实验报告2：鱼类应激生理指标的测定
学号No.：2014308110001 姓名Name：程辉辉日期Date：2015.3.7
摘要：在鱼类养殖过程中存在很多环境刺激因子，如温度、PH、拉网、运输等都会引起鱼类应激反应。
而作为环境刺激因子对鱼体应激反应的直观反映，皮质醇和血糖是最灵敏的指标。
在本实验中，我们主要通过探究处于应激状态下鲫鱼皮质醇和血糖的变化，从而直观认识鱼类应激现象。
实验中测定的皮质醇额含量水平为403.56ng/ml，血糖水平为14.49mmol/l，可以看出，鱼体已经出现了较高的应激水平（于淼，2008）。
本实验通过皮质醇和葡萄糖含量水平评估鱼类应激从而正确理解和认识鱼类应激的发生及危害，并可以此对其进行及时有效地监测，找到产生应激的根源，为水产养殖的鱼类健康养殖、鱼病诊断等提供技术支持。
关键词：应激、血糖、皮质醇
【前言】
鱼类的应激反应是鱼体对各种环境因子的超常刺激所产生的一种非特异性生理反应。
没有应激反应，动物机体就不能适应任何超出一般生理调节范围的环境变化。
但是，过强的或过长的应激反应会对机体产生危害，导致生长发育缓慢、繁殖能力下降、免疫机能低下及发病率和死亡率提高等。
养殖鱼类，特别是集约化养殖的鱼类，不仅会遭受各种天然应激因子的作用，还会遭受许多人为应激因子的刺激。
因此，正确分析和评价生产中各种应激因子对养殖鱼类的影响，对科学地管理和减少生产中应激反应的危害具有十分重要的指导意义
应激反应中能量代谢上的改变突出表现为血糖含量的持续升高，其幅度也与应激程度成正相关。
由于鱼类应激时血糖升高的时效比血浆皮质醇更迟缓，也更容易测定，因此血糖也被广泛用作监测和量化鱼类应激反应的指标。
血清中葡萄糖在葡萄糖氧化酶的作用下生成葡萄糖酸和过氧化氢。
过氧化氢和4-氨基安替吡啉、酚在过氧化物酶催化下生成红色醌亚胺。
醌亚胺的最大吸收峰在500NM左右，吸光度的变化与样本中的葡萄糖浓度成正比。
血浆皮质醇被更广泛地用于鱼类应激反应的监测和评价中，一是由于几乎所有的应激因子都能激活HPI轴，使血浆皮质醇水平迅速升高，其幅度及持续时间与应激因子的强度及作用时间呈正相关；二是因为血浆CA变化的迅即与短暂特性给测定工作带来了一定的困难，而血浆皮质醇则相对易于测定；三是血浆皮质醇含量的持续升高对鱼类的生长、繁殖与免疫机能有重要影响，因此与养殖生产密切相关。
放射性免疫测定法是用放射性核素标记抗原进行的免疫学检测技术，常用于皮质醇激素的检测。
它将放射性核素显示的高灵敏性和抗原抗体反应的特异性结合，使检测的敏感性达pg水平。
常用于标记的放射性核素有I125和I131。
具有灵敏度高、特异性、重复性好等特点，因而常用于激素、药物等微量物质的测定。
其原理是将放射性同位素标记的皮质醇和未标记的皮质醇混合，使其与一定量皮质醇抗体发生竞争性结合。
未标记抗原的量越大，标记抗原与抗体结合生成的结合物量越少。
使用免疫分离剂分离出游离的标记抗原，然后通过离心分离标记抗原与抗体的结合物沉淀，测定沉淀物放射强度（CMP），可计算被检验样品中抗原抗体的结合率。
以结合率为纵坐标，标准皮质醇量为横坐标绘制标准曲线，可查出样品相应的皮质醇含量。
除放免外，免疫放射分析（IRMA）也是应激生理学测定的重要方法，包括单位点和双位点两种。
单位点是利用过量标记抗体与待测抗原进行反应，形成抗原抗体复合物，反应平衡后，用固相抗原结合反应液中剩余的未结合标记抗体并将其分离，
测定上清液的放射量。
双位点则先用固相抗体与抗原反应结合,然后再用过量的标记抗体与已结合于固相抗原的另一抗原决定簇结合,形成固相抗体-抗原-标记抗体复合物，洗弃反应液中剩余的标记抗体，测定固相上的放射性。
【材料与方法】
选取均重200g左右的鲫鱼，尾动脉采血2ml左右，肝素钠抗凝，3000r离心10min 后，分离血浆。
1. 皮质醇的测定采用放免法：
Cor.标准品：将0标准用1ml蒸馏水溶解，其余标准分别加入0.5ml蒸馏水溶解，溶解15min后摇匀待用；125I-Cor.标记物（红色）：用100ml缓冲液溶解，加样前摇匀；兔抗-Cor.抗体（蓝色）：每瓶加10ml蒸馏水溶解
加样前标记放免管，所有试剂静置至室温并摇匀
按下表加样（单位：μl）
试剂/管别总T NSB管“0”管各标准管样品管
零标准（S0）——50 50 ————
Cor.标准品
——————50 ——
(S1-S5)
样品或质控————————50
125I-Cor. 100 100 100 100 100
蒸馏水——100 ——————兔抗-Cor.抗体————100 100 100
摇匀，37℃温育45min
免疫分离剂——500 500 500 500 充分摇匀后室温放置15min，3500rpm/min离心15min，弃上清（总T管不弃），测各沉淀管放射性计数（CPM）。
2. 血糖的测定采用比色法：
取血浆为样本，将10ml R1 与90ml R2 混合均匀，即为工作液
按照下表进行加样：
空白管校准管样本管
样本——30 ul
校准品—30 ul —
蒸馏水30 ul ——
工作液3000ul 3000ul 3000ul 混匀后37℃水浴15min，在505nm处读取吸光值，空白管调零
计算公式：样本浓度（mmol/L）=（测定管OD值-空白管OD值）/（校准管OD 值-空白管OD值）*校准管浓度(5.55mmol/L)
3. 补充实验：血浆胶体渗透压的测定根据总蛋白(TPC)与胶体渗透压(COP)间的公式测定，总蛋白的测定采用考马斯亮蓝法。
测定公式：COP=2.1TPC+(0.16TPC)2+(0.009TPC)3
【实验结果与分析】
1.血糖测定结果
血浆血糖含量为14.49mmol/l，含量较高。
2.皮质醇测定结果
血浆皮质醇的结果为403.56ng/ml，含量较高。
3.补充实验：总蛋白浓度为5.21 g/100ml，血浆胶体渗透压13.55mmHg
【讨论】
皮质醇和血糖都是反映鱼类应激水平的重要指标。
在本次实验中实验材料鲫鱼由于长途运输以及后期暂养期间的拥挤胁迫，极有可能引起鲫鱼严重的应激反应，因此在本次实验中皮质醇、血糖水平对鱼体的应激水平有一个较为合理和直观的反应。
皮质醇是鱼体在受到外界刺激后，通过丘脑下部-垂体-肾间组织轴所分泌的一种重要应激激素，血液皮质醇水平的升高被看做是鱼类应激的灵敏信号。
在一般水平下，鲫鱼正常的血浆皮质醇水平一般维持在15ng/mL（刘小玲，2007；王国强，2009），而在本次试验中所测得的皮质醇浓度为403.56ng/ml，说明鲫鱼已经处于严重应激的状态。
究其原因，可能是由于实验鲫鱼在实验前经过了较长时间的运输，而在实验室暂养期间，高密度的拥挤胁迫，造成了较为严重的应激，进而导致了鲫鱼血浆皮质醇含量的升高。
血糖是机体内重要的供能物质，常态下其含量比较恒定，而随着机体的活动和环境的变化，血糖含量会发生变化。
在一般情况下，鱼体的血糖的含量水平与外界的应激程度成正相关。
在本次实验中，血糖的含量为14.49mmol/l，比王晶晶等研究的鲫鱼的正常的血液血糖水平3.74mmol／l较高（程超，2008；王晶晶，2011），是一种对鱼类应激的直观反映，说明鱼体已经处在了高应激状态。
至于血糖升高的原因，Mommsen等认为是应激后血液皮质醇水平升高导致，因为皮质醇能激活糖异生中的关键酶如葡萄糖-磷酸酶，从而使糖异生作用增强、血糖浓度升高。
而在在硬骨鱼类皮质醇主要的新陈代谢功能似乎就是调节糖异生（Davis，1986；Mommsen，1999）。
参考文献：
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