第22卷 第6期2000年11月
北 京 林 业 大 学 学 报
JO UR NAL OF BEI JI NG F OREST R Y U N IV ERSIT Y
Vol.22,N o.6Nov.,2000
2000 07 10收稿
http://w w https://www.doczj.com/doc/b07524340.html,/periodi cal/bjlydxxb/
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九五 国家攻关课题(96 011 02 04 02)的部分内容
杨树分子标记研究进展*
张德强 张志毅
(北京林业大学毛白杨研究所,100083,北京;第一作者男,26岁,博士生)
杨 凯
(中国农业科学院作物品种资源研究所,100081,北京)
摘要 该文介绍了在杨树育种中常用的三种分子标记:RF LP,RAP D 和A FL P,并综述了其在杨树指纹图谱、遗传图谱构建和数量性状基因定位等方面的研究进展.
关键词 杨树,分子标记,指纹图谱,遗传图谱,数量性状基因定位中图分类号 S792.11
Zhang Deqiang ;Zhang Zhiyi;Yang Kai.Advances of molecular marker researches in poplar.Jour nal of Beij ing For estry Univer sity (2000)22(6)79~84[Ch,33ref.]Institute of Pop ulus tomentosa ,Beijing For.Univ.,100083,P.R.China.
RFLP(restriction fragment length polymorphism ),RAPD(random amplified poly morphic DNAs)and AFLP (amplified frag ment length polymorphism)are introduced and their applications to finger prints,genetic linkage maps constructing and QT Ls mapping in poplar are review ed in this paper.Key words poplar,molecular marker,fingerprints,genetic maps,QT Ls mapping 杨树属杨柳科(Salicaceae )、杨属(Pop ulus L.),约有100多种,广泛分布于欧洲、北美和亚洲,是防护林、水土保持林、四旁绿化及人工用材林的重要树种.很多年来,虽然林木育种学家对其生理生化、解剖构造等基础性研究较深入,对于杨树的遗传改良产生了巨大的推动作用,但对于常规育种中抗病、抗虫性状、性别决定及林木早期选择育种等问题仍无法从根本上解决[1~6].因此,对杨树进行分子生物学研究迫在眉睫.
杨树种间杂交和无性繁殖容易,杨属所有种的染色体数均为2n=38,核基因组相对较小(2c= 1.1~1.2pg),便于遗传操作,并已建立较完善的遗传转化体系,获得了转基因植株.因此,杨树是公认的林木生物学基础研究中的模式树种.由于杨树种间杂交容易,在F 1代有很强的杂种优势(材积生长量),杂种的F 2代在许多性状方面可发生广泛的分离,所以大量的分离群体在F 1代或F 2代很易建成[7~
10]
.十几年来,前人利用分子标记技术对杨树
基因组进行了指纹图谱绘制、遗传图谱构建及数量
性状基因定位.
在杨树中,常用的分子标记为RFLP,RAPD 和
AFLP,它们是继形态标记(M orpholog ical markers)、细胞学标记(Cytological m arkers)和生化标记(Bio chemical markers)之后发展起来的一种以DNA 多态性为基础的新一代遗传标记.与形态标记和生化标记相比,分子标记具有明显的优越性:大多数分子标记是共显性的,基因组变异极其丰富,分子标记的数量几乎是无限的,在植物发育的不同阶段,不同组织的DNA 都可用于标记分析;分子标记不受环境影响,其变异只源于等位基因DNA 序列的差异,与不良性状无必然的连锁,不需专门创造特殊的遗传材料
[7~20]
.基于上述这些优点,分子标记技术可为
杨树生产提供准确、可靠的遗传标记.
1 分子标记概述
分子标记是分子生物学发展的产物.80年代初,发展了RFLP,随后其发展极为迅速,产生了多种分子标记技术,用于杨树遗传育种的主要有以下3种.
(1)RFLP RFLP(Restriction Frag ment Length Polymorphisms)指限制性片段长度多态性,是杨树遗传育种中使用较多的一种分子标记[21~
25]
.
RFLP在林木遗传育种中的应用是从1986年开始的,迄今也开展了大量的研究.RFLP技术的原理是检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小.其基本步骤包括基因组DNA的限制性酶切,电泳分离,利用探针进行Southern杂交来检测基因组DNA.RFLP标记具有共显性的特点,结果稳定可靠,重复性好,特别适应于建立连锁图.然而,RFLP必须经过DNA酶切、电泳、South ern杂交,费时、费力、周期长,每次实验检测的位点较少,对DNA需求量较大(5~10 g),需用放射性同位素或非放射性物质标记探针,探针的种属特异性较强,杨树已有的探针不超过300个,这是RFLP 应用在杨树中的主要问题.另外,RFLP对DNA多态性检出的灵敏度不高,RFLP连锁图上还有很多大的空间区(Gaps).
(2)RAPDs RAPDs(Random Amplified Poly morphic DNAs)为随机扩增多态性DNA,是一项基于PCR技术基础之上,用一个随机引物(8~10个碱基)非定点地扩增DNA片段,然后用凝胶电泳分离扩增片段来进行DNA多态性研究[7~13].与RFLP相比,它较便宜,方便易行,非常灵敏,DNA 用量少,实验设备简单,不需DNA探针;设计引物也不需要预先克隆标记或进行序列分析,不依赖于种属特异性和基因组的结构,合成一套引物可以用于不同生物基因组分析,用一个引物就可扩增出许多片段,而且不需要同位素,安全性好.因此,继RFLP之后,RAPD是在杨树研究中应用最广泛,特别是在寻找与目的基因连锁的分子标记方面,报道最多.但是,RAPD受条件影响很大,因此对设备、条件及超作的要求都很严格,若达不到要求,稳定性和重复性就很难保证,解决的办法是严格控制实验条件,使用相同的PCR仪和引物.
(3)AFLP AFLP(Amplified Frag ment Length Polymorphisms)扩增片段长度多态性,是1992年由荷兰Keygene公司科学家Zabeau和Vos发明创造的一种DNA分子标记新技术[12,14,17,18].其基本原理是植物基因组DNA经限制性内切酶双酶切后,形成分子量大小不等的随机限制性片段,将特定的接头(adapter)连接在这些DNA片段的两端,形成一个带接头的特异片段,通过接头序列和PCR引物3!末端的识别,特异性片段经变性、退火和延伸周期性循环而扩增,最终通过聚丙烯酰胺电泳分子筛作用,将这些特异的限制性片段分离开来.
AFLP是在RFLP和RAPD的基础上发展起来的.它是RFLP和RAPD的结合,它集中了二者的长处,既有RFLP的可靠性,又有RAPD的方便性.也就是说它不仅具备了其它DNA分子标记技术所具有的特点,多态性丰富,共显性表达,不受环境影响,无复等位效应,而且还具有带纹丰富,用样量少,灵敏度高,快速高效等特殊优点.通过一些实验室和科学家的使用和验证,AFLP被认为是一种十分理想的、有效的分子标记技术,它可以在短时间内提供巨大的信息量.尽管它产生时间还不长,即在林木指纹图谱技术、遗传图谱构建中使用很广泛,预计AFLP在杨树分子育种中将发挥更大的作用.其缺点为:实验成本较高,基因组的不完全酶切影响实验结果,所以实验对DNA纯度和内切酶的质量要求较高,同时要求实验人员有很高的操作技能.
2 分子标记在杨树中的应用
作为一种有效的遗传标记,分子标记直接以DNA为研究对象,在杨树遗传育种方面应用广泛,分子标记在无性系指纹图谱构建、遗传图谱构建和数量性状基因定位中研究进展较快,这些开创性工作为杨树育种,利用分子标记进行辅助选择奠定了必要的理论基础.
2.1 绘制无性系指纹图谱
指纹图谱(Fing erprinting)是鉴别品种、品系和无性系(包括杂交亲本和自交系)的有力工具.90年代以前,指纹图谱构建主要是同工酶方法,而目前主要是DNA水平的分子标记技术.由于杨树分布广,在长期的自然演化和种间杂交过程中形成了生态适应性各异、数量庞大的一些变异的新种和新的无性系,为了正确地保护和利用遗传资源,应利用分子标记技术对杨树无性系鉴定进行研究,以便于在世界范围内广泛交流,为充分利用这些无性系提供一个可靠的依据.
分子标记最为直接的应用是对单株进行指纹分析,最早是利用RAPD技术进行无性系指纹图谱构建.S.Castiglione等人(1993)利用RAPD标记[26],对杨属不同种的32个无性系,进行了分析,共用18个引物并从中筛选出4个引物用于PCR扩增反应来区分这些无性系,它们共扩增出120个不同的DNA带,其中多态带占92%,通过统计分析来确定遗传关系,证明即使在形态和物候基础上不能识别的无性系,利用RAPD技术仍可鉴别出来,该研究指出,生长在不同地点的同一无性系植株其指纹没有差异.Silvia,Cortizo等人(1996)用RAPD标记技术对广泛种植在阿根廷的12种美洲黑杨进行无性系鉴定[11],结果表明:那些从形态上难以分辨的无性系,用RAPD标记可以对这些无性系进行区分;随后,N.Sanchez等人利用RAPD标记对黑杨(P.
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nigra.)、美洲黑杨(P.deltoides)、银白杨(P.al ba)、欧洲山杨(P.tr emula)、毛果杨(P.tr i chocarp a)25个无性系进行了鉴定[27],他们发现每个种及每个种内的无性系所表现出的RAPD带都不一样,从而根据这些谱带来区分杨属不同种;尹佟明等人(1998)首次把AFLP标记用于杨属指纹图谱构建中[14],他们使用两个引物组合(E ACA和M CAG;E AAC和M ACT)构建了美洲黑杨42个无性系的AFLP指纹图谱,每个无性系的扩增谱带数都在50条以上,扩增片段大小在0.3~ 1.5kb之间.由于这些材料亲缘关系较近,大多数多态谱带不仅对某一无性系特异,但就对每一无性系而言,这些多态谱带构成了每一无性系的特征谱带组合,根据每一无性系的特征谱带组合,可以鉴别不同的无性系.
2.2 构建遗传图谱
遗传图谱的构建是基因组研究中的最基础的工作,可为基因定位与克隆及基因组结构和功能的研究奠定基础.构建遗传图谱,需要适当的分离群体和家系,还需要大量能揭示亲本多态性的遗传标记.随着以RFLP为代表的分子标记的出现,遗传作图在许多林木中得到了飞速发展.国际上已有20多个国家开展了30多个树种的遗传图谱构建和数量性状基因位点的定位研究.
杨树的遗传图谱构建起步虽较晚,进展相当迅速,但由于杨树是林木遗传研究的模式树种,其遗传图谱的构建具有重要的理论意义和应用前景.第一个用分子标记进行杨树遗传图谱构建的是M in nesota大学的Liu和Furnier,他们(1993)以美洲山杨(P.trem uloides M ichx)5个全同胞家系为材料利用RFLP标记和等位酶标记构建了世界上第一张杨树遗传图谱[11],该图谱包含了54个RFLP标记和3个等位酶标记,形成14个连锁群,覆盖基因组总长约664cM;随后,华盛顿大学的H. D.Brad shaw Jr和M.Villar等(1994)用毛果杨(P.tr i chocarp a)为母本[24],美洲黑杨为父本,产生的F2群体为材料,采用了3种不同的分子标记RFLP,STS, RAPD构建了包括343个分子标记的遗传连锁图谱,其中有111个RAPD标记,215个RFLP标记, 17个STS标记,估计杨树基因组长度为2400~ 2800cM,通过连锁分析有312个标记分属于35个不同的连锁群,其中最大的19个连锁群覆盖基因组总长约1261cM,覆盖率为48.5%.
我国杨树遗传连锁图谱研究进展较快,南京林业大学与中国科学院遗传研究所合作(1999)利用RAPD标记,以响叶杨(Pop ulus adenop oda M ax im.)?银白杨(P.alba L.)的F1群体为材料,分别构建了响叶杨和银白杨的分子标记连锁图谱[7].实验过程中对600个随机的寡核苷酸引物进行了重复筛选,共选出128个引物用于作图群体的随机扩增,作图群体大小为82个单株(包括双亲),结果获得了326个拟测交位点和7个3#1分离位点,拟测交位点中有238个位点来源于银白杨,有88个位点来源于响叶杨.经偏分离检测,用于银白杨作图的位点共计212个(26个位点偏分离),用于响叶杨作图的位点共计78个(10个位点偏分离).利用多点连锁分析,银白杨中有189个连锁标记构成了20个不同的连锁群,6个三连体和16个连锁对,连锁标记覆盖的总图距为2402.4cM.而响叶杨有41个连锁标记分属于12个不同的连锁群,标记覆盖的总图距为479.4cM,获得了中等密度的银白杨连锁图谱和响叶杨图谱的一个连锁框架.
目前国内外在林木遗传图谱研究中,一般采用拟测交策略,即分别构建父本和母本的两张不同的连锁图,它不能把基于不同亲本的连锁图整合到一张图上,主要是因为缺少足够的信息,从而使在亲本1中分离而在亲本2中固定的分子标记不能与在亲本2中分离而在亲本1中固定的分子标记关联起来,而通过那些在双亲中均分离的标记,可以使两张图连结成一体.随后,南京林业大学、中国科学院遗传研究所、美国北卡罗来纳州立大学合作,利用RAPD标记和美洲黑杨?欧美杨(P.eurameri cana)的F1群体,构建了美洲黑杨?欧美杨的分子标记连锁图谱[8],作图群体大小为92个,实验过程中对1040个10碱基寡核苷酸随机引物进行了重复筛选,共选出127个引物用于作图群体的随机扩增,这127个引物产生229个多态位点,利用多点连锁分析,形成19个连锁群及6个三连体和14个连锁对.由19个连锁群构成的图谱含标记129个,总图距为1914.2cM,覆盖杨树基因组约73.62%,标记间的平均间距为14.84cM,该研究获得了中等密度的美洲黑杨?欧美杨的一个连锁框架.在该研究中,此类型的基因位点较多说明了 三交(Tripcross)群体在分离位点的显示效率以检测复等位基因分离方面具有高效性.
中国林业科学研究院与英国牛津大学合作,利用RAPD方法,在美洲黑杨?青杨(P.cathayana Rehd.)3代谱系中分析分子标记,构建出美洲黑杨?青杨分子标记连锁图谱[9],该图谱由20个连锁群,110个RAPD标记组成.总图距为覆盖基因组总长度的70.35%,标记间的平均间距为17.27cM.该图谱为杨树抗病虫和其它性状基因定位提供了框
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第6期张德强等:杨树分子标记研究进展
架结构,为实现杨树分子遗传育种迈进了最重要的一步.
随着多种遗传标记方法的逐步完善和发展,人们正在努力探索应用多种分子标记进行基因组研究.随着林木遗传图谱构建的深入研究,构建出高密度的遗传图谱及对目的基因进行定位,其使用价值将日益提高,使用范围也将不断扩大,将对林木遗传育种产生深远的影响.
2.3 数量性状位点定位
利用分子标记技术对林木遗传育种进行研究,一个重要方面是数量性状基因定位(简称QTLs定位).QTLs定位,是阐明控制有关数量性状的主要基因数目,这些基因在染色体上的位置,以及其自效应和联合效应的遗传图.利用这种遗传图和分子标记技术,可使林木育种从表型选择逐步过渡到基因型选择,进一步利用QT Ls定位的成果进行标记辅助选择,大大提高育种效率.
林木的QTLs定位研究是在农作物已开展QT Ls探测之后开始的,并取得了较大的进展.目前,在QTLs作图中较常用的方法为方差分析法(Analysis of variance,ANOVA)、区间作图法(Inter val mapping,IM)和复合区间作图法.杨树的QTLs 定位工作主要集中于重要的经济性状,如生长、材性和抗性等.如美国华盛顿大学Bradshaw等人(1995)通过对毛果杨?美洲黑杨的F1群体遗传图谱的构建[28],利用连锁图上的分子标记对树高、胸径、材积、干形和分枝角等重要经济性状进行了QT Ls定位研究,发现这些数量性状变异的25%~ 96%是受1~5个QTLs控制的.例如苗木2年生时材积生长性状的大部分变异是受4个QT Ls控制(它们所控制的变异分量分别占遗传变异的85%,占表型变异的49%),其中的3个QTLs为显性方式遗传,第4个QTLs呈超显性遗传.研究也表明,控制高生长的等位位点在毛果杨上是纯合的,控制粗生长的等位位点在美洲黑杨上是纯合的.研究还发现,QT Ls可能在苗期和以后的生长期中有所变化,因此可根据QTLs作用随时间的变化来预测林木的生长过程.
中国林业科学研究院的李金花等人(1999)以美洲黑杨(母本)和青杨(父本)杂交获得的F2群体80株为材料[29],应用RAPD标记检测与F2群体3个数量性状(苗高、地径和封顶期)有关的QT Ls,研究表明:?该研究检测出分别与苗高、地径和封顶期关联的7,6和3个标记座位,其联合贡献率分别高达45.94%,41.17%,19.13%,但各标记座位对性状的贡献率较小,表明其均为微效基因.%用单因子方差分析检测到与封顶期性状关联的RPL05 3与苗高性状不关联,但双因素方差分析检测发现,其分别与RPN04 2和RPH01 1的互作与苗高性状相关联,且互作对苗高的作用微小.
大量研究证明林木叶片对林木生长量的重要性.经典数量遗传学研究表明F2代叶片数量性状间存在显著相关性,但无法鉴别数量性状基因在染色体上的位置及其遗传效应,也难以确定相关性状的QT Ls间的关系.分子标记技术的出现,使得对林木叶片数量性状研究进入到分子水平阶段.美国的R.Wu和华盛顿大学的H.D.Bradshaw等人通过分子标记和数量遗传方法以毛果杨?美洲黑杨种间杂交谱系为基础,研究发现叶子色素、叶柄长和叶长比率受少数QTLs控制[30],并指出父母本毛果杨和美洲黑杨对于它们的杂交子代表型有不同的贡献,例如控制叶缘绿色和叶柄的扁平程度的基因位点主要由美洲黑杨控制,而控制叶脉着生方向和叶片角度基因位点主要由毛果杨控制.又如中国林业科学研究院的苏晓华等人(2000)利用数量遗传学和RAPD标记相结合[31],对美洲黑杨与青杨杂交产生的F2群体5个叶片数量性状进行了相关联标记及其图谱定位研究.用单因素方差分析检测出与叶长、叶宽、叶长/叶宽、叶柄长和叶面积相关联的RAPD标记分别为10,10,4,9,12个;联合贡献率分别为66.23%,61.82%,32.86%,59.67%,81.79%.用双因素方差分析检测出与互作QTLs紧密相关联的标记位点共19对,其中与叶长、叶宽、叶长/叶宽、叶柄长和叶面积显著相关联标记分别有4对、2对、1对、5对、7对.与这5个性状相关联的标记多数集中分布于第4,12,15和17条连锁群上.这些研究的目的是为实现杨树分子标记辅助选择育种提供依据和参考,有助于林木生长量的改良.
2.4 分子标记辅助选择
标记辅助选择(M arker assisted selection, MAS)或称标记辅助育种,是指通过分析与目标基因紧密连锁的分子标记判断目标基因是否存在.根据连锁图将目标基因定位在某一染色体上,就可选择分散在染色体上不同位点的标记并逐渐逼近,这样便很快找到该基因的分子标记.林木遗传图谱为在DNA水平上进行林木生长、材性和抗性等重要性状的早期测定提供了依据,同时也提高了早期测定的精确度和可靠性,从而大大缩短了林木育种周期.
在实际育种工作中,首先要确定目标性状是由质量性状或QTLs控制,利用与目标质量性状基因紧密连锁的分子标记,是进行质量性状选择的有效
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途径.林木中,标记目标性状基因的方法目前主要有两种:一是利用近等基因系或M ichelmore(1991)等提出的分离群体分组分析法(Bulked Segregant Analysis,BSA),BSA是将F2分离群体中研究的目标性状根据其表型(如抗病、感病)分成两组,将每组内的一定数量的植株的DNA混合,形成按表型区分的DNA池,也称近等基因系(Isogenic DNA Pools),并用作模板进行RAPD分析.二是利用已有的连锁图进行标记.在杨树基因定位中主要是采用BSA法,例如M.T.Cervera等以美洲黑杨?黑杨的F1代的叶片为材料[32],利用AFLP技术,用144个引物筛选了大小为70~800核苷酸的11500个多态性片段,得到3个与抗杨树叶锈病基因紧密连锁的AFLP标记.BSA法与AFLP技术结合大大提高了与目的基因相连锁的分子标记的筛选效率.再如M.Villar等人(1996)利用BSA法[22],采用2?2因素交配设计,对杨树4个家系189个子代探测出与杨树抗叶片锈病相连锁的5个RAPD标记,并从中获得了比1cm还要小的一个抗病基因标记,使分离该基因成为可能.美国华盛顿大学Newcome (1996)[11],利用毛果杨?美洲黑杨组合三代谱系为材料,连续两年在不同试验点调查杨树材料对锈病的抗性,统计表明:锈病坏死斑是受来自毛果杨亲本的一个显性基因(Mmd I)控制,并基于已有的图谱把Mmd I基因定位在连锁群上,其中一个RFLP标记P222相距5cM.可以预计,由于利用遗传图谱进行目的基因定位和分离,将使林木基因工程进入一个新阶段.在我国主要开展了抗杨叶枯病[Al ternar ia alternata(Fr.)Keissler]、杨黑斑病[Marssonina p op uli(Lib.)M agn]、杨灰斑病(Coryneum p op ulinum Bres.)等相连锁的标记及基因定位研究[33],但迄今为止还未见到与某种抗病相连锁标记的报道.另外,利用分子标记分析找到了南抗杨新品种抑制害虫的物质和与抗虫相连锁的标记,为杨树抗虫育种的可行性提供了依据[33].林木分子标记辅助选择还处于起步阶段,离真正用于育种实践还需要一段较长的时间,其中也还有很多问题需要解决.
3 展 望
在杨树遗传育种研究中,指纹图谱、遗传图谱、数量性状基因定位虽未进入实用阶段,但随着研究的不断深入,利用高效的分子标记构建杨树高密度遗传图谱,并利用遗传图谱上的分子标记进行数量性状、质量性状的多位点定位,深入研究个体或谱系特征性,开展分子标记辅助选择育种,不断完善标记辅助选择的理论和方法,分子标记技术将在杨树及其它林木遗传育种研究中产生一次新的飞跃.
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grow th and development in Populus()).M apping QTLs w i th l arge effects on grow th,from,and ph enology traits in a fores t tree.Genetics,1995,139(2):963~973
29 李金花,苏晓华,张绮纹,等.用RAPD标记检测与杨树生长和
物候期有关的QTLs.林业科学研究,1999,12(2):111~117
30 Wu R,Bradshaw H D Jr,Stettler R F,et al.M olecular genetics
of grow th and development in Popu lus(Sali caceae)(V).M apping quantitative trait loci affecting leaf variation.American Journal of Botany,1997,84(2):143~153
31 苏晓华,李金花,陈伯望,等.杨树叶片数量性状相关联标记及
其图谱定位研究.林业科学,2000,36(1):33~36
32 Cervera M T,Gusmao J,S teenackers M,et al.Identificati on of
AFLP molecular markers for resistance against M elampsora larici pop ulina in Pop ulu s.Theor Appl Genet,1996,93(5~6):733 ~737
33 张绮纹,苏晓华.杨树定向遗传改良及高新技术育种.北京:中
国林业出版社,1999
(责任编辑 董晓燕)
84北 京 林 业 大 学 学 报第22卷
兰花育种技术研究进展 吴根良1,商世能2,沈国正1,孙 瑶1 (1.浙江省杭州市农业科学研究院,杭州310024;2.浙江省杭州万向职业技术学院,杭州310023) 摘要:综述了兰花的种子离体萌发、利用生化技术和分子标记进行兰花种质资源分类和种间品种间鉴别。同时概述了调控花色素合成酶、花器官形成、子房发育和胚珠发育以及构成建兰花叶病毒(CyMV)等特异基因分离克隆,以及转基因技术等研究进展,并对我国兰花育种进行了展望。 关键词:兰花;离体萌发;分子标记;基因分离;基因转化;育种 中图分类号:S682.31文献标识码:B 文章编号:1001-0009(2006)04-0115-03 兰花一般是指兰科植物(Orchidaceae),它是鲜花植物中 最大科之一,全世界约有800多属,25000多种,分布于世界 各地,大多数种类分布于东南亚、澳大利亚、中南美洲、非洲 和马达加斯加。我国的野生兰科植物约有173属,1240多 种[1],在南北各地均有分布,但以云南、台湾、海南最为丰富。 兰花是珍贵的观赏花卉,此外还有作为药用的天麻(G astro2 dia elata)、白芨、红门兰等和作香料的香子兰等,有极高的 经济价值。 具有观赏和药用价值的兰科植物目前在国际、国内市场 上占有重要地位。保护和利用我国的野生兰科植物,并拥有 和选育新的种源,才能在世界各国兰花业竞争日益激烈的今 天占有一席之地。 1兰花种子的离体萌发 远缘杂交和品种间杂交是兰花育种的重要方法之一。 兰花种子萌发是兰花杂交育种的重要环节,因为在自然条件 下兰花种子的萌发率很低。 1.1共生萌发 Bernard在1899年首次分离出兰花的根菌,并用其感染 兰花的种子进行萌发试验,从而创立了兰花种子共生萌发的 方法。他指出:在自然条件下兰科植物种子萌发需要适宜的 真菌感染,它促进种子萌发就在于把胚和基质连接起来,形 成共生系统。在这个共生系统中真菌促进了种子的糖异生 及贮藏物质的利用,并在它开始光合作用前,持续提供营养 物质。我国兰科植物菌根菌研究发展很快,天麻菌根菌已经 应用于天麻种子萌发和人工栽培。徐锦堂等从天麻原球茎 中分离出紫萁小菇(Mycana osmudicola), 用天麻种子拌该 第一作者简介:吴根良,1963年10月 生,本科,高级农艺师,主要从事蔬菜花 卉栽培技术研究和技术推广工作,主持 完成的相关重要科研项目有国家重大 科技产业工程《工厂化高效农业科技示 范工程》专题一项;省级重点项目“切花 月季高产、优质栽培技术开发”,“主要鲜切花新品种引种与优质高效栽培技术研究”等,曾荣获省市各类科技进步奖五项,现主持浙江省科技厅重点项目“名贵花卉卡特兰产业化关键技术研究”等项目。 3基金项目:杭州市科技发展计划(200462N08)。 收稿日期:2006-01-14菌,播种后种子的萌发率可达20%以上,为此促进了天麻的人工栽培。郭顺星等对白芨种子的共生萌发进行了研究,拌菌后的种子萌发率、原球茎和营养器官生长速率显著高于对照。郭顺星等对真菌在石斛(Dendrobium)种子萌发中的作用进行了研究。在种子共生萌发研究中,尚有很多问题需要进一步深入探讨,如兰科植物菌根菌的种类和特点、兰科植物与真菌的相互作用机制、优良共生菌的筛选、兰科菌剂的研制等。 1.2非共生萌发 Bernard以眉兰(Ophrys)的块茎配制培养基,使卡德丽亚兰(Cattleya)与蕾丽亚兰(Laelia)杂交种的种子成功萌发,开创了非共生萌发的先例。随后,Arditti用非共生萌发对齿瓣兰(Odontoglossum)、蝴蝶兰(Phalaenopsis)、石斛兰、文心兰(Oncidium)等种子进行萌发研究,得到了正常的种苗。 兰花中有些种类未成熟或接近成熟的种子比成熟种子更容易萌发。仙人指甲兰(Aerides)、白拉索兰(Brassavola)、布鲁通氏兰、卡德丽亚兰、厚杯兰、树兰(Epi2 dendrum)、文心兰、蝴蝶兰、肾药兰和万代兰(Vanda)等10个属的19个种和15个杂交种的种子萌发试验证明,未成熟种子能很好萌发,最短的是在授粉后40～50d萌发。 对于萌发难度较大的地生兰,进行适当的种子预处理可以提高萌发率。段金玉等对兰属(Cymbidium)10种植物的种子离体萌发研究表明,用0.1mol/L氢氧化钠浸泡种子10～30min,能使多花兰(C.floribundun)、春兰(C.goeringii )、双飞燕(C.goer.)、线叶春兰(C.goer.var.serratum)、寒兰(C.kanran)、套叶兰(C.cyperifolium)等种子的萌发率提高10倍以上。 大部分兰花种子可通过无菌萌发方式发芽,而萌发率因基因型而异。气生兰及其杂交后代的种子萌发力较强,地生兰种子萌发率普遍较低。即使同为蝴蝶兰不同杂交组合的种子萌发率和幼苗生长发育也不同[2]。一般在种子无菌萌发过程中激素是培养基中不可缺少的成分,但有人认为卡德丽亚兰种子萌发可采用不含激素的MS培养基[3]。杨美纯等认为在MS、KC和花宝三种培养基中,MS最适合蝴蝶兰种子的萌发,香蕉汁150g/L可明显提高种子萌发率并促进幼苗生长[4]。 2兰花的分类鉴定 511 北方园艺2006(4):115～117 ?园林花卉?
杨树杂交育种 目录 1 前言 (1) 1.1 研究内容及意义 (1) 1.2 国外杨树杂交育种研究进展 (2) 1.3 国内杨树杂交育种研究进展 (2) 1.3.1 探索阶段（20世纪50年代以前） (2) 1.3.2 繁荣阶段（20世纪50～60年代） (3) 1.3.3 恢复阶段（20世纪70～80年代） (3) 1.3.4 现代杂交育种（20世纪90年代～至今） (4) 1.4 杨树杂交育种策略的发展 (4) 2 常规育种 (5) 2．1 气候分析法用于指导林木引种实现了树种/种源、种源/家系三水平同步选择 (5) 2．2 充分利用种和种内的遗传变异开展杂交育种 (5) 2．3 无性繁殖技术的应用促进了无性系育种 (6) 2．4 改良代种子园及其丰产技术 (6) 3 杨树育种展望 (7) 参考文献 (7)
1 前言 杨树是杨柳科(Salicaceae)杨属(Populus L. ) 树种的统称。由于杨树生长快、适应性强、木材用途广,是北半球人工林栽培面积最大的树种之一。中国杨树人工林面积大约667万hm2 , 约占全国人工林面积的1/5, 是世界其它国家杨树人工林总面积的4倍, 在我国生态防护林和工业用材林建设中发挥着重要作用 [1-2]。目前, 我国林业生产中推广应用的杨树良种主要是通过人工杂交培育的, 杂种优势明显, 具有速生、优质、高产和高抗等特点, 产生了巨大的经济效益、生态效益和社会效益[3]。杂交育种仍然是目前及今后更长一段时间内培育杨树新品种的重要手段之一。 1.1 研究内容及意义 杂交育种是通过不同基因型亲本之间的有性杂交和基因重组，对所创造的变异实施多代选择、鉴定而育成新品种的方法。有性杂交将导致基因重组，它所产生的各种各样的变异类型，可为选育新品种提供丰富的材料基础。通过有性杂交，可以将双亲的优良性状综合在一起，产生不同于双亲的新的优良性状。 开展美洲黑杨×美洲黑杨种内杂交、美洲黑杨×欧美杨种间杂交、美洲黑杨×小叶杨派间远缘杂交试验，建立美洲黑杨种内、种间和派间杂种等不同水平上的3个育种群体，为新品种选育提供物质基础和丰富的变异来源，可望得到适于黄淮、江淮及长江中下游等平原地区工业用材所需的，具速生、丰产、抗逆等优良特性的新类型。 1.2 国外杨树杂交育种研究进展 英国最早从事杨树杂交育种工作。1912 年Henry A 教授用棱枝杨( P. deltoides var. angulata) 与毛果杨( P. t richocarpa Torr. ) 进行人工杂交，选育出了速生、适应性强的格氏杨( P. generosa Henry) [4]。 1916年，欧洲、北美洲、亚洲也开展了杨树的育种，有性杂交即成为世界杨树育种的常规途径。 美国从1924 年起，进行了系统的杨树杂交工作，用美洲山杨( P. t remuloides) 、银白杨( P. alba) 等34 个不同植株，做了100 个杂交组合，得到了上万株杂种苗[5]。 前苏联1933 年开始进行杨树杂交育种工作，从1933年到1941年间所做的杂交组合在123个以上[6]，从银白杨×新疆杨( P. bolleana Lauche) 中选出莫斯科银毛杨( P. suaveolens ×P. tremula) 和苏维埃塔型杨( P. albax ×P. bolleana) ，从欧洲山杨×新疆杨中选出雅布洛考夫杨( P. treaula ×P. bolleana) [7] 。 加拿大、荷兰在40年代也开始了杨树杂交育种工作，并获得许多杂种。 西欧各国进行了欧洲黑杨和美洲黑杨的杂交工作，从中选育出来的一些杂种
生物与环境工程学院课程论文 转基因作物的研究进展 学生姓名：魏斌聪 学号：200806016139 专业/班级：生物工程081班 课程名称：生物工程原理 指导教师：陈蔚青教授 浙江树人大学生物与环境工程学院 2011年5月
转基因作物的研究进展 魏斌聪 （浙江树人大学生物与环境工程学院生工081班浙江杭州310015） 摘要：人们将所需要的外源基因(如高产、抗病虫害优质基因) 定向导入作物细胞中, 使其在新的作物中稳定遗传和表现,产生转基因作物新品种, 是大幅度提高作物产量的一项新技术。本文先描述了转基因作物的发展进程，对其基因问题的研究作了讨论，并列出转基因作物目前存在的主要问题并作分析，最后对此项技术作出展望。 关键词：转基因作物；DNA技术；基因导入；安全性 前言 转基因植物（transgenic plant），是指基因工程中运用DNA 技术将外源基因整合于受体植物基因组、改变其遗传组成后产生的植物及其后代。转基因植物的研究主要在于改进植物的品质，改变生长周期等提高其经济价值或实用价值。[ 1 ]其主要范围是在作物方面，如可食用的大豆、玉米等，或者可投入生产的棉花等作物。 从表面上看来，转基因作物同普通植物似乎没有任何区别，它只是多了能使它产生额外特性的基因。从1983年以来，生物学家已经知道怎样将外来基因移植到某种植物的脱氧核糖核酸中去，以便使它具有某种新的特性：抗除莠剂的特性，抗植物病毒的特性，抗某种害虫的特性。[ 2 ]这个基因可以来自于任何一种生命体：细菌、病毒、昆虫等。这样，通过生物工程技术，人们可以给某种作物注入一种靠杂交方式根本无法获得的特性，这是人类9000年作物栽培史上的一场空前革命。[ 3 ] 1 转基因作物的发展进程 转基因作物的研究最早始于20世纪80年代初期。1983年，全球第一例转基因烟草在美国问世。1986年，首批转基因抗虫和抗除草剂棉花进入田间试验。1996年，美国最早开始商业化生产和销售转基因作物(包括大豆、玉米、油菜、
分子标记技术及其在植物药材亲缘关系鉴定中的应用 分子标记技术 分子标记（Molecular Markers）是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接反映[1]。与其他几种遗传标记——形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有极大的优越性：大多数分子标记为共显性，对隐性性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速[2]。 技术种类及原理 分子标记技术自诞生起已研究出数十种，尽管方法差异显著，但都具有一个共同点，即用到了分子杂交、聚合酶链式反应（PCR）、电泳等检测手段。应用较为广泛的技术有以下几种： 1.限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphisms，RFLP） RFLP是最早开发的分子标记技术，指基因型间限制性内切酶位点上的碱基插入、缺失、重排或突变引起的，是由Grodzicker等于1974年创立的以DNA-DNA杂交为基础的遗传标记。基本原理是利用特定的限制性内切酶识别并切割不同生物个体的基因组DNA，得到大小不等的DNA片段，所产生的DNA数目和各个片段的长度反映了DNA分子上不同酶切位点的分布情况[3]。通过凝胶电泳分析这些片段，就形成不同带，然后与克隆DNA探针进行Southern 杂交和放射显影，即获得反映个体特异性的RFLP图谱。它所代表的是基因组DNA在限制性内切酶消化后产生片段在长度上差异。由于不同个体的等位基因之间碱基的替换、重排、缺失等变化导致限制内切酶识别和酶切发生改变从而造成基因型间限制性片段长度的差异。 RFLP的等位基因其有共显性特点，可靠性高，不受环境、发育阶段或植物器官的影响。RFLP标记位点数量不受限制，通常可检测到的基因座位数为1—4个，标记结果稳定，重复性好。RFLP技术也存在一些缺陷，主要是克隆可表现基因组DNA多态性的探针较为困难；另外，RFLP分析工作量大，成本高，使用DNA量大，使用放射性同位素和核酸杂交技术，不易自动化，尽管结合PCR技术，RFLP仍在应用，但已不再是主流分子标记。 2.随机扩增多态性DNA（Random Amplification Polymorphism，RAPD） RAPD技术是1990年由William和Welsh等人利用PCR技术发展的检测DNA多态性的方法，其基本原理是利用随机引物（一般为8—10bp）通过PCR反应非定点扩增DNA片段，然后用凝胶电泳分析扩增产物DNA片段的多态性。扩增片段多态性便反映了基因组相应区域的DNA多态性。RAPD所使用的引物各不相同，但对任一特定引物，它在基因组DNA序列上有其特定的结合位点，一旦基因组在这些区域发生DNA片段插人、缺失或碱基突变，就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化，从而导致扩增产物数量和大小发生改变，表现出多态性[4]。就单一引物而言，其只能检测基因组特定区域DNA多态性，但利用一系列引物则可使检测区域扩大到整个基因组，因此，RAPD可用于对整个基因组DNA进行多态性检测，也可用于构建基因组指纹图谱。 与RFLP技术相比，RAPD技术操作简便快速，省时省力，DNA用量少，同时无需设计特定的引物，扩增产物具有丰富的多态性。但RAPD也存在一些缺点：(1)RAPD标记是一个显
桃分子标记研究进展 Peach molecular mark research development XXX 园艺学院 摘要桃在我国已有几千年的栽培历史，在我国水果市场中占有非常重要的地位。但由于其耐贮性差，一直以来都是育种工作者进行品种改良的重要目标。但其常规杂交后代单株占地面积大, 播种后3～4 a 才能开花结果, 养护费用高, 育种周期长、效率低。 本文从桃的基因定位、遗传图谱的构建进行总结探索，将对其育种改良工作有推动和指导作用。 关键词桃分子标记基因定位遗传图谱问题及展望 Abstract th e peach has been planted for a long history in our country.It is very important in the fruit-market in our country . But because not able to bear a longtime store,It has been an important target for the breeder to improve the peach cultivar for a long time.But the conventional hybrid generation takes up a large field,blossoms three to four years after breeded,needs a high cost care.It takes a long time breeding cycle but with a low efficiency.This article summarises from the construction of the peach’s genetic mapping and explores it. That Will have impetus and instruction function to the breeding improvement work of peach. Keyword peach, molecular mark, genetic mapping construction ,problems and forecast 桃属于蔷薇科( Rasaceae) 桃属( Prunus) ,是我国最古老的果树树种,栽培历史悠久,分布十分广泛,是我国重要的果树种类。桃是自花授粉果树, 许多重要的经济性状属于单基因控制的质量性状,它的染色体数目少(2n = 16) ,基因组小,含有0. 30 ±0. 02PgDNA ,大约有3. 0 ×108bp。只有拟南芥基因组的两倍,是最适合进行遗传学研究的多年生果树之一。 分子标记是近年发展起来的一种较理想的遗传标记形式。如限制性片段长度多态性( R FL P) 、随机扩增多态性(RAPD) 、扩增片段长度多态性(AFLP) 、简单重复序列(SSR) 、测定序列标签位点( STS) 、序列特异性扩增区域(SCAR) 、表达序列标签( EST) 、简单序列长度多态性(SSL P) 、微卫星DNA(MS) 、数量可变串联重复(VNTR) 等,已广泛应用于制作遗传连锁图谱、基因标记定位和克隆、种质鉴定、分子标记辅助选择、遗传多样性分析等多种研究领域。 1 分子标记技术在桃种质资源研究上的应用 目前,国家非常重视种质资源的收集、保存和利用工作。随着现代分子生物学发展,分子标记为种质资源的亲缘演化、分类、种质保存等研究工作提供了有力的依据,使其能更有效的保护、利用果树种质资源。 1. 1 桃属种的系统发育和分类 桃品种依果实特性分为普通桃、油桃、蟠桃，依用途可分为鲜食桃、加工桃及观赏桃，依果肉色泽分白肉桃、黄肉桃，依成熟期早晚可分为极早熟、早熟、中熟、晚熟和极晚熟桃（果实发育期分别为80天以下、80~100d、100~120d、120~150d、150d以上）[ 1 ]。有些学者将桃属分为6 个种,即普通桃、新疆桃、甘肃桃、光核桃、山毛桃、陕甘山桃,其中蟠桃、油桃、寿星桃是普通桃的变种。随着分子标记在种质资源研究中的大量应用,对桃种质资源的分类有了新的认识。杨英军对普通桃、新疆桃、山桃、甘肃桃及部分品种、变种进行多态性分析,新疆桃被归入普通桃中,推测它起源于普通桃。程中平等[ 2 ]也发现新疆桃是普通桃
DNA分子标记技术及其应用 摘要：分子遗传标记是近年来现代遗传学发展较快的领域之一。本文系统阐述了DNA分子标记的概念，以及RFLP、RAPD、ALFP、STS、SSR和SNP为代表的分子标记技术的原理和主要方法，并简单介绍了DNA分子标记技术的应用。最后探讨了其进展以及存在的一些问题。 关键词：分子标记；应用 分子遗传标记技术作为一种新的分子标记技术，在分子生物学特别是在分子遗传学的研究中得到了广泛的应用和发展，其所构建的遗传图谱具有高度的特异性。与其它遗传标记相比较，DNA分子标记具有诸多优点，如：遗传稳定，多态性高，多为共显性，数量丰富，遍及整个基因组，操作简便。这些优点使其广泛地应用于生物基因组研究、进化分类、遗传育种、医学等方面，成为分子遗传学和分子生物学研究与应用的主流之一。 1DNA分子标记的概念 遗传标记是基因型特殊的易于识别的表现形式，在遗传学的建立和发展过程中起着重要作用。从遗传学的建立到现在，遗传标记的发展主要经历了4个阶段，表现出了4种类型：1形态标记（Morphological Markers），指生物的外部特征特性,包括质量性状作遗传标记和数量性状作遗传标记；2细胞标记（Cytological Markers），主要指染色体组型和带型；3生化标记（Biochemical Markers），指生物的生化特征特性，主要包括同工酶和贮藏蛋白两种标记；4DNA分子标记（Molecular Markers）是以生物大分子（主要是遗传物质DNA）的多态性为基础的一种遗传标记。前3种标记是对基因的间接反映,而DNA分子标记是DNA水平遗传变异的直接反映。与其它遗传标记相比较，DNA分子标记具有诸多优点，如：遗传稳定，多态性高，多为共显性，数量丰富，遍及整个基因组，操作简便。这些优点使其广泛地应用于生物基因组研究、进化分类、遗传育种、医学等方面。目前，被广泛应用的DNA分子标记主要有RFLP（限制性片段长度多态性）、RAPD（随机扩增多态性DNA）、ALFP（扩增片段长度多态性）、STS（序列标记位点）、SSR（简单重复序列）和SNP（单核苷酸多态性）等。 2分子遗传标记技术的种类 2.1RFL P标记 RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性片段长度多态性)标记,是人类遗传学家Botstein等于1980年提出的,是以Southern杂交为核心的第一代分子标记技术。它是用限制性内切酶切割不同个体基因组DNA后,用印迹转移杂交的方法检测同源序列酶切片段在长度上的差异。这种差异是由于变异的产生或是由于单个碱基的突变所导致的限制性位点增加或消失,或是由于DNA序列发生 插入、缺失、倒位、易位等变化所引起的结构重排所致。其差异的检测是利用标记的同源序列DNA片段作探针进行分子杂交,再通过放射自显影(或非同位素技术)实现的。 与传统的遗传标记相比,RFL P标记具有下列优点: (1)RF LP标记无表型效应,其检测不受外界条件、性别及发育阶段的影响；
《园艺植物育种技术进展》论文 摘要：本文简述了辣椒起源、种质资源、主要性状遗传以及育种手段，对辣椒育种进行了简要概述，为生产利用提供参考。 关键词：辣椒种质育种 一、概述 （一）起源 辣椒（pepper），别名番椒、海椒、秦椒、辣茄。因在胎座附近隔膜及表皮细胞中含有辣椒素二具有辛辣味（甜椒除外），是世界性的重要蔬菜和调味品。主产地在印度德干半岛。辣椒原产中、南美洲、墨西哥、秘鲁等地。公元前6500～5000年，在墨西哥中部拉瓦堪山的遗迹中曾有辣椒种子出土；在南美秘鲁公殛前2000年的古墓中，发现干辣椒和栽培种子。辣椒同属植物有27种。其中五个主要栽培种起源于3个不同的中心：墨西哥是Capsicum annum的初级起源中心，次级起源中心是危地马拉；亚马孙河流域是C.chinense和C.Fruteseens的初极起源中心，秘鲁和玻利维亚是C.pendulum和C.Pubescens的初级起源中心。（二）分布 哥伦布到了北美大陆后发现了不次于胡椒的上等辛香料—辣椒，结果吧比胡椒更为重要的辣椒带回欧洲。1493年传到西班牙，1548年传到英国，16世纪中叶已传遍中欧各国。1542年西班牙人、葡萄牙人将辣椒传入印度。进入17世纪，许多辣椒品种传入东南亚各国。 明朝末年（1640年）引入中国。早在16世纪后期高濂撰写的《草花谱》中已有记载：“番椒丛生，百花，果俨似秃笔头，味辣，色红，甚可观”。 现在，辣椒在世界温带、热带地区均有种植。主要产地是印度，尤其是德干半岛的中南部最盛。拉丁美洲、非洲、亚洲种质资源丰富。 （三）生产现状 亚洲是全球最大的辣椒生产、消费区域。中国、印度位居全球辣椒种植面积、产量的前2位，辣椒产品加工也在全球辣椒产业发展中占有重要地位。目前，欧洲主要辣椒生产国有西班牙、荷兰、以色列、匈牙利、土耳其、葡萄牙、德国等。
分子标记在番茄抗性育种中研究进展 摘要：本文综述了近年来RFLP RAPD SSA AFLP CAPS和SNP分子标记技术在番茄抗性育种上的应用，分析了目前的研究进展，对今后研究的重点进行了讨论。 关键词：分子标记；番茄；抗性；进展。 Molecular marker in tomato resistance breeding research progress in Abstract: This paper reviewed recent RFLP RAPD SSA AFLP CAPS and SNP in the application of tomato resistance breeding, analysis of the current research progress, the focus of the future research are discussed. Key words: Molecular markers; tomato; resistance; progress. 番茄既是蔬菜也是水果, 其中含有丰富的维生素C对心血管有良好的保护作用；番茄红素具有良好的抗氧化作用,能清除体内废物,增加免疫力。它也是营养师大力提倡的减肥食品。它早已成为人们日常生活中的不可缺少的食物。 随着遗传学的发展,遗传标记的种类和数量也在不断增加。形态标记、细胞学标记、生化标记都是以基因表达的结果(表现型)为基础,是对基因的间接反映;而DNA分子标记则是DNA水平遗传变异的直接反映。与表型标记相比,DNA分子标记具有能对各发育时期的个体、组织、器官甚至细胞作检测,既不受环境的影响,也不受基因表达与否的限
作物转基因技术的研究进展 摘要：作为生物技术领域的前沿，转基因技术已在多种植物上取得重大进展。本文主要介绍了当前作物转基因技术的三大主流方法：农杆菌介导法、基因枪介导法和花粉管通道法，并阐述了这几种转基因技术在水稻、小麦、棉花、玉米、大豆，甘薯等几种主要农作物的应用进展状况。 关键词：转基因技术、农作物、应用 Genetically Modified---转基因，简称GM，是指运用科学手段从某种生物体中提取所需要的基因，将其转入另一种生物中，使与另一种生物的基因进行重组，再从结果中进行数代的人工选育，从而获得特定的具有变异遗传性状的物质。而其衍生出的转基因技术就是将人工分离和修饰过的基因导入到目的生物体的基因组中，从而达到改造生物的目的，即把一个生物体的基因转移到另一个生物体DNA中的生物技术。 1983年比利时科学家Montagu 等人和美国Monsanto 公司Fraley等人分别将T- DNA上的致瘤基因切除并代之以外源基因,获得了世界上第一株转基因植株———转基因烟草。自此之后，作物转基因技术得到了迅速发展.截至目前,几乎所有的作物都开展了转基因研究,育种目标涉及到高产、优质、高效兼抗性及多用途等诸多方面.一批抗病、抗虫、抗逆、抗除草剂等转基因作物已进入商品化生产阶段. 国际农业生物技术应用服务组织2 月13 日在京发布的1 份报告显示，全球27 个国 家超过1800 万农民，2013 年种植转基因作物，种植面积比2012 年增加了500 万公顷。此外，首个具有耐旱性状的转基因玉米杂交品种亦于2013 年在美国开始商业化。 据该报告显示，全球转基因作物的种植面积于转基因作物商业化的18 年中增加了100 倍以上，从1996 年的170 万公顷增加到2013 年的1.75 亿公顷，其中美国仍是全球转基因作物的领先生产者，种植面积达7010 万公顷，占全球种植面积的40%。国际农业生物技术应用服务组织创始人兼荣誉主席、本年度报告作者Clive James 表示，目前排名前10 位的国家种植转基因作物的面积均超过100 万公顷，这为将来转基因作物的多样化持续发展打下了广泛基础。在种植转基因作物的国家中，有19 个为发展中国家，8 个为发达国家；发展中国家的种植面积连续2 年超越发达国家。 目前，作物遗传转化的方法有农杆菌介导法、基因枪法、电激法、PEG 法、脂质体法、低能离子束法、超声波介导法、显微注射法、花粉管通道法等.但在当前作物基因工程研究中,主要采用农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法,这三种转基因技术也相对较为成熟. 一、农杆菌介导法 农杆菌介导法是指农杆菌侵染植物时，受到植物受伤后释放的酚类物质的刺激，活化质粒上Vir 区基因的表达，将质粒上的另一段DNA（T-DNA）共价整合到植物基因组上，在植物体内表达而改变植物的遗传特性。农杆菌介导法的转化效率受众多因素影响，如农杆菌侵染外植体的影响因素、外植体再生能力的内在因素和环境条件（pH、温度和光照条件）等[32]，此法具有流程简单、仪器设备便宜、拷贝数低[33]，且基因沉默少，转移的基因片段长等优点。 农杆菌介导法是获得第一个转基因植物的方法，迄今为止，农杆菌介导法获得的转基因植物占转基因植物总数85%，已成为植物基因转化首选方法。 二、基因枪介导法 基因枪法又称微弹轰击法，是将外源基因包裹在直径1~2 nm的钨或金颗粒表面，加速轰击植物外植体靶组织，穿过植物细胞壁和细胞膜而将外源基因带入植物细胞。因此，通过该方法进行DNA的转移过程不受外植体基因型的限制，可以将外源基因转移至几乎所有的植物细胞、组织器官和原生质体中。 最早的基因枪是由美国Cornel 大学的Sanford 等在1987 年研制成功的。目前基因枪介
分子标记 1.分子标记技术及其定义 1974年,Grozdicker等人在鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时, 利用限制性内切酶酶解后得到的DNA片段的差异, 首创了DNA分子标记。所谓分子标记是根据基因组DNA存在丰富的多态性而发展起来的可直接反映生物个体在DNA水平上的差异的一类新型的遗传标记,它是继形态学标记、细胞学标记、生化标记之后最为可靠的遗传标记技术。广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质分子。通常所说的分子标记是指以DNA多态性为基础的遗传标记。分子标记技术本质上都是以检测生物个体在基因或基因型上所产生的变异来反映基因组之间差异。 2.分子标记技术的类型 分子标记从它诞生之日起, 就引起了生物科学家极大的兴趣,在经历了短短几十年的迅猛发展后, 分子标记技术日趋成熟, 现已出现的分子标记技术有几十种, 部分分子标记技术所属类型如下。 2.1 建立在Southern杂交基础上的分子标记技术 (1) RFLP ( Rest rict ion Fragment Length Polymorphism)限制性内切酶片段长度多态性标记； (2) CISH ( Chromosome In Situ Hybridization) 染色体原位杂交。 2.2 以重复序列为基础的分子标记技术 (1) ( Satellite DNA ) 卫星DNA； (2) ( Minisatellite DNA ) 小卫星DNA; (3) SSR( Simple Sequence Repeat ) 简单序列重复, 即微卫星DNA。 2.3 以PCR为基础的分子标记技术 (1) RAPD ( Randomly Amplif ied Polymorphic DNA ) 随机扩增多态性DNA； (2) AFLP( Amplif ied Fragment Length Polymorphism) 扩增片段长度多态性； (3) SSCP( Single Strand Conformation Polymorphism) 单链构象多态性； (4) cDNA-AFLP( cDNA- AmplifiedFragment Length Polymorphism) cDNA -扩增片段长度多态性； (5) TRAP( Target Region Amplified Polymorphism) 靶位区域扩增多态性； (6) SCAR ( Sequence Char acterized Amplified Region) 序列特征化扩增区域； (7) SRAP ( Sequencerelated Amplified Polymorphism) 相关序列扩增多态性。 2.4以mRNA为基础的分子标记技术
分子标记在果树上的应用及前景展望 分子标记指可遗传并可检测到的DNA序列或蛋白质。蛋白质标记主要是指同工酶、等位酶、贮藏蛋白等等，本文主要介绍DNA标记。理想的分子标记应具有以下几个条件： ①以孟德尔方式遗传。 ②多态性好，自然条件下存在许多变异位点。③遍布整个基因组，能够检测到整个基因组的变异。 ④共显性遗传，即可以区别纯合体和杂合体。⑤表现“中性”，即不影响目标性状的表达。⑥重复性好，便于资源共享。⑦自动化程度高。近年来，关于分子标记的研究进展很快，本文仅就分子标记在果树研究中的应用及存在问题做一介绍，并对应用前景做一展望。 一、分子标记在果树研究中的应用： 1.分子标记在种质资源研究中的应用。 （1）系谱分析和分类。物种在进化过程中，其DNA是一个渐变的过程。遗传关系越近，基因组DNA的差异越小，反之，差异越大。HARADAT等用RAPD标记对两个三倍体苹果品种“乔纳金”和“陆奥”进行了分析，结果表明，作为母本的金冠提供了减数的二倍体配子。沈向等对杏进行了RAPD分析，将41个品种分为5类。 （2）种质保存和核心种质的建立。如何事理有效地管理和利用种质资源，当今世界出现了两种趋势，其中之一就是建立核心种质。目的是以最少的种质样品重复而最大地包含一个种及其野生种的遗传多样性。分子标记为人们提供了一个有效、快速的途径。目前已建立的核心种质涉及到谷物、豆类、牧草、蔬菜和果树等。AMY K SZEWC-MCFADDEN等用SSR结合园艺性状建立了苹果的核心种质，HOKANSON等也建立了苹果核心种质。 （3）构建指纹图谱和品种鉴别。高质量的指纹图谱可作为新品种登记、注册和产权保护的重要依据。特别是对于无性繁殖的果树来说，同物异名、同名异物现象很严重，利用分子标忘本中高效、准确地建立指纹图谱、鉴别果树品
第22卷 第6期2000年11月 北 京 林 业 大 学 学 报 JO UR NAL OF BEI JI NG F OREST R Y U N IV ERSIT Y Vol.22,N o.6Nov.,2000 2000 07 10收稿 http://w w https://www.doczj.com/doc/b07524340.html,/periodi cal/bjlydxxb/ * 九五 国家攻关课题(96 011 02 04 02)的部分内容 杨树分子标记研究进展* 张德强 张志毅 (北京林业大学毛白杨研究所,100083,北京;第一作者男,26岁,博士生) 杨 凯 (中国农业科学院作物品种资源研究所,100081,北京) 摘要 该文介绍了在杨树育种中常用的三种分子标记:RF LP,RAP D 和A FL P,并综述了其在杨树指纹图谱、遗传图谱构建和数量性状基因定位等方面的研究进展. 关键词 杨树,分子标记,指纹图谱,遗传图谱,数量性状基因定位中图分类号 S792.11 Zhang Deqiang ;Zhang Zhiyi;Yang Kai.Advances of molecular marker researches in poplar.Jour nal of Beij ing For estry Univer sity (2000)22(6)79~84[Ch,33ref.]Institute of Pop ulus tomentosa ,Beijing For.Univ.,100083,P.R.China. RFLP(restriction fragment length polymorphism ),RAPD(random amplified poly morphic DNAs)and AFLP (amplified frag ment length polymorphism)are introduced and their applications to finger prints,genetic linkage maps constructing and QT Ls mapping in poplar are review ed in this paper.Key words poplar,molecular marker,fingerprints,genetic maps,QT Ls mapping 杨树属杨柳科(Salicaceae )、杨属(Pop ulus L.),约有100多种,广泛分布于欧洲、北美和亚洲,是防护林、水土保持林、四旁绿化及人工用材林的重要树种.很多年来,虽然林木育种学家对其生理生化、解剖构造等基础性研究较深入,对于杨树的遗传改良产生了巨大的推动作用,但对于常规育种中抗病、抗虫性状、性别决定及林木早期选择育种等问题仍无法从根本上解决[1~6].因此,对杨树进行分子生物学研究迫在眉睫. 杨树种间杂交和无性繁殖容易,杨属所有种的染色体数均为2n=38,核基因组相对较小(2c= 1.1~1.2pg),便于遗传操作,并已建立较完善的遗传转化体系,获得了转基因植株.因此,杨树是公认的林木生物学基础研究中的模式树种.由于杨树种间杂交容易,在F 1代有很强的杂种优势(材积生长量),杂种的F 2代在许多性状方面可发生广泛的分离,所以大量的分离群体在F 1代或F 2代很易建成[7~ 10] .十几年来,前人利用分子标记技术对杨树 基因组进行了指纹图谱绘制、遗传图谱构建及数量 性状基因定位. 在杨树中,常用的分子标记为RFLP,RAPD 和 AFLP,它们是继形态标记(M orpholog ical markers)、细胞学标记(Cytological m arkers)和生化标记(Bio chemical markers)之后发展起来的一种以DNA 多态性为基础的新一代遗传标记.与形态标记和生化标记相比,分子标记具有明显的优越性:大多数分子标记是共显性的,基因组变异极其丰富,分子标记的数量几乎是无限的,在植物发育的不同阶段,不同组织的DNA 都可用于标记分析;分子标记不受环境影响,其变异只源于等位基因DNA 序列的差异,与不良性状无必然的连锁,不需专门创造特殊的遗传材料 [7~20] .基于上述这些优点,分子标记技术可为 杨树生产提供准确、可靠的遗传标记. 1 分子标记概述 分子标记是分子生物学发展的产物.80年代初,发展了RFLP,随后其发展极为迅速,产生了多种分子标记技术,用于杨树遗传育种的主要有以下3种. (1)RFLP RFLP(Restriction Frag ment Length Polymorphisms)指限制性片段长度多态性,是杨树遗传育种中使用较多的一种分子标记[21~ 25] .
第28卷第4期2001年12月 湖南林业科技 Hunan Forestry Science &Technolog y Vol.28No.4Dec.2001 收稿日期:2001-09-03 修订日期:2001-10-28 文章编号:1003-5710(2001)04-0019-07 林木转基因工作研究进展 贺晶,谭晓风,杨伟 (中南林学院经济林育种与栽培国家林业局重点实验室,湖南株洲 412006) 摘 要:综合论述了近年来国内国外林木转基因工作研究进展,其中主要就林木转基因的方法、转基因植株鉴别、转基因在林木上的应用几方面进行了探讨,并将国内外林木转基因工作列表加以综合,最后指出了林木转基因工作中尚存在的问题及对未来转基因工作的展望。关键词:林木;转基因;研究进展中图分类号:Q813 文献标识码:A The progress of gene transformation in trees H E Jin,TA N Xiao-feng,YA NG Wei (National Forestr y Bureau Key L aboratory of No n-timber Product For est ry Br eeding and Cultiv ation,Central South Forestry U niv ersity, Zhuzhou 412006,Hunan,China) Abstract:The prog ress of gene transformation in forest trees w as summarized in the paper.T he methods,the identification and application w ere major discussed in the paper.The internal and ex ternal study achievements w ere sum med up in two charts.At the end of the paper,the existing problems and outlook of the gene trans form ation in trees w ere pointed out. Key words:forest tree;gene transformation;prog ress 生物技术自70年代崛起以来,发展非常迅猛,现已成为世界新技术革命的重要组成部分。生物技术将为人类的未来带来极大的社会效益和经济效益,尤其对未来的农林业生产将带来一场新的绿色革命。植物基因工程技术是植物生物技术的核心内容之一,它是将带有一些特有性状的基因克隆,并通过生物、物理、化学等方法,导入受体植物细胞,得到具有外源基因表达的转基因植物。外源基因导入植物受体包括目的基因的分离,外源基因与载体分子的体外连接,基因转化,转基因植株培养,外源基因的鉴别等步骤。林木转基因研究工作与农作物等其他草本植物相比,一直处于相对比较 落后的位置,近几年来,随着分子生物学研究技术不断成熟,木本植物在这一方面也取得了长足的进步,本文旨在对林木转基因研究工作现状做一综述。 1 林木转基因方法 基因转移方法大致可以分为两类:一类是基因的直接转化法;另一类是通过一种可以使植物致瘤的土壤农杆菌的质粒来转化植物[1]。1 1 直接DNA 转化法 直接DNA 转化法是将外源基因(DNA)直接转化植物原生质体或植物细胞,由此获得转基因植物。这些方法包括以原生质体为受体的PEG 转化法、电激法、脂质体介导转化法、显微注射法、激光微束法、超声波法、花粉管通道法以及基因枪技
遗传标记的发展和应用 1 遗传标记的种类 遗传标记是指在遗传分析中区分不同遗传背景的研究对象的可遗传的标记，根据研究水平的不同，可分为形态学标记、同工酶标记和DNA分子标记。Mendel 在经典的豌豆杂交实验中就使用了花色等可用肉眼识别的形态标记。虽然在早期的很长一段时间里，科学家们都在利用形态标记进行连锁分析和遗传作图（Sax, 1923），但由于形态标记数目较少,而且易受环境因素的影响，在界定过程中也易受人为因素影响，不是很准确，因此就限制了其应用和发展。同工酶是指具同一底物专一性的不同分子形态的酶。同工酶的概念虽然早就被提出，但由于技术限制，直到五十年代淀粉凝胶电泳酶谱技术的发明（Hunter and Market, 1957），同工酶技术才得以在遗传学研究中被广泛利用。同工酶标记是一种共显性标记，在不同组织、不同发育阶段和不同物种间可能具多态性，稳定而不受环境影响。但其数目和多态性对于迅猛发展的遗传学研究来说，依然是远远不够的。 随着分子生物学的快速发展，对遗传物质—DNA的认识和体外操作技术水平的不断提高，产生了新的基于DNA水平的分子标记。这类分子标记的多态性是由于DNA水平上的各种变异如：倒位、易位、缺失、插入和单个碱基突变造成的。在长期的自然选择过程中，基因组中积累了大量这种可遗传的变异，并且是均匀地分布于全基因组中的。因此DNA分子标记相对于同工酶标记和形态学标记具有数目丰富、多态性高、稳定不受环境影响等优点。根据DNA分子标记的工作原理可将其分为两类，一为以限制性酶切和分子杂交技术为基础的RFLP标记（Bastein, 1980）, RFLP标记最早是应用于人类基因组研究中，现已广泛地在动、植物的基因组研究中使用于遗传作图，基因定位等方面（Burr et al., 1988; Apuya et al., 1988; Mccouch et al., 1988; Tanksley et al., 1992）。而另一类则是以聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction PCR）为基础的标记。随着PCR 技术的发明和广泛应用，一大批基于此技术的新型分子标记如RAPD（Williams et al., 1990）、AFLP（Zabeau and Vos, 1993）、SSR（Litt and Luty, 1989; Wu, 1993）等也迅速发展起来。RAPD是一种显性标记，以一段通常为10个碱基左右的随机寡核苷酸作为引物在基因组中进行扩增，由于引物的随机性，因此数量巨大，而且由于其主要是基于PCR技术，因此操作相对简便。AFLP标记是以两种限制性内切酶去酶切DNA，然后在两端分别加上两个接头，再进行两次选择性扩增，通常一次扩增可以得到相当多的带，在降低了错误扩增的几率后，AFLP是一种十分高效的标记，而且由于两种限制性内切酶可以任意组合，因此从理论上来说AFLP标记的数目几乎是无限的。AFLP标记可能为显性或共显性。SSR标记多为共显性标记，它是指在基因组中的一些有少数几个（2、3、4）核苷酸组成的简单重复序列，由于在生物的长期进化过程中这些重复序列所处的染色体位置