第23卷第2期周口师范学院学报2006年3月V o.l23No.2Journa l o f Zhoukou No r m alUn iversity M ar.2006分子标记的发展及应用马克世,胡炳义(周口师范学院生命科学系,河南周口466000)摘要:随着分子生物学的迅速发展,DNA分子标记越来越受到重视.本文介绍了分子标记的发展,论述了DNA分子标记在基因组作图、基因克隆、物种亲缘关系分析及疾病诊断等方面的应用.关键词:DNA;多态性;分子标记中图分类号:Q523文献标识码: A 文章编号:16719476(2006)020081-04DNA分子标记是以生物大分子的多态性为基础的遗传标记,是DNA水平遗传变异的直接反映,克服了传统的形态标记、细胞学标记和生化标记易受外界因素、生物个体发育阶段及器官组织差异的影响,因而具有广泛的应用前景.随着分子生物学技术的发展,DNA分子标记的研究愈加活跃,相继有数10种不同的分子标记技术问世.1 分子标记的发展1.1 第一代分子标记限制性片段长度多态性(restr i ction fragm ent leng t h po ly m orphis m s,RFLP)是最早应用的第一代分子标记技术[1],是检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小的方法,反映了DNA分子上不同酶切位点的分布情况.因此, DNA序列上的微小变化,甚至1个核苷酸的变化,也能引起限制性内切酶切点的丢失或产生,导致酶切片段长度的变化. R FLP标记的等位基因具有共显性的特点,结果稳定可靠,重复性好,特别适用于构建遗传连锁图.但是,在进行RFLP分析时,需要对该位点的DNA片段做探针,通常用放射性同位素及核酸杂交技术,这样既不安全又不易自动化.另外,RFLP对DNA多态性检出的灵敏度也不高,RFLP连锁图上还有很多大的空间区(G aps).为了克服RFLP技术上的缺点,W illia m s等人于1990年建立了随机扩增多态性DNA(R andom Amp lified Po ly m orphic DNA s,RAPD)技术[2],由于其独特的检测DNA多态性的方式使得RA PD技术很快渗透于基因研究的各个领域.RA PD是建立在PCR基础之上的,用一个随机引物(8~10个碱基)非定点地扩增DNA片段,然后用凝胶电泳分离扩增片段来进行DNA多态性研究.对任一特定引物而言,它在基因组DNA序列上有其特定结合位点,一旦基因组在这些区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变,就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化,从而导致扩增产物的数量和大小发生改变,表现出多态性.与RFLP相比,RA PD方便易行,DNA用量少,设备要求简单,不需DNA探针,设计引物也不需要预先克隆标记或进行序列分析,不依赖于种属特异性和基因组的结构;合成一套引物可以用于不同生物基因组分析,用一个引物就可扩增出许多片段,并且不需要同位素,安全性好.但RA PD技术中影响因素很多,实验的稳定性和重复性差[3].扩增片段长度多态性(Amp lifi ed F ragment L ength Po ly m orphis m s,A FLP)是1992年由荷兰K eygene公司科学家Zabeau和V os发明的一种DNA分子标记新技术[4].其基本原理是基因组DNA经限制性内切酶双酶切后,形成分子量大小不等的随机限制性片段,将特定的接头(adap ter)连接在这些DNA片段的两端,形成一个带接头的特异片段,通过接头序列和PCR引物3 末端的识别,特异性片段经变性、退火和延伸周期性循环而扩增,最终通过聚丙烯酰胺电泳分子筛作用,将这些特异的限制性片段分离开来.AFLP融合了RFLP和RAPD两种技术的优点,既具有RFLP的可靠性,又具有RA PD的灵敏性.它的出现是分子标记技术又一重大突破,被认为是目前一种较为理想、有效的分子标记.此外,在RA PD和RFLP技术基础上建立了SCAR(Sequence character i zed a m plifi ed reg i ons,序列特异性扩增区域), CPA S(C l eaved amp lifiedpo l ymo rph ic sequence,酶切扩增多态序列)和DAF(DNA a mp lified fi ngerpr i nts,DNA扩增指纹)等标记技术[3,5].这些技术的出现,进一步丰富和完善了第一代分子标记,增加了DNA多态性的研究手段.收稿日期:20051228;修回日期:20060216作者简介:马克世(1974),男,河南项城人,硕士,讲师,研究方向:动物生物化学.E m a i:l m adg2000@.82 周口师范学院学报2006年3月1.2 第二代分子标记第二代分子标记利用存在于真核生物基因组中的大量重复序列,如重复单位长度在15~65个核苷酸左右的小卫星DNA(m i nisa tellite DNA),重复单位长度在2~6个核苷酸左右的微卫星DNA(m icrosa tellite DNA),后者又称为简短重复序列(sho rt tande m repeat po l ymo rph is m缩写为STR,STR P,或者si m ple sequence l eng th po ly m orphis m缩写为SSLP)[1].小卫星和微卫星DNA分布于整个基因组的不同位点.由于重复单位的大小和序列不同以及拷贝数不同,从而构成了长度多态性.微卫星多态性有助于遗传图谱的建立,为比较基因组分析奠定了基础[6].微卫星特点[7]:(1)保守性.微卫星标记在哺乳动物种间,特别是关系亲缘较近的物种间具有一定程度的保守性.(2)共显性遗传.微卫星标记的等位基因呈孟德尔共显性遗传,可以区别纯合显性和杂合显性个体.(3)多态信息量大.微卫星DNA在基因组中分布随机,几乎遍布整个基因组,可获得比RFLP更多的多态性.(4)检测容易,省时,重复性较好.在基因组多态性分析中,可采用VNTR(V ar i ble number o f tan de m repea ts,数目可变的串联重复多态性)标记技术区别这些小卫星或微卫星DNA.VNTR基本原理与RFLP大致相同,只是所用的探针核苷酸序列必须是小卫星或微卫星序列,经分子杂交和放射自显影后,即可获得反映个体特异性的DNA指纹图谱.VNTR同RFLP标记一样,实验操作程序繁杂,检测时间长,成本较高.M oo re等于1991年结合PCR技术创立了SSR(S i m p le Sequence R epeat,简单重复序列).SSR即微卫星DNA,是一类由几个(多为1~5个)碱基组成的基序(mo tif)串联重复而成的DNA序列,其长度一般较短,广泛分布于基因组的不同位置,如(CA)n,(A T)n,(GGC)n等重复.不同遗传材料重复次数的可变性,导致了SSR长度的高度变异性,这一变异性正是SSR 标记产生的基础.SSR标记的基本原理:根据微卫星重复序列两端的特定短序列设计引物,通过PCR反应扩增微卫星片段.由于重复的长度及数目变化极大,所以这是检测多态性的一种有效方法.在SSR技术中,采用PCR反应必须知道扩增DNA片段两侧序列,在大多数情况下,某些序列本身或其旁侧序列并不清楚,这就限制了SSR技术的应用.1994年,Z i e t k ie w i cz等对SS R技术进行了发展,建立了加锚微卫星寡核苷酸(A ncho red m i crosatellite o ligonucleoti des)技术[5,8].他们用加锚定的微卫星寡核苷酸作引物,即在SS R的5 端或3 端加上2~4个随机选择的核苷酸,这可引起特定位点退火.这样就能导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间的基因组片段进行PCR扩增.这类标记又被称为简单重复序列间扩增ISSR(i nter s i m p l e sequence repeat),锚定简单重复序列扩增A SSR(anchored si m p l e sequence repeats).在所用的两端引物中,一个可以是锚定引物,另一个是随机引物.1.3 第三代分子标记单核苷酸多态性(si ng l e nuc leo ti de po l ymo rph is m,SNP)标记被称为第三代DNA分子标记.这种分子标记是分散于基因组中的单个碱基的差异.这种差异包括单个碱基的缺失和插入,但更常见的是单个核苷酸的替换[9,10].SNP的分布密集,在人类基因组中被认为有300万个以上的SNP遗传标记,这可能达到了人类基因组多态位点数目的极限,因此被认为是应用前景较好的遗传标记物.其优点是:(1)SNP在种群中是二等位基因性的,在任何种群中其等位基因频率都可估计出来;(2)位点丰富,S N P几乎遍布于整个基因组;(3)部分位于基因内部的S N P可能会直接影响蛋白质的结构或基因表达水平,因此它们本身可能就是疾病遗传机制的候选改变位点;(4)遗传稳定性高;(5)易于进行自动化分析[11].目前,已有2000多个标记定位于人类染色体上.S N P与第一代的RFLP及第二代的STR标记的不同之处有两个方面:一是它不再以DNA片段的长度变化作为检测手段,而直接以序列变异作为标记;二是S N P标记分析完全摒弃了经典的凝胶电泳,代之以最新的DNA芯片[12]技术.2 分子标记的应用领域2.1 基因组作图和基因定位研究长期以来,各种生物的遗传图谱几乎都是根据诸如形态、生理和生化等常规标记来构建的,所建成的遗传图谱仅限少数种类的生物,而且图谱分辨率大多很低,图距大,饱和度低,因而应用价值有限.DNA分子标记用于遗传图谱构建是遗传学领域的重大进展之一.1987年,D onis K e ller等发表了第一张人类的RFLP s连锁图,其饱和度远远超过了经典的图谱.近来,L i L i等[13]运用A FLP技术构建太平洋牡蛎(Crasso strea gigas)的一个雄性和一个雌性遗传图谱,雄性图包括96个标记,定位在10个连锁群中,覆盖1258c m;而雌性图谱包括119个标记,分布在11个连锁图中,覆盖993c m.在遗传图谱中大部分的标记很少是对于纯合体的,且彼此间有着紧密的联系,表明在太平洋牡蛎中存在着隐性有害的基因.目前,几乎所有重要农作物,如拟南芥、番茄、玉米、水稻、甜菜、小麦、大豆、马铃薯、棉花、油菜等的RFL P图谱均已构成[14,15].随着新的DNA标记技术的发展,生物遗传图谱名单上的新成员将不断增加,图谱上标记的密度也将越来越高.建立起完整的高密度的分子图谱,就可以定位感兴趣的基因.迄今在玉米、水稻、大豆、小麦和棉花等各种经济作物上已定位了许多农艺性状和经济性状的基因,包括农作物的抗病性、抗虫性、抗逆性、早熟性等,为开展这些基因的分子育种奠定了基础[16].2.2 基于图谱克隆基因图位克隆(M ap based c l on ing)是近几年随着分子标记遗传图谱的相继建立和基因分子定位而发展起来的一种新的基因克隆技术[1,14].利用分子标记辅助的图位克隆无需事先知道基因的DNA 序列,也不必了解基因的表达产物,就可以直接克隆基因.图位克隆技术首先在拟南芥中取得成功,后来在番茄、大麦、小麦、甜菜、水稻的研究中也利用了这一方法.图位克隆是最为通用的基因识别途径,至少在理论上适用于一切基因.基因组研究提供的高密度遗传图谱、大尺寸物理图谱、大片段基因组文库和基因组全序列,已为图位克隆的广泛应用铺平了道路.2.3 物种亲缘关系和系统分类中的应用分子标记广泛存在于基因组DNA 的各个区域,通过对随机分布于整个基因组的分子标记的多态性进行比较,就能够全面评估研究对象的多样性,并揭示其遗传本质.利用遗传多样性的结果可以对物种进行聚类分析,进而了解其系统发育与亲缘关系.1997年,G uiford 等仅用了3个SS R 标记区分出21个苹果品种.2002年,Ivand ic 等用已知图谱位置的33个SSR 对来自以色列、土耳其和伊朗的39份野生型大麦基因型遗传多样分析表明,大多数野生型大麦能按其起源的国家归类[17].Y ang 利用RAPD 技术对23个不同品种的芹菜进行研究,根据其多态性,划分出不同类型,绘出了其进化关系,与以前用蛋白质或用同工酶标记分类的结果一致[18].李太武等[19]用20条能产生清晰可重复扩增产物的随机引物,对皱纹盘鲍、杂色鲍进行RA PD 分析,计算出各群体扩增位点的多态性比例、群体遗传杂合度和群体间的遗传距离,表明皱纹盘鲍与杂色鲍的亲缘关系较远,K linbu ng a 等[20]用R FL P 和RA PD 技术,对泰国的3种鲍H aliatis asinina ,H.ov ina,H.var ia 的18S ,16SrDNA 进行研究,通过小样本图谱分析表明H.as i n ina 和H.ovina 在遗传上比H.varia 近,H.varia 与H.ovina 有明显的遗传上的差异.分子标记的发展为研究物种亲缘关系和系统分类提供了有力的手段.2.4 用于疾病诊断和遗传病连锁分析1980年,Boste i n 等成功的将RFLP 技术用于镰刀型贫血症的诊断分析,开创了基因诊断的先河.RFLP 是以孟德尔方式遗传,因此可以作为染色体上致病基因座位的遗传标志.目前,许多与RFLP 相连锁的致病基因得以定位[21].小卫星和微卫星DNA 因其高度多态性而被广泛用于疾病诊断和遗传病的连锁分析.刘湘帆等采用多个微卫星位点进行血友病B 基因诊断分析,发现6个S TR 位点与血友病B 基因有关[22].近几年研究发现,核苷酸重复长度变异可导致许多疾病.已经证实,Hunti ngon 舞蹈症、脆性X 染色体综合症,肌强直性营养不良等与之有关[23,24].第三代分子标记SNP 被认为是一种稳定遗传的早期突变,因此将S N P 用于单基因与多基因病的连锁分析,显示出广阔的应用前景[9,25].M arti n 等研究表明,A poE 基因附近7个SNP 位点与老年性痴呆症(A lzhei m e r d i sease)有关[26].将S N P 标记技术用于与心血管疾病、神经精神病及肿瘤相关基因的分析均有较多报道[27,28].随着高通量检测SNP 技术方法的出现,作为数量最多且易于批量检测的多态标记,SNP 在连锁分析与基因定位,包括复杂疾病的基因定位、关联分析、个体和群体对环境致病因子与药物的易感性研究中将发挥愈来愈重要的作用.3 分子标记技术的展望目前,分子遗传标记技术已飞速发展,并被广泛应用于动植物的遗传研究中.分子标记中的S N P 已在玉米、大豆、鸡、猪等动植物育种和生产中有许多应用研究,主要集中在基因定位、辅助育种、疾病治疗等方面的应用研究工作,取得了一些应用成果[29~31].DNA 分子标记技术的开发是近年来分子生物学领域研究的热点.随着分子生物学理论与技术的迅猛发展,必将研发出分析速度更快、成本更低、信息量更大的分子标记技术.而分子标记技术与DNA 提取程序化、电泳胶片分析自动化、信息(数据)处理计算机化的结合,必将加速遗传图谱的构建、基因定位、基因克隆、物种亲缘关系鉴别及与人类相关的致病基因的诊断和分析.参考文献:[1]朱玉贤,李毅.现代分子生物学[M ].第二版.北京:高等教育出版社,2002:371-376.[2]W illia m J C K,Kubeli k A R,L i vak K J .DNA po l ymo rph is m a m plifi ed by arb itrary pri m ers are use f u l genetic m arkers[J].N ucle i c A c i ds R es ,1990,18:6531-6537.[3]王志林,赵树进,吴新荣.分子标记技术及其进展[J].生命的化学,2001,21(4):39-42.[4]V e lappam N,Sondgrass J L,H akov irta J R.R apid i den tificati on o f pathogenic bacter i a by si ng l e enzy m e a m plified frag m entleng t h po ly m orphis m ana l ys i s[J].D iagnostic M i c robiology and i nfecti ons D isease ,2001,39:77-83.[5]黎裕,贾继增,王天宇.分子标记的种类及其发展[J].生物技术通报,1999,15(4):19-22.[6]Serap i on J ,K ucudtasH,F eng J ,e t a.l B i o i nfo r ma ti c m i n i ng oft ype I m i ncro sate llite fro m expressed sequence tage o f channe l catfis h(lcta l urns puncta t us)[J].A n i n G enet ,2003,34(6):445.[7]张丽娟,张保军,耿社民.微卫星标记与动物遗传育种[J].黄牛杂志,2003,29(2):49.83第23卷第2期马克世,等:分子标记的发展及应用84 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