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绿色荧光蛋白作为标记蛋白在胰岛素表达的初步研究摘要】目的探讨绿色荧光蛋白作为标记蛋白其荧光强度与胰岛素表达量的相关性。
方法构建重组质粒prIns1EGFP，转染HIT-T15仓鼠胰岛瘤细胞，随机分为3组，低糖组（LG）、中糖组（MG），高糖组（HG）, 检测基线0小时及葡萄糖刺激后4小时内胰岛素分泌量及单个胰岛β细胞荧光强度。
结果 HG组单个胰岛β细胞荧光强度，胰岛素分泌量较LG组明显增强（P＜0.05），在一定葡萄糖浓度范围内，绿色荧光蛋白其荧光强度随着葡萄糖浓度的升高而升高，并与细胞胰岛素分泌量呈明显的正相关，相关系数R为0.896。
（P＜0.05）结论绿色荧光蛋白作为分子标记物其荧光强度与胰岛素分泌量有正相关性。
【关键词】绿色荧光蛋白细胞转染相关性胰岛素【中图分类号】R39 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2014）07-0157-02细胞作为生命体结构基本单元，要了解一些生命活动规律，就须以细胞为研究基础，要对单细胞进行分析，可引入荧光标记蛋白。
绿色荧光蛋白（GFP）是近年来在生物化学和细胞生物学中应用最广泛的标记蛋白之一[1]，常被用于研究单个细胞的蛋白表达或者转染后基因的表达、调控、细胞分化及蛋白质在生物体内定位和转运等[2]，免疫分析、核酸碱基探针分析，以及分子间第二信使钙离子和cAMP水平的指示,荧光关联谱学、细胞分类选择和细胞系分析，细胞间隙pH变化的检测[3] ，用于研究转染后基因的表达，可通过荧光显微镜观察或流式细胞仪定量检测，可对细胞内绿色荧光蛋白表达水平进行半定量的检测[4]，该方法简单有效。
但应用中仍有问题亟待解决，荧光信号强度的非线性性质使得定量非常困难，目前通过检测绿色荧光蛋白的荧光强度来定量检测转染后单个细胞内蛋白质的量仍无明确报道。
为进一步探讨绿色荧光蛋白作为标记蛋白其荧光强度与胰岛素表达量的相关性，本实验用重组质粒prIns1EGFP转染HIT-T15细胞后，在荧光显微镜下连续4小时实时监测单个胰岛细胞的荧光强度情况。
绿色荧光蛋白(GFP)原核表达情况分析姓名：韩吉梅学号：2013107001 专业：作物栽培学与耕作学摘要：将含有绿色荧光基因的重组载体导入大肠杆菌中,经IPTG诱导产生大量融合蛋白,用SDS-PAGE来确定目的蛋白的可溶性及其分子量。
考马斯亮蓝染色4小时再过夜脱色，观察目的蛋白的分子量大约为31.9kD,与预期值相符。
关键字：绿色荧光蛋白SDS-PAGE 原核表达1 前言绿色荧光蛋白（green fluorescent protein GFP) 是源于多管水母属等海洋无脊椎动物的发光蛋白，其在蓝光或紫外光下可发出明亮的绿色荧光，可以作为报告基因检测蛋白的特异性表达或进行细胞定位研究。
绿色荧光蛋白还在监测目的基因表达、研究细胞内物质代谢及追踪细胞系的分化等方面有着广泛应用。
由于GFP检测具有高灵敏度,操作简单,无需使用同位素等优点,近年来广泛用于基因的表达与调控、蛋白质的定位、转移以及相互作用、信号传递、转染与转化,以及细胞的分离与纯化等研究领域[1-2]。
采用GFP作为标记基因,可直接收集转化细胞供实验,缩短了筛选时间、减少对细胞活性的影响并可作为活体标记,为研究发育的基因调控和分子机制提供了一种简洁有效的手段[3-4]。
同时也正因为其荧光反应不是酶反应,所以当细胞本身还存在一些可以受蓝光激发和产生绿色荧光的物质,或者GFP表达频率不高的情况下,GFP的检测可能会产生一些假相,不易对荧光进行定量的测定。
我们利用基因工程手段在大肠杆菌中高效的表达了GFP,制备出GFP抗体,利用抗原与抗体之间的特异性,在体外对GFP进行检测,可在一定程度上弥补上述GFP检测中可能出现的问题,可以作为一种重要的辅助手段用以提高GFP检测的灵敏度和准确度[5]。
原核表达是将克隆基因插入合适载体后导入大肠杆菌，用于表达大量蛋白质的方法。
选用原核表达系统的原因是易于生长和控制、用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞培养的材料昂贵、有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。
绿色荧光蛋白作为报告基因在分子生物学中的应用绿色荧光蛋白作为报告基因在分子生物学中的应用摘要：随着科学技术的不断更新和发展，绿色荧光蛋白在动物学、植物学、微生物学等领域的应用研究越来越广泛。
绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)可作为报告基因，且具有分子量较小、荧光性质稳定、对生物体无毒性作用、检测时不需要底物等的特点。
本文就对荧光蛋白在分子生物学中的应用做一综述。
关键词：绿色荧光蛋白；报告基因；应用The Application of GFP As Reporter Gene In the Molecular Biology Abstract: With the upgrade and development of science and technology, the application of green fluorescent protein used in Zoology, Botany and microbiology is more extensive. As a reporter gene, GFP have some characteristics, such as low molecular weight, good fluorescent stability, non- toxicity to organisms. This paper reviews the application of GFP in the molecular biology. Key words: green fluorescent protein, reporter gene, application of GFP绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)是一类来自于海洋生物如水母、水螅和珊瑚等腔肠动物内的一种生物发光蛋白，当受到紫外或蓝光激发时，能发射出绿色荧光。
绿色荧光蛋白研究进展动物医学进展,2008,29(1):56259Progress in Veterinary Medicine绿色荧光蛋白研究进展王晓丽1,邵卫星2,单虎13(1.青岛农业大学动物科技学院,山东青岛266109;2.中国动物卫生与流行病学中心,山东青岛266071)摘要:来源于海洋多管水母属的绿色荧光蛋白(GFP)基因是目前惟一在细胞内稳定表达,在蓝光或长紫外光的激发下,不需要任何反应底物及其他辅助因子就能发出绿色荧光的新型报告基因,无种属、组织和位置特异性,且能监测基因表达、信号转导、共转染、蛋白运输与定位,以及细胞系谱分类等。
GFP对细胞无毒性,且检测方法简单,结果真实可靠,目前在多种原核和真核生物研究中得到广泛的应用。
文章就GFP 的生化特性、GFP的改进及其在分子生物学研究中的应用潜力进行简要阐述。
关键词:绿色荧光蛋白;选择标记基因;应用中图分类号:Q516文献标识码:A文章编号:100725038(2008)0120056204随着生命科学和医学研究的不断深入,研究者们迫切需要一种能够在活体中表达且易于检测的报告基因,目前常用的报告基因主要有分泌型胎盘磷酸酯酶(secreted embryo alkaline p ho sp hatase, SEA P)基因、β2半乳糖苷酶(galactosidase)基因、β2葡糖苷酸酶(glucosidase,GU S)基因、萤火虫荧光素酶(luciferase,L UC)基因等[1],但这些基因的检测方法并不理想,它们都需要底物和辅助因子,因而在活体中的应用受到限制。
一种全新的非酶性报告基因———绿色荧光蛋白(green fluorescent p rotein, GFP)引起了人们的关注[2],该蛋白能够自身催化形成发色结构并在蓝光激发下发出绿色荧光。
作为报告基因,GFP是能在活细胞中表达的发光蛋白;作为荧光标记分子,GFP既具有敏感的标记检测率,收稿日期:2007210218作者简介:王晓丽(1981-),女,山东威海人,硕士研究生,主要从事预防兽医学研究。
基于绿色荧光蛋白标记技术的植物细胞分化研究植物细胞分化是植物生长发育过程中非常重要的一环，它决定了植物的形态、结构和功能，是保证植物正常生长和发育的关键因素。
绿色荧光蛋白标记技术是一种在生物体中检测或观察特定基因表达的有力工具，在植物细胞分化研究中得到了广泛的应用。
本文将从绿色荧光蛋白标记技术的基础知识、应用原理、研究进展等方面综述其在植物细胞分化研究中的应用。
一、绿色荧光蛋白标记技术的基础知识1.1 绿色荧光蛋白的发现和分离1988年，Osamu Shimomura从蓝色发光水母中发现了绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)。
随后，Martin Chalfie发现了GFP的基因序列，并且成功地将其引入小鼠、斑马鱼等模式生物细胞中，使得这些细胞发出了明亮的绿色荧光，开创了GFP应用于生物学领域的新时代。
1.2 GFP的生化特性GFP是一种含有238个氨基酸的蛋白质，其大约490-510纳米的荧光光谱在黄绿光区域。
GFP内部内嵌着一个主要负责荧光产生的色团环结构，称为荧光色团环(fluorescent chromophore)，这个环结构的形成需要一个称为四肽环化酶的酶的作用，它能够将三个氨基酸(Cys-Tyr-Gly)连接成为一个四肽。
GFP的很多特性可通过改变它的核苷酸序列或蛋白质翻译后的修饰来进行调节。
二、绿色荧光蛋白标记技术在植物细胞分化研究中的应用原理2.1 基于突变筛选的植物细胞分化标记技术透过人工诱变或通过遗传突变等方法，可诱发部分植物基因的表达。
将这些基因与GFP合并编码后在自身植物基因组进行定位分析，可以标记该细胞在植物细胞分化过程中所处的位置或时期。
这种标记方法要求依赖性较高，因为研究者需要对某一个特定的基因进行变异和筛选才能得到标记，且标记区域为固定染色体某一地点。
2.2 基于转基因技术的植物细胞分化标记技术另外一种标记细胞分化的技术，是基于转基因技术，将被研究的目标基因与GFP融合编码构建植物转基因体系，作为一个构建植物转基因体系，标记细胞分化的技术来使用。
绿色荧光蛋白及其在细胞生物学中的应用绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein，简称GFP）是一种源自于海葵的蛋白质，具有绿色荧光特性。
它的发现和应用为细胞生物学研究带来了巨大的突破，成为了生物学研究中的重要工具。
本文将介绍绿色荧光蛋白的特性和它在细胞生物学中的应用。
绿色荧光蛋白的发现和研究始于上世纪60年代末。
由于GFP具有独特的荧光特性，能够发射绿色荧光，并且不需要外源性荧光素或酶辅助作用，使得它成为细胞生物学研究中的理想标记工具。
通过将GFP基因与其他基因融合，研究人员可以追踪和观察特定基因在活细胞中的表达和运动。
GFP的应用广泛涉及细胞生物学的多个领域。
首先，GFP可以用来研究细胞的结构和形态。
通过将GFP与细胞骨架蛋白或细胞器定位蛋白融合，研究人员可以直接观察细胞骨架的分布和细胞器的定位，进而了解细胞的结构和功能。
GFP在细胞生物学中的应用还包括研究蛋白质的亚细胞定位和动态变化。
通过将GFP与感兴趣的蛋白质融合，研究人员可以实时观察蛋白质在细胞中的定位和运动。
这种技术被广泛应用于研究蛋白质的转运、分泌和降解等过程，有助于揭示蛋白质的功能和调控机制。
GFP还可以用于研究细胞的信号传导和相互作用。
通过将GFP与信号分子或蛋白质相互作用的区域融合，研究人员可以观察信号分子的活动和相互作用过程。
这为研究细胞信号传导通路的调控机制提供了有力的工具。
除了在基础研究中的应用，GFP还被广泛用于生物荧光成像和生物医学研究。
通过将GFP标记的细胞或组织注射到动物体内，研究人员可以实时观察和追踪细胞或组织的活动和变化。
这种技术被应用于研究胚胎发育、神经元活动、肿瘤生长等过程，对于理解生物学的机制和疾病的发生发展具有重要意义。
总结起来，绿色荧光蛋白作为一种重要的标记工具，为细胞生物学研究提供了强大的支持。
通过GFP的应用，研究人员可以实时观察和追踪细胞和蛋白质的活动，揭示细胞的结构和功能，以及了解生物学的机制和疾病的发生发展。
绿色荧光蛋白(GFP)标记亚细胞定位一、原理利用绿色荧光蛋白(GFP)来示踪胞内蛋白的技术。
利用GFP融合蛋白技术来进行活细胞定位研究是目前较为通行的一种方法，在光镜水平进行研究，不需要制样，没有非特异性标记的影响。
并且GFP的分子量为27kD，经激光扫描共聚集显微镜激光照射后，可产生一种绿色荧光，从而对蛋白质进行精确定位。
激光扫描共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope, LSCM, 以下简称共聚焦显微镜）因其独特的设计原理，有效地排除了非焦平面信息，提高了分辨率及对比度，使图像更为精确清晰，因此极其适于进行活细胞内蛋白质、核酸等定位及活体动态研究。
二、主要步骤1．真核表达载体的构建①引物设计利用引物设计软件，根据pEGFP-N1的酶切位点设计目的基因引物：②载体构建将PCR产物酶切后插入pEGFP-N1，得到表达目的基因与EGFP融合蛋白质的真核表达载体。
2．转染真核细胞当细胞生长到对数生长期时，接种到共聚焦显微镜专用的玻璃底培养皿（35mm petri dish，10 mm Microwell）中，培养过夜。
当细胞贴壁率达到30%~50%时，将表达载体质粒2ug和脂质体(Lipofectamine2000) 2ml分别溶于100 ml无抗生素、无血清的DMEM培养基中，充分混匀后，室温放置15 min，再将两种溶液充分混匀，室温放置30 min。
同时用无血清、无抗生素的DMEM洗涤待转染的培养细胞2~3次，向DNA-脂质体混合物中加入800 ml无抗生素、无血清的DMEM培养基，混合后加入到培养细胞中。
培养皿放入37℃孵箱孵育6~8 hr后吸去双无培养液，加入2~3 ml含抗生素和10% FCS的DMEM完全培养基，继续培养24~72 hr。
4．激光扫描共聚焦显微镜观察将上述细胞分别在24、、36、48、72小时用共焦显微镜观察，采用激光扫描共聚焦显微镜，激发波长为488nm，采取图像。
绿色荧光蛋白的应用及其最新研究进展一、关键词：绿色萤光蛋白、酵母双杂交系统、流式细胞仪、下修村、马丁·查尔菲、钱永健二、背景2008年10月8日，三位美国科学家——伍兹霍尔海洋生物学实验室（Woods Hole Marine Biological Laboratory, MBL）的Osamu Shimomura、哥伦比亚大学（Columbia University）的Martin Chalfie以及加州大学圣地亚哥分校（University of California, San Diego）的钱永健（Roger Y onchien Tsien），因在研究和发现绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）方面做出突出贡献而获得诺贝尔化学奖。
绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP）最早由日裔科学家下村修于1962年在水母（Aequorea victoria ）中发现。
而后马丁·查尔菲则证明了GFP在作为多种生物学现象发光遗传标记方面的应用价值。
钱永健阐明了GFP发光的机制，并且发现了除绿色之外可用于标记的其它颜色。
他对细胞生物学和神经生物学领域的贡献具有划时代的意义。
他的多色荧光蛋白标记技术让科学家能够用不同颜色对多个蛋白和细胞进行标记，从而实现了同时对多个生物学过程进行追踪。
现在，三位科学家的研究成果已经作为标记工具在生物科学中得到广泛应用。
三、GFP的主要性能GFP在蓝色波长范围的光照激发下发出绿色荧光，其发光过程需要冷光蛋白质Aequorin 的帮助，而且，这个冷光蛋白质可与钙离子（Ca2+）相互作用。
GFP的激发光谱在400nm 附近有一个主激发峰，在470nm附近有一个次激发峰。
发射光谱在505nm附近有一尖锐的主发射峰，在540nm附近有一肩峰。
在Aequorea victoria 中发现的野生型绿色荧光蛋白的分子量较小，由238个氨基酸残基组成，仅为27~30kDa，而编码GFP的基因序列也很短，为2.6kb。
分子生物学实验设计报告绿色荧光蛋白的克隆表达——闵霞（2013141241165）李彩云（2013141241095）一、引言基因标记技术是近年来发展起来的分子生物学技术。
荧光蛋白基因在标记基因方面由于具有独特的优点而广受科学家们的关注。
荧光蛋白是海洋生物体内的一类发光蛋白，分为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白。
绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
当受到紫外或蓝光激发时，GFP发射绿色荧光。
它产生荧光无需底物或辅因子，发色团是其蛋白质一级序列固有的。
基因克隆技术包括把来自不同物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。
采用重组DNA技术，将不同来源的DNA分子在体外进行特异性切割，重新连接，组装成一个新的杂合DNA 分子。
在此基础上，这个杂合分子能够在一定的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子。
本次实验中，分子克隆质粒载体所携带的外源基因是EGFP绿色荧光蛋白，实验的最终目的是将EGFP基因插入表达载体pET-28a中，组成重组子，并导入到大肠杆菌细胞中并诱导其表达，培养出绿色的大肠杆菌菌落。
为此，我们要利用碱变性法将大肠杆菌中的质粒DNA提取出来，并通过Bam HI和NotⅠ两种酶的双酶切作用，从而获得目的外源基因片段EGFP和表达载体pET-28a质粒的DNA，然后通过连接酶连接后形成重组子，并通过氯化钙法导入大肠杆菌感受态细胞中，让其在含有Amp和IPTG的LB琼脂平板上生长繁殖，最后通过观察大肠杆菌能否在含有Amp和IPTG的LB平板上长出绿色的菌落，来判断EGFP基因工程菌的构建效果二、主要路线：1、质粒DNA的提取2、琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA3、酶切连接重组质粒4、重组质粒的扩增5、菌落PCR法鉴定阳性克隆6、目的荧光蛋白基因的表达1、质粒DNA的提取实验原理：1）质粒是一种染色体外的遗传因子，大小在1kb~200kb之间，是具有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。
绿色荧光蛋白分子标记的研究现状王枝平赵天垚马胡坚2012311535摘要近年来, 来源于发光性生物的荧光蛋白进一步丰富了微生物学的研究手段。
其中，来源于水母的绿色荧光蛋白( green fluorescent protein, GFP) 分子标记是现有遗传标记中最简单方便的一种方法,对于目前在各个研究领域有很好的应用价值。
目前，GFP在微生物降解污染物、环境生态学和环境检测生物等领域取得了很好的应用效果。
关键词绿色荧光蛋白分子标记应用价值序言近年来，荧光蛋白基因标记技术是迅速发展的一种新型细胞示踪技术。
其中，绿色荧光蛋白（green fluorescence protein，GFP）是应用最广泛的标记基因，在GFP基因标记后，在特定波长激发下，细胞可以强烈而持久地发出绿色荧光，同时保持良好活性，体内单个荧光细胞亦可用多种方法敏感地检测出来。
GFP是一种良好的标记物, 表达对寄主细胞无毒性作用, 可连续培养。
表达后, 能自发产生荧光蛋白, 可借助荧光体视镜和荧光显微镜进行活体实时定位观察。
目前, GFP 已被广泛应用到真菌的研究中, 并也取得了前所未有的成果【1-2】。
传统的荧光标记是通过纯化蛋白质再共价结合到荧光染料上, 但是化学计量和染料附着的部位难于控制, 因此尚需再次纯化。
正是由于绿色荧光蛋白所特有的生物化学性质, 且该基因在异源细胞内的表达产物亦能产生强烈的绿色荧光, 使其在生命科学中的应用具有美好的前景。
本文就其研究进展进行简要综述。
一：绿色荧光蛋白的基本结构与性质绿色荧光蛋白（GFP）是一类存在于水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白，绿色荧光蛋白(GFP)最早是由Shimomure [3]等在1962年时由多管水母中提取而来.后来Prasher 等人在 1992 测得，为 238 个氨基酸残基组成，分子量约27kDa。
其折叠结构为一（高×直径）的β筒状结构，筒状结构两端由一些较短的α螺旋盖住，生色团位于筒状结构中央，生色团完全被包覆，处于β筒状结构内部的氢键网络中，三维结构的形成与生色团的固定以及GFP的荧光有非常紧密的关系:一是保护了生色团免遭分子氧的淬灭；二是防止生色团形成过程中处于激发态的中间体的构象翻转[4]。
二 GFP的生物发光原理早在六十年代初期, Shimomura 等[3]首先从多管水母属(Aequorea victor ia) 中分离出一种称为 Aequorea 的蛋白, 该蛋白在结合钙离子后可发射蓝光, 当时称为光蛋白(Photoprotein)。
它是分子量为 20kD 的单一多肽链, 在其发光前, 1Mol 的 Aequoria 结合 3Mol的钙离子及 1Mol 非共价键结合的腔肠动物荧光素。
尽管光蛋白体系本身发射蓝光, 然而水母整体发光及其提取的颗粒都是呈绿色, 推测其粗提液中一定还有一种蛋白即绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)。
Morise等[4]对 GFP 进行了分离和纯化, 他们的实验结果表明, GFP 的荧光发射峰在 509nm, 最大激发波长为 395nm, 并在 475nm 处有一肩峰。
当将 Ca 2+加入到含低浓度 GFP 的 Aequorin 溶液中时, 光谱接近于Aequorin 发射的蓝光( K max472nm); 而将 Aequorin 和GFP 按大自然比例混合时, 加入Ca2+, 则光谱接近于活体的发射光(K max 509nm)。
推测在活体内, GFP 通过荧光素酶或钙活化光蛋白的能量转换过程, 吸收蓝光而后发出强烈的绿色荧光[5]。
总的说来，Shimomura在发现GFP中作出了重要的贡献，如对其纯化和物理化学表征等方面,以及在不同条件下的激发光谱和发射光谱的测定等.他们说明了GFP可以作为一种能量受体以及Aequorin作为能量给体,而在二者间发生了Forster的能量转移,并解释了由GFP发射的是绿光而不是蓝光.他们还正确的指认了与GFP多肽链体的发色团的不同功能部分.而如果没有这些Shimomura开创性的经典工作,有关GFP的出现和广泛应用将推迟几十年,甚至至今它仍作为一种秘密保留在太平洋中[111]。
三: 绿色荧光蛋白分子标记技术由于绿色荧光蛋白分子受到蓝光照射时会吸收蓝光的部分能量，然后发射出绿色的荧光。
利用这一性质，可以用绿色荧光蛋白来标记几乎任何生物分子或细胞，作为一种新型的报告基因。
利用绿色荧光蛋白独特的发光机制，可将GFP作为蛋白质标签（protein tagging），即利用DNA重GFP标记的微管组技术，将目的基因与GFP基因构成融合基因，转染合适的细胞进行表达，然后借助荧光显微镜便可对标记的蛋白质进行细胞内活体观察。
而且GFP 的荧光产生不需要任何水母中特别组分的参与，蛋白质序列本身已经包含了GFP 发光所需的信息[5，6]。
Tsien[7]等人表明生色团的形成不需要任何酶或辅助因子的参与，而只需氧分子的存在。
GFP 在DNA 内至少都有 3 个启动子。
将其与目的基因结合后，对宿主细胞的功能结构基本无影响及毒副作用。
当其在细胞内得到表达后，在蓝光的照射下，可以发出荧光，并借助荧光显微镜或者激光共聚焦显微镜即可对活细胞进行实时定位观察，如细胞分裂、染色体复制和分裂，发育和信号转导等。
1994 年，Chalfie 等人[5]首次在原核的大肠杆菌中表达了具有荧光性的 GFP，Inouye 和 Tsuji[6]则在秀丽隐杆线虫中表达了具有荧光性的 GFP。
四：GFP 基因的改进绿色荧光蛋白作为分子探针有很多优越性，但还是有局限性，如绿色荧光蛋白质的折叠会被温度影响，激发峰强度比较小，可以会不易被监测到，科学家通过野生型 avGFP 的随机突变和定点突变得到了让荧光更加稳定及明亮、温度敏感性及溶解性得到明显改善的突变体，甚至还可以得到别的颜色的荧光蛋白，扩大其的应用范围。
突变体的获得主要有以下几种[8]：1.去除掉基因中的隐蔽的内含子；2.改变某些碱基的组成； 3.将绿色荧光蛋白的生色团氨基酸进行替换；4 .插入植物性的内含子； 5 .替换为较强的启动子。
常见的 GFP 突变体有[8]：（1）增强型 ,GFP（2）人工 GFP，（3）蓝色荧光蛋白,（4）红移荧光蛋白。
总的来说，绿色荧光蛋白标记法对现在起着很大的作用，但对于提取液和提取的物质是绿色的样品可能会出现一定的影响。
此时，我们还可以用其他颜色的标记法来验证。
在进行标记的时候，我们还应该考虑到是否还有其他生色团在起作用，在实验之前我们要尽量避免。
五：绿色荧光蛋白分子标记技术应用绿色荧光蛋白作为最有效的活细胞标记物质，目前已经广泛应用于基因表达标记及调控、蛋白质定位、胚胎发育、分子生物学、生物传感器、生物探针和生物成像等领域。
绿色荧光蛋白(GFP)可直接进行活体观察, 它的这个优点可被用于监测转基因植物中选择标记基因的消除。
贾洪革等[9]借助 GFP荧光的消失, 快速选出 nptII 被消除的二次转化体，成功的利用绿色荧光蛋白监测转基因植物中选择标记基因的消除。
高苒[10]等利用绿色荧光小鼠和红色荧光 RFP标记肿瘤细胞建立荧光标记的小鼠肿瘤模型,采用活体荧光成像仪和荧光显微镜可在整体和细胞水平直接观察肿瘤的生长以及肿瘤与宿主的相互。
六：结束语绿色荧光蛋白分子标记技术已经广泛用于各个领域,宏观领域上,可研究病原菌的防效,微观领域上,可研究蛋白质功能、细胞亚结构、病原菌与寄主的关系、基因表达等。
绿色荧光蛋白不仅运用在微生物、植物等范围，还运用在人类身体里有些器官的研究。
绿色荧光蛋白分子标记法对科研者研究各方面都起着不可替代的作用。
同时，我们可以看到:他们所获得的有着其深厚的科学背景,正是由于有大量科学工作者对这一重要科学现象持续不断的兴趣和从各个方面所做的不懈努力,从而积累起广泛而深厚的基础,方能在今天,使我们对这一问题能有较深入了解,以及作为其中的杰出代表人物能获此殊荣.这正如牛顿所说的:“我之所以看得比别人更远些,是因为我是站在巨人的肩上”.因此看来,要真正认识宇宙的奥秘,使国人在世界科学研究中有更大的贡献,广泛科学水平的提高是不容忽视的。
[1] 徐莹, 刘太国, 何月秋, 等. 绿色荧光蛋白及其在丝状真菌研究中的应用[ J] . 植物保护, 2008, 34( 6) : 1 -6.[2] 徐进, 莫明和, 张克勤. 绿色荧光蛋白GFP 在真菌研究中的应用[ J] . 生物技术, 2004, 14( 6) : 74 -77.[3] Shimomura O , Johson FH , Saiga Y et al . J Cell .Comp. Physiol, 1962; 59: 223.[4] 岳莉莉,齐义鹏武汉大学病毒学研究所, 绿色荧光蛋白——现代细胞生物学与分子生物学研究领域的新标记物,《生物工程进展》1997,Vol. 17, No. 4.[3]Shimomura O. Structure of the chromophone of Aequorea green fluorescent protein[J] FEBS Letters,1979,104:220-222[4]王建国。
绿色荧光蛋白生色团的荧光增强及其在细胞成像中的应用。
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