分子标记技术的进展及其应用

其它需要考虑的因素诸如一次可检测的位点 数、技术复杂程度与易用性等的对分子标记的影响
是容易理解的，在此不再赘述。 由于现有的分子标记没有一种能够取得全面
的、理想的效果，因此，针对需要解决的问题选择合 适的分子标记技术意义十分重大，对研究结果的产 生、分析和应用有着决定性的影响。以下就各种常 用分子标记技术的原理、技术本身的优缺点与应用 范围作一简要介绍，以期为相关领域的工作开展提 供参考。
作为酶切组合）； （2 ）限切片段末端连接到双链接头； （3 ）用与接头、限切位点序列互补的引物对连接产物
进行预扩增； （4 ）预扩增产物再次用选择性引物扩增 并加以标记，最终形成数量非常丰富的 DNA 扩增 片段库（一对引物组合通常能够得到50 !100 个扩 增产物）。
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AFLP 集 RFLP 与 RAPD 两种分子标记技术的 优势于一体。由于使用了具有特异识别位点的限制
（收稿日期：2000- 04- 01 ）
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吴谡琦等：分子标记技术的进展及其应用
验室无力而且也不可能独自承担的大量的分子标记 用于研究，良好的数据连续性／通用性是保证分子标 记有效应用的前提。
变异检测范围与分辨力：一个好的分子标记能 够检测的变异数目应当是无限制的，也就是同时拥 有良好的分辨力，这样才能客观地反映生物实际的 变异水平，不至于把目的 DNA 掩盖起来。
高技术通讯 2001. 4
分子标记技术的进展及其应用!
吴谡琦" 张进兴 洪旭光 孙修勤#
（国家海洋局第一海洋研究所 青岛 266061 ）
提 要 综述了分子标记产生与发展的过程，综合比较、分析了目前常用的 RAPD、DAF 、 SSCP 、AFLP 、VNTR 、RFLP 、同工酶等分子标记技术的原理、特点和适用范围，简要介绍 了分子标记技术的研究与开发现状以及未来的发展趋势。
性内切酶消化模板 DNA，以及在3 ’末端加入了选 择性核苷酸的半特异性引物，尽管同样是一种核基
因组多位点分析的分子标记技术，它避免了 RAPD 分子标记重复性差、假阳性反应过高等不利因素的
影响，同时，它又无需任何目的基因组 DNA 的背景 资料即可完成模板 DNA 多态的检测，摆脱了 RFLP 繁琐的转膜、克隆、探针制备、分子杂交等一系列繁
单位点标记 理想的分子标记应当既具有单位 点分析的精确性又具有多位点分析的效率和便利， 单位点与多位点分析技术到目前为止还是难以协调 一致的。多位点分析（RAPD、DAF 等）在技术上相 当简单而高效，但存在显著的缺陷和局限性。如显 性遗传方式无法准确估计等位基因频率、杂和度等， 在分子进化、种群遗传等结果准确性要求比较严格 的应用受到严重制约。而单位点标记（SSR 、RFLP 等）虽然分析结果可靠但工作效率却较低，不可能在 大规模的遗传分析中广泛应用。
同种种群中才有较高的可信度。
1. 2 RFLP（限制性酶切片段长度多态性） RFLP 是较早产生的基于 DNA 多态的分子标
记技术。它所检测的 DNA 分子多态来源于：（1 ）突 变形成的、决定限切片段数量的限制性内切酶酶切
位点位点的存在与否，（2 ）两个限切位点间因 DNA 插入、重排或缺失造成的长度变异。经典的 RFLP 标记是模板 DNA 经过限制性内切酶消化、电泳分 离、Sout her n 转移后，再用 DNA 探针进行杂交后得 到的，整个的处理过程比较冗长，步骤繁琐，有一定
表1 常用的分子标记及其主要特征
标记类型
PCR 分析
单位点
线粒体、叶绿体标记
DNA 序列
是是
RFLP
否是
核基因组多位点标记
SSR／VNTR
否否
RAPD
是否
AFLP
是否
DAF
是否
核基因组单位点标记
同工酶（等位酶）
否是
SSR
VNTR DGGE／TGGE
SSCP
SNP
是是 极少 是
是是 是是 是是
个扩增产物在通常情况下可被视为基因
组上的一个位点。就某一特定引物而言，它与基因
组结合位点的序列互补，决定了扩增产物也是具有
一定特异性的，如果不同个体在结合位点上的序列 因突变存在差异，或者两个结合位点间由于 DNA 序列的插入、缺失造成距离变化，就会形成扩增产物 的出现／消失或长度变异等多态现象，从而成为指示 基因组 DNA 多态的分子标记。由于一个随机引物 在基因组 DNA 上与其互补序列相结合的位点是有 限的，不可能反映出总体的变异状况，通过使用大量 不同的随机引物，就可得到许多的扩增产物（位点）， 使检测范围涵盖整个基因组，从而形成生物的特征 性指纹图谱。
1. 4 SSR／VNTR（简单序列重复或微卫星／数量可 变串联重复或小卫星）
SSR 和 VNTR 是两类在基因组中大量存在的 基因外的重复序列，其中 SSR 指由2 !6 个碱基组 成的核心序列多次串联重复而成。VNTR 一般指 核心序列较长，由十几到几十个碱基组成的串联重
的或根本不是目标生物的，有时假阳性的比例甚至 可以达到60 %［12 ］。另一个根本性的限制因素是显 性表达机制，只能用电泳条带的有无而不是等位基
因识别多态，无法区分杂合子，对于结果准确性要求
比较高的研究，还需要通过Sout her n 转移来加以验 证，因此在应用于亲缘关系很近（种属以下）的物种／
虽然 RAPD 等分子标记技术有其独特的优势， 但在实际应用中也必须注意到他们固有的缺陷。短
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的引物序列只能通过较低的退火温度寻求较高的结
合几率，这样做虽然提高了扩增产物的数量，使其一
次检测的“位点”可以达到几十甚至数百个，但这种
方式是以降低PCR 反应的忠实性为代价的，它可使 误配的几率大大增加，检测到的变异实际是非遗传
几乎所 有 基 于 PCR 扩 增 对 任 意 未 知 基 因 组 DNA 模板序列的多态性进行检测的分子标记技术 都是建立在合成的随机寡聚核苷酸引物所产生的特
征性 指 纹 图 谱 基 础 上 的。用 较 短 的 引 物（一 般 为
10bp 左右）扩增基因组 DNA 通常都能够得到随机 分布在整个基因组上的多重扩增产物。这一现象使 三种分子标记技术得以建立：RAPD［7 ］、AP- PCR［8 ］ 以及 DAF［9 ］。它们所依据的原理是基本一致的，即 模板 DNA 在94 C 变性解链后，在较低的退火温度 下（如37 C ）引物与模板 DNA 互补形成双链结构， 如果基因组 DNA 两个位点间为可扩增的距离（约 200 !4000bp ），同时引物以3 ’末端相对的方式分别 位于两条互补链上，即可通过延伸、循环得到一个扩
共显性
是 是
否 否 否 否
是 是 是 是 是 是
家系 鉴定
准确 准确
否 否 否 否
否 否 否 否 否 是
一次可检测 的位点数
少（1 ） 少（1 ）
许多 许多 许多 许多
中等 许多 中等 少（1 ） 少（1 ） 极多
数据的连续 性／通用性
好 好
一般 一般 较好 一般
好 较好 较好
好 好 好
变异检 测范围
分子标记技术本质上都是以检测生物个体在基 因或基因 型 上 所 产 生 的 变 异 来 反 映 基 因 组 之 间 差 异。每一种分子标记都有其自身的特点和特定的应 用范围，但以一般性的意义而论，判断一种分子标记 优劣的依据应当包括以下几方面的内容（如表1 所 列）：
PCR 分析 利用 PCR 技术的忠实性、效率和 特异性可以极大地简化样品的收集与处理工作，同 时也降低了对样品数量和质量的要求，通常几十纳 克（ng ）以内的 DNA 样品就足以应付分析的需要， 这对于分子标记辅助育种、GTL 定位等研究带来了 很大的 便 利。此 外，PCR 还 可 以 锁 定 特 定 的 目 标 DNA 区域进行扩增，有利于后续工作的开展（序列 测定、功能研究等）。但是，同时也必须注意不严格 的PCR 条件的准确度（如 RAPD）。
共显性表达 分子标记最重要的属性之一。只 有共显性表达方式的分子标记才能进行各项精确的 遗传分析并满足各个领域研究发展的需要。
数据的连续性／通用性 涉及分子标记技术的 精确度和重复性。在许多研究领域，包括 GTL 定 位、系统演化、分子进化等等，都需要往往是一个实
! 973 计划（G1999012008 ）和国家海洋局青年基金资助项目。 " 男，1969 年生，博士；研究方向：分子遗传学。 # 联系人。
0 引言
遗传与变异是生物进化的基础，也是生物学研 究的核心问题。分子标记是以蛋白质、核酸分子的 突变为基础，检测生物遗传结构与其变异的一种有 力工具。在分子标记技 术 诞 生 以 前，宏 突 变（macr omutati on ）由于具有显著的表型效应，是用于观察、 研究生 物 遗 传 变 异 及 其 规 律 的 最 重 要 的 手 段。 但 是，尽管某些宏突变生物个体在实验室中比较易于 得到，自然界中却非常罕见，其原因是宏突变对于生 物个体而言绝大多数都是有害的，因而会为自然选 择所淘汰［1 ］。这极大地限制了人们对生物进化的 过程和内因的深刻认识。虽然自然界里宏突变产生 的几率是相当低的，但这绝不意味着生物群体不存 在大量的变异，实际上，最为常见的变异就是由多基 因（pol ygenes ）控制的、呈连续分布的表型变异。随 着当代生物技术水平的提高，更深层次的遗传变异 被大量地揭示，使人们对生物进化的认识产生了质 的飞跃。这 一 跨 越 就 是 依 赖 直 接 检 测 蛋 白 质 乃 至 DNA 分子水平遗传变异的分子标记技术的发展而 实现的。
技术，最初被称为 SRFA（Selecti ve Restricti on Fragment Amplificati on ，限制性片断选择扩增）［14 ］，它将 基因组 DNA 用成对的限制性内切酶双酶切后产生 的片段用接头（与酶切位点互补）连接起来，并通过
5 ’端 与 接 头 互 补 的 半 特 异 性 引 物 扩 增 得 到 大 量 DNA 片段从而形成指纹图谱的分子标记技术［6 ］。 它主要通过以下步骤来实现基因组 DNA 多态性的 检测： （1 ）两个不同的限制性内切酶消化模板 DNA （通常采用一个高频的和一个低频的限制性内切酶
重而且有一定难度的工作。因此，高分辨力、准确性
和重复性使 AFLP 目前已成为制作高密度连锁图 谱、分子标记辅助育种、遗传多样性检测、系统分类、
GTL 定 位、基 因 定 位 等 的 主 要 分 子 标 记。当 然， AFLP 也同样存在一些技术上的不足，它所得到的 主要是显性（约占多态位点数的85 % !96 % ）而非 共显性标记［4 ］，制约了在相关领域的应用。
可以看出，上述分子标记技术由于使用的是随 机引物，因此一方面免除了其他如微卫星标记引物 设计的繁琐、复杂，另一方面又不存在种属特异性， 同样的引物可应用于任何一种未知基因组中去，因 而在 DNA 分子多态的检测中得到广泛的应用，如 DNA、RNA 指纹图谱、遗传连锁图谱的构建，分子标 记辅助育种，系统发育与分子进化，种群生物学，以 及疾病检测等许多方面［9 ］。
以20 世纪50 年代同工酶的发现为开端［2 ］，伴 随着生命科学领域理论与技术所取得的重大突破， 尤其是 DNA 双螺旋结构的阐明、PCR 技术的诞生，
使分子 标 记 技 术 从 蛋 白 质、酶 向 DNA 分子水平逐步深化，至今已 衍生出 不 下 几 十 种、用 于 不 同 研 究目的的分子标记。表1 列出了 目前常见的几种分子标记和它们 各自的特点［3 -11 ］。
分辨力
技术复杂程度
低- 高 高 低- 中等 高
高
高
高
高
高
高
高
高
较复杂 复杂
复杂 简单 较简单 较简单
低- 中等 低- 中等
高
高
高
高
低- 中等 高 低- 中等 高
极高 极高
简单 复杂 复杂 较复杂 较简单 较复杂
1 分子标记技术的原理及其应用
1 1 RAPD／DAF（DNA 随机扩增多态性／扩增指纹 图谱）
的技术难度，因此在应用中尤其是需要大量分子标
记的研究中受到限制。但是，由于 RFLP 标记具有 很高的分辨力，又以共显性的方式遗传，其结果有着
很强的重复性和准确度，在高密度遗传连锁图谱、指
纹图谱的构建、群体遗传与系统演化等研究领域仍 然具有重要的应用价值［3 ］。
1. 3 AFLP（扩增片断长度多态性） AFLP 是近年来迅速发展起来的一种分子标记