更紧密连锁的分子标记，一般情况下能在突变两侧找到相距小于40 Kb的两个分子标记。
一旦这样的两个分子标记被找到之后，就可以通过测序来找到突变基因。
一种有效的方法是设计PCR引物来扩增覆盖这40 Kb的多个重叠的500 bp的片段。
将这些片段测序后拼接起来以得到整个40 Kb的序列，然后将它与野生型植物（Col-0或者L er）的序列进行比对，这就可以找到这个区域中的多个基因。
从一系列侯选基因中鉴定基因是定位克隆技术的最后一个关键环节。
现在最常用的方法是用含有目标基因的大片段克隆如BAC克隆或Y AC克隆去筛选cDNA文库，并查询生物数据信息库，待找出侯选基因后，把这些侯选基因进行下列分析以确定目标基因：（1）精确定位法检查cDNA 是否与目标基因共分离；（2）检查cDNA时空表达特点是否与表型一致；（3）测定cDNA序列，查询数据库，以了解该基因的功能；（4）筛选突变体文库，找出DNA序列上的变化及与功能的关系；（5）进行功能互补实验，通过转化突变体观察突变体表型是否恢复正常或发生预期的表型变化。
功能互补实验是最直接、最终鉴定基因的方法。
利用新兴的RNA干扰（RNAi）也可有效地确定目的基因。
3 存在的问题图位克隆也有其自身的局限性，在某些情况下，就很难或者不能通过图位克隆技术来定位基因。
在分析自然发生的变异的时候，我们最有可能遇到的复杂情况是一个给定的性状是由不止一个的基因位点控制的。
例如，在Kashmir-1（有抗性的）和Columbia（敏感的）株系之间的杂交实验中，我们发现粉状霉菌抗性基因至少涉及三个遗传位点，它们是以附加的方式起作用的（I.Wilson， C. Schiff，和S. Somerville，个人交流）。
对这些抗性基因中的任何一个作精细定位都要求降低作图群体的遗传复杂性，例如通过创造只有一个位点保持多态性的重组近交系。
在拟南芥的株系之间杂交时，很多种性状是由一个或多个遗传位点控制的，其中包括开花时间，种子大小，冬眠，生理节律，次生代谢以及表皮毛的密度（综述见Alonso-Blanco 和Koornneef，2000）。
无论何时，当影响这些性状的自然或者诱导的突变被定位的时候，第二位点修饰成分会干扰这些分析。
表观（上位）遗传突变这个术语是描述一个基因在表达和功能上的可遗传改变，而不涉及DNA序列的改变（综述见Wolffe 和Matzke,1999），这是图位克隆工程中又一个可能的复杂情况。
已有文献很好地证明的是花发育基因SUPERMAN的后生clark kant等位基因（Jacobson 和Meyerowitz，1997）。
这些等位基因是可遗传的，但它们不稳定有一个小的回复率。
它们在SUPERMAN基因的DNA序列中都具有相似的胞嘧啶甲基化现象，结果，有可能减少了SUPERMAN基因转录子的表达。
它们中没有一个是和SUPERMAN的DNA序列改变联系在一起的；尽管如此，它们能被带有SUPERMAN基因的转基因所补充。
目前，对于这种表观遗传突变是怎么产生的以及它们出现的频率知道的不多。
关于染色体上位点的物理和遗传距离的比值是变化的。
通常这种变化是比较小的，对作图的分辨率也只有较小的影响（Copenhaver等，1998）。
但是，有证据表明有些染色体区域是例外的。
例如，对GURKE基因的图位克隆就非常困难，这个基因的定位接近于第一条染色体的着丝粒；在着丝粒附近重组是严格限制的，使得对它精细定位的努力非常无效。
而且，在这个区域中重复DNA单元的广泛分布使我们辨认出散布的单拷贝序列，这些单拷贝序列能产生有疑问的遗传标记（R. Torres Ruiz，个人交流）。
这个发现是经过对第二条染色体上的物理和遗传距离之间的比值的系统地分析之后确认的（Lin等，1999）。
对这条染色体的几乎全序列，1%重组的遗传距离相当于100~400 Kb的物理距离，平均是250 Kb。
然而着丝粒区域是一个显著的例外，在这里1%重组的遗传距离相当于1000~2500 Kb。
看来值得指出的是在现存的物理图谱中，拟南芥的五个着丝粒是没有一个被完全覆盖的。
最近对着丝粒区域的分析显示这些区域通常包含重复的DNA和几乎不含表达的基因（Copenhaver等，1999）。
因此，由于接近着丝粒，应该没有拟南芥基因是不服从图位克隆策略的。
除了着丝粒，第二条染色体上也有一个小片段上1%重组的遗传距离相当于1000 Kb甚至更多。
根据推测，观察到的低重组率现象可能是由于被用于作图分析的株系的DNA序列的重排（Lin等，1999；Mayer等，1999）。
第二和第四条染色体的DNA序列的比较显示有些基因片段是在这两条染色体之间被复制的（其中一个片段的大小是4.6 Mb），还有一个从线粒体基因组向第二条染色体转移的DNA片段（Lin等，1999）。
这些发现清楚地证明了拟南芥基因组的结构是可以不断改变的。
因此，不同株系之间的遗传变异可能不仅仅是由点突变和DNA重排导致的，这就从根本上给图位克隆工程造成了严重的问题。
举例来说，如果在两个株系之间发生倒转的一个大约500 Kb的序列被用于形成的一个作图群体，所有发生在这个倒转内的重组事件将产生不育的减数分裂产物。
因此，不可能在这个倒转序列内对突变进行作图。
到目前为止，发生在常见株系之间的这样的DNA重排还没有被报道过，确实应该是这样，因为它们很难被检测到。
在一个作图实验中，它们的出现将很有可能被忽视直到最后一步。
有时候，T-DNA插入和辐射也被观察到能导致DNA的重排（Shirley等，1992；Nacry等，1998；Laufs等，1999；Ogas等，1999）。
因此，当被作图的突变是由这些方法产生的时候，类似的困难也有可能产生。
但在这些情况下，至少有一定的可能性突变是和重排的一个或两个断裂点有关。
4 前景展望目前，在拟南芥中的图位克隆已经不仅仅是一些专注的（和持久的）专家的工作了，而是每个人都能完成的工作。
在过去的几年中，产生了很多便宜但功能强大的工具，同时也有大量的信息被收集在免费的数据库中。
利用这些资源，目前大部分的图位克隆工程应该是可以肯定的，直接的，也是简单的。
随着我们对拟南芥基因组结构和变化的认识的增长，情况将进一步改善，因为这将有助于我们消除部分上面提到的仍然存在的复杂情况，或者至少使得它们可被控制。
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