TIMP-1B细胞表位的预测和鉴定

人巨细胞病毒包膜糖蛋白B的B细胞抗原表位预测彭波;谢伟岸;黄超洋;刘腊兰;吴舒婷;张风华;常海艳;刘如石;李小曼【期刊名称】《湖南师范大学自然科学学报》【年(卷),期】2013(036)005【摘要】目的:通过生物信息学方法分析人巨细胞病毒包膜糖蛋白B(gB)的三级结构并预测其线性B细胞抗原表位.方法:根据人巨细胞病毒gB蛋白的胞外域序列,利用DNAStar软件分析其二级结构和表面特性,联合在线B细胞表位预测程序BcePred,通过其理化特性来综合预测该蛋白可能的线性B细胞抗原表位;利用SWISS-MODEL服务器的同源建模方法构建gB蛋白的三级结构模型,对在生理三聚体条件下该蛋白各预测表位进行验证.结果:成功预测出人巨细胞病毒gB蛋白的多个线性B细胞抗原表位区段,其中预测出的5个表位区段不属于任何已发现的抗原区域,为后续验证其优势中和表位,研制安全、高效的表位疫苗奠定了理论基础.【总页数】5页(P65-69)【作者】彭波;谢伟岸;黄超洋;刘腊兰;吴舒婷;张风华;常海艳;刘如石;李小曼【作者单位】湖南师范大学生命科学学院,中国长沙410081;湖南师范大学生命科学学院,中国长沙410081;湖南师范大学生命科学学院,中国长沙410081;湖南师范大学生命科学学院,中国长沙410081;湖南师范大学生命科学学院,中国长沙410081;湖南师范大学生命科学学院,中国长沙410081;湖南师范大学生命科学学院,中国长沙410081;湖南师范大学生命科学学院,中国长沙410081;湖南师范大学生命科学学院,中国长沙410081【正文语种】中文【中图分类】R373【相关文献】1.造血干细胞移植术后人巨细胞病毒包膜糖蛋白gB抗原血症及gB特异性CD8+T 细胞测定 [J], 刘安兵;黄雅萍;胡建华;梁韩英;杨鎔;王慧琦;陈晓明;范骏2.人巨细胞病毒包膜糖蛋白B主要中和表位单克隆抗体的制备 [J], 何赛;郭向荣;刘如石;廖旻晶;靳晓瑞;邱义兰;李晓丹;郑姣;唐娜;罗焕;梁湘辉3.人巨细胞病毒gH和PP65蛋白的B、T细胞优势抗原表位预测 [J], 张倩文;王爽;祝颖;刘泽媛;余波;王斌4.人巨细胞病毒gH和PP65蛋白的B、T细胞优势抗原表位预测 [J], 张倩文;王爽;祝颖;刘泽媛;余波;王斌5.人巨细胞病毒融合蛋白pp150/MDBP二级结构及其抗原表位预测 [J], 郭大东;高雪芹;韩金祥因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

牛羊乳α-酪蛋白的B细胞抗原表位预测及免疫反应性分析薛海燕;韩波;李珊;操歌【摘要】牛羊乳的α-酪蛋白营养功能相似,但蛋白质亚类结构和含量不同,可能是造成其过敏性差异的原因.本文旨在利用生物信息学DNAStar Protean软件、SOPMA以及the Bepi Pred 1.0服务器对牛羊乳主要过敏蛋白αs1-酪蛋白（Casein,CN）的二级结构、亲水性、抗原指数、表面可及性和柔韧性进行预测,分析鉴定主要B细胞抗原表位.合成相应表位肽段序列,制备酪蛋白抗体,采用间接ELISA法分析验证合成多肽的免疫反应性.结果表明：牛羊乳αs1-CN的氨基酸序列同源性89%,但抗原表位存在差异,与牛乳αs1-CN相比,羊乳抗原表位数目相差不大,但两者抗原表位区域存在一定的包含重叠关系.且羊乳αs1-CN合成肽段P-1037（26-31,LSPEVP）、P-1040（140-142,EGN）和牛乳αs1-CN合成肽段P-1038（189-208,TDAPSFSDIPNPIGSENSEK）、P-1039（99-102,EDVP）都具有免疫反应性,该结果为过敏原表位的选择提供基础,为牛羊乳过敏原性比较及改性加工提供理论依据.【期刊名称】《陕西科技大学学报》【年(卷),期】2017(035)005【总页数】6页(P133-138)【关键词】牛羊乳;αs1-酪蛋白;二级结构;抗原表位【作者】薛海燕;韩波;李珊;操歌【作者单位】陕西科技大学食品与生物工程学院,陕西西安710021【正文语种】中文【中图分类】Q518.1Abstract:Bovine and goat milk α-casein were very similar in the aspect of nutrition and function,but they induced different allergen reaction in consumers because of the differences in protein subclass structure and content.The purpose of this paper was to analyze and identify the B cell epitopes by predicting the secondary structure,hydrophilicity,antigenicity index,surface accessibility and flexibility of major allergic protein αs1-casein from cow and goat milk using DNAStar Protean software,SOPMA and the BepiPred 1.0 server.Prepared the casein antibody by synthesizing the corresponding epitope peptide sequence and then used an indirect ELISA method to identify the immunoreactivity of the synthetic polypeptide.The results showed that the amino acid sequence homology of cow and goat milk αs1-CN was 89%,but the epitopes were different.The number of epitopes of goat milk was similar compared with cow milk αs1-CN,but there was a certain overlap between the two epitope regions.The peptide fragment P-1037 (26～31,LSPEVP),P-1040 (140～142,EGN) synthesized by the goat milk αs1-CN and the peptide P-1038 (189～208,TDAPSFSDIPNPIGSENSEK),P-1039(99～102,EDVP) synthesized by the cow milk αs1-CN had the immunoreactivity,which provided the basis for the selection of the allergen epitope,and provided the theoretical basis for the comparison of sensitization and modification of cow and goat milk. Key words:cow and goat milk; αs1-CN; the secondary structure; epitopes牛乳中富含多种蛋白质、脂肪、碳水化合物、维生素和矿物质，是人体优质的营养来源，但同时也是联合国粮食及农业组织FAO (1995)报告的八大类过敏食物之一[1].牛乳过敏是指机体对牛乳蛋白的高反应性(hypersensitivity)，是婴幼儿最常见的食物过敏之一，在欧美发达国家，婴儿牛乳过敏症状发生率达0.3%～7.5%[2].目前普遍认为，牛乳蛋白中的酪蛋白(Casein，CN)、β-乳球蛋白(β-lactoglobulin，β-LG)和α-乳白蛋白(α-lactalbumin，α-LA)是最主要的过敏原，其中酪蛋白主要由αs1、αS2、β和κ酪蛋白组成，约80%是由αs1-酪蛋白(αs1-CN)组成，对酪蛋白过敏的患者一般都对αs1-CN过敏[3,4].羊乳总热量、干物质、蛋白质、脂肪以及矿物质含量均高于牛乳，具有较高的营养价值，且易被人体消化吸收利用，在国际营养学界被誉为“乳中之王”[5].以羊乳替代牛乳作为婴幼儿主要的营养来源被广泛认可.羊乳和牛乳中酪蛋白所占比例相似，但羊乳中以β和κ-酪蛋白为主，αs1-CN含量(18.9%)远低于牛乳中的含量 (30.8%)[6].羊乳中αs1-CN含量较低，理论上具有较低的致敏性，Hodgkinson等[7]也证实了低αs1-CN含量的山羊乳可以减少抗原摄入量，降低致敏性.然而Muraro等[8]认为山羊乳与牛乳具有相同的致敏性.所以，就目前山羊乳的低致敏性及其在预防婴幼儿牛乳过敏中的应用仍存在争议.食物蛋白质引起机体致敏的主要原因是消化道内未水解的蛋白质抗原表位被免疫系统识别.抗原表位预测中，B细胞线性表位预测是目前研究的重点，它是研究抗原表位与已知氨基酸序列在蛋白质上的某些结构特征之间的关系，从氨基酸序列的二级结构，亲水性，表面可及性，柔韧性等方面，进行序列的分析预测[6,9].常用的分析软件有ABCpred[10]，BepiPred[11]，SOPMA[12]，DNAStar[13]，其中BepiPred，SOPMA，DNAStar这三种软件较为常用，其基本原理是结合抗原蛋白的结构特点，统计显著性度量，理化性质等指标进行简单预测，操作简单，只需输入蛋白质氨基酸序列，即可得出结果.该研究采用BepiPred，SOPMA和DNAStar这三种预测软件对牛羊乳过敏原αs1-CN B细胞线性抗原表位进行预测分析，并通过实验验证合成的抗原表位是否具有免疫反应性，为进一步对比验证牛乳和羊乳之间的抗原关系提供一定的理论基础.1.1 材料与仪器(1)主要材料：兔抗牛α-CN多克隆抗体(α-CN-IgG，效价1∶204800)，本室制备；HRP-羊抗兔Ig G抗体，北京博奥森生物技术有限公司；碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、明胶等常规试剂均为进口或国产分析纯.(2)主要仪器：MULTISKANmk3型酶标仪，赛默飞世尔上海仪器有限公司；隔水式电热恒温培养箱，上海岛析实业有限公司.1.2 试验方法1.2.1 牛羊乳αs1-CN氨基酸序列通过NCBI数据库检索牛羊乳αs1-CN氨基酸序列，该序列在NCBI的基因登录号分别为NP_851372、P18626.1.2.2 牛羊乳αs1-CN二级结构预测利用DNAStar Protean软件(Gamier-Robson方法)和SOPMA网络服务器输入检索到的牛羊乳αs1-CN氨基酸序列分析预测两者的二级结构.1.2.3 牛羊乳αs1-CN亲水性、抗原指数、表面可及性及柔韧性预测应用DNAStar Protean软件，采用Kyte-Doolittle法、Jameson-Wolf法、Emini法和Karplus-Schulz法分别对检索到的牛羊乳αs1-CN氨基酸序列进行亲水性、抗原指数、表面可及性及柔韧性预测.1.2.4 B细胞线性抗原表位确定利用the BepiPred 1.0服务器，直接输入牛羊乳αs1-CN氨基酸序列，抗原指数高于1即为可能表位区域[14].并与牛羊乳αs1-CN二级结构预测结果和亲水性、抗原指数、表面可及性及柔韧性预测结果相结合，综合分析得到B细胞线性抗原表位.1.2.5 牛羊乳αs1-CN多肽合成及鉴定选择牛羊乳差异较大的抗原表位肽段，由杭州丹港生物科技有限公司，应用全自动多肽合成仪，采用固相合成法从肽链C端向N端依次合成.经反高效液相色谱(RP-HPLC)以及质谱对其进行纯度鉴定，纯度大于98%，符合实验室要求.1.2.6 多肽免疫反应性鉴定采用间接ELISA检测合成多肽的免疫反应性.将上述合成的多肽用包被缓冲液稀释至10 μg/mL，每孔加入100 μL，以α-CN、β-LG蛋白分别作为阳性、阴性对照，4 ℃包被过夜[15].弃去蛋白包被液，每孔加入300 μL PBST洗涤液洗涤3次，每次4 min，拍干，除去残留气泡和液体.每孔加入200 μL明胶封闭液，37 ℃温箱封闭1.5 h，洗涤，拍干.每孔加入浓度为5μg/mL的α-CN-Ig G 100 μL(实验室制备，抗牛乳α-CN多克隆抗体兔血清)，同时设置阴性血清对照，37 ℃温箱温育1.5 h，使抗原抗体充分反应，洗涤拍干.用PBS稀释液将羊抗兔HRP-Ig G以1∶4000的比例稀释作为二抗，每孔加入100 μL，37 ℃温箱温育1 h，洗涤，拍干.每孔加入50 μL TMB显色液，37 ℃温箱避光显色15 min，显色后每孔加入50 μL终止液2 mol/L H2SO4终止反应，450 nm测定吸光值.检测时以P/N值>2.1(即多克隆抗体上清的吸光值大于阴性血清值的2.1倍)判定检测结果为阳性，P/N值<2.1(即多克隆抗体上清的吸光值小于阴性血清值的2.1倍)判定检测结果为阴性[15].2.1 牛羊乳αs1-CN所对应的氨基酸序列MKLLILTCLVAVALARPKHPIKHQGLPQEV LNENLLRFFVAPFPEVFGKEKVNELSKDIGS ESTEDQAMEDIKQMEAESISSSEEIVPNSVEQ KHIQKEDVPSERYLGYLEQLLRLKKYKVPQLEIVPNSAEERLHSMKEGIHAQQKEPMIGV NQELAYFYPELFRQFYQLDAYPSGAWYYVP LGTQYTDAPSFSDIPNPIGSENSEKTTMPLW MKLLILTCLVAVALARPKHPINHRGLSPEV PNENLLRFVVAPFPEVFRKENINELSKDIGS ESTEDQAMEDAKQMKAGSSSSSEEIVPNSA EQKYIQKEDVPSERYLGYLEQLLRLKKYNV PQLEIVPKSAEEQLHSMKEGNPAHQKQPMI AVNQELAYFYPQLFRQFYQLDAYPSGAWY YLPLGTQYTDAPSFSDIPNPIGSENSGKTTMPLW对比分析牛羊乳αs1-CN氨基酸序列，将不同差异位点标出，其同源性达到89%，且牛乳αs1-CN氨基酸序列相比羊乳氨基酸差异位点大多为一些极性亲水性氨基酸.2.2 牛羊乳αs1-CN的二级结构利用SOPMA网络服务器对牛羊乳αs1-CN二级结构预测，结果如图1所示.利用DNAStar Protean软件对牛羊乳αs1-CN二级结构预测，结果如图2所示.蛋白质的二级结构是抗原表位预测的重要参数之一.β-转角和无规则卷曲由于其松散的结构，易发生扭曲、盘旋，并展示在蛋白质的表面，因此该区域常含有优势抗原表位而α-螺旋和β-折叠化学键能比较高，结构规则不易变形，较难结合抗体，一般不作为抗原表位[16-18].综合上述两者的预测结果可推出牛乳αs1-CN可能抗原表位区域为19～27，41～43，60～62，99～102，118～120，127～129，148～150，185～186，189～210；羊乳αs1-CN可能抗原表位区域为18～31，41～42，59～62，78～83，99～103，119～121，128，140～142，172～178，183～186，189～210.对比分析预测出的牛羊乳αs1-CN抗原表位区域，从二级结构预测结果显示羊乳可能抗原区域数目高于牛乳，且它们具有相同抗原区域189～210.2.3 牛羊乳αs1-CN亲水性、抗原指数、表面可及性及柔韧性预测结果利用DNAStar Protean软件对αs1-CN(bovine、capra hircus)亲水性、抗原指数、表面可及性及柔韧性进行预测，结果如图3所示.蛋白质的亲水性、抗原指数、表面可及性和柔韧性在抗原形成方面起着主要作用，当亲水性>0、抗原指数>0和表面可及性>1时，形成表位的可能性较大[19-21].综合预测结果推出牛乳αs1-CN可能抗原表位区域为17～19，22～26，50～52，63～67，70～74，77～83，85～105，117～122，129～134，145～149，185～210；羊乳αs1-CN可能抗原表位区域为17～19，27，30～31，35，48～52，55，62～67，70～76，81～84，90～105，117～119，129～134，139～149，205～219.对比分析两者抗原表位差异得出羊乳αs1-CN抗原表位区域与牛乳相比，其大多分布在αs1-CN氨基酸序列的C端，且羊乳αs1-CN表位区域于牛乳表位区域存在一定的包含重叠关系.2.4 B细胞线性抗原表位综合预测蛋白质的二级结构和氨基酸残基的亲水性、抗原指数、表面可及性和柔韧性都是影响B细胞线性抗原表位的重要因素[22].利用the BepiPred 1.0服务器对牛乳αs1-CN氨基酸序列的抗原指数进行预测得到的可能性抗原表位是21，60～68，80～81,85～86，99～102，142～152，173～179，187～208，羊乳αs1-CN可能性抗原表位是26～31，60～70，74～91，100～102， 140～146，187～208.将the BepiPred 1.0、SOPMA、和DNAStar这三种预测软件得到的抗原表位综合分析得出牛乳αs1-CN可能抗原表位为22～26，86～87，99～102，118～120，148～149，185～186，189～210，羊乳αs1-CN可能抗原表位为18～19，27，30～31，83～84，99～103，117～119，140～142，205～210.对比分析预测得到的牛羊乳αs1-CN抗原表位，较牛乳αs1-CN相比，羊乳αs1-CN同样具有较多区域的抗原表位，且二者存在一定的包含关系.2.5 牛羊乳αs1-CN合成肽的设计综合上述可能抗原表位，选择其长度不同的四条预测表位肽段采用固相合成法合成.分别来自于羊乳αs1-CN命名为：P-1037(26～31，LSPEVP)和P-1040(140～142，EGN)；来自于牛乳αs1-CN命名为：P-1038(189～208，TDAPSFSDIPNPIGSENSEK)和P-1039(99～102，EDVP).2.6 合成肽免疫反应性鉴定利用实验室制备的兔抗牛α-CN多克隆抗体作为一抗，间接ELISA法检测合成肽的免疫反应性，以P/N>2.1为判断标准，结果如图4示.由图4可知，合成的四种多肽和α-CN均与α-CN-Ig G呈阳性反应，且α-CN测出的吸光值高于合成的四种多肽；而β-LG与α-CN-IgG呈阴性反应，由此初步说明，合成多肽具有免疫反应性.其免疫原性还需进一步验证.关于牛乳主要过敏原抗原表位的预测研究报道较多.B Ruite等[23]利用重叠肽的方法发现牛乳αs1-CN的T细胞表位识别位点即43-66，73-96，91-114和127-180.Picariello G等[24]利用体外模拟胃肠消化后的牛乳蛋白水解液通过在Caco-2细胞的转运吸收研究发现β-Lg 40～60和125～135具有一定的致敏性.但目前从抗原位点出发研究羊乳过敏性的报道并不多见，Sanz C L等[25]利用豚鼠进行研究，发现豚鼠经口给予羊奶、牛奶和抗乳血清时，山羊奶的变应原性低于牛奶，其变应原性可能是由酪蛋白和抗乳血清不同蛋白质之间的特异性抗原决定簇引起.本研究对牛羊乳主要过敏原αs1-CN B细胞线性抗原表位进行预测，可为对目前山羊乳的低致敏性及其在预防婴幼儿牛乳过敏中的应用提供一定的理论和技术参考. 蛋白引起致敏的前提是它具有抗原性，而抗原表位是蛋白质具有抗原性的关键因素，是抗原与抗体特异性识别的基本单位.B细胞线性抗原表位是指抗原表面可被B细胞抗体识别的线性片段.所以，准确预测B细胞线性抗原表位，可为单克隆抗体的制备、羊乳抗原性的研究等奠定一定的基础.该研究首先采用SOPMA网络服务器，DNAStar软件对牛羊乳αs1-CN氨基酸序列进行对比分析，得出二者氨基酸序列同源性虽较高，但预测出二级结构仍存在差异，其中羊乳αs1-CN β-转角和无规则卷曲的数量较多，如上述利用SOPMA网络服务器对牛乳αs1-CN二级结构预测得到β-转角和无规则卷曲的数目为3.74%和38.32%，羊乳预测得到的数目为4.21%和44.39%，明显大于牛乳.这些差异同牛羊乳αs1-CN氨基酸序列上个别氨基酸的不同存在一定的关系.其次采用DNAStar软件对牛羊乳αs1-CN的亲水性、抗原指数、表面可及性和柔韧性预测，由于在肽段1～200位个别氨基酸的不同，预测出的抗原表位在该位存在部分差异且有一定的包含关系，而在200～214肽位间的氨基酸几乎无明显差异，使得此区段预测出的牛乳αs1-CN抗原表位羊乳αs1-CN也同样具有该表位.本研究仅采用了生物学软件对牛羊乳αs1-CN的二级结构，亲水性，抗原指数，表面可及性和柔韧性等预测并通过实验验证了所预测氨基酸序列的免疫反应性，为深入研究羊乳过敏原提供一定的理论依据.在乳过敏性差异方面，该结果还不能全面的说明羊乳是否可作为低致敏产品代替牛乳作为牛乳过敏患者的直接乳源，还有待对主要过敏原αs2-CN和β-LG等对比分析.但该结果可初步判定羊乳αs1-CN抗原表位合成多肽具有免疫反应性，后续进一步通过动物实验验证其多肽是否具有免疫原性产生抗体.该研究综合三种软件预测参数得到牛乳αs1-CN可能抗原表位为22～26，86～87，99～102，118～120，148～149，185～186，189～210，羊乳αs1-CN可能抗原表位为18～19，27，30～31，83～84，99～103，117～119，140～142，205～210.分析比较牛羊乳αs1-CN B细胞线性抗原表位差异，与牛乳αs1-CN抗原表位相比，羊乳αs1-CN同样具有相当的抗原表位区域.因此，可以初步确定羊乳中虽含有少量的αs1-CN但其仍具有一定的抗原性.通过间接ELISA检测合成多肽的免疫性，实验表明合成多肽呈阳性反应，与抗体发生反应，具有免疫反应性，其免疫原性及过敏原性有待验证.【相关文献】[1] Kattan J D,Cocco R R,Järvinen K k and soy allergy[J].Pediatric Clinics of North America,2011,58(2):407-426.[2] Yibin Wang,Sha Xu,Yanmei Hou,et al. Recent advances in digestion,absorption and allergenicity of goat′s mil k[J].Hans Journal of Food and Nutrition Science,2012,1(4):29-33.[3] Monaci L,Brohée M,Tregoat V,et al.Influence of baking time and matrix effects on the detection of milk allergens in cookie model food system by ELISA[J].FoodChemistry,2011,127(2):669-675.[4] Monaci L,Tregoat V,Hengel A J V,et k allergens,their characteristics and their detection in food:A review[J].European Food Research and Technology,2006,223(2):149-179.[5] 焦凌梅,袁唯.改善山羊乳风味的方法研究[J].中国乳业,2006,26(6):56-58.[6] Ceballos L S,Morales E R,Adarve G D L T,et position of goat and cow milk produced under similar conditions and analyzed by identical methodology[J].Journal of Food Composition and Analysis,2009,22(4):322-329.[7] Hodgkinson A J,Mcdonald N A,Kivits L J,et al.Allergic responses induced by goat milk αs1-casein in a murine model of gastrointestinal atopy[J].Journal of DairyScience,2012,95(1):83-90.[8] Muraro M A,Giampietro P G,Galli E.Soy formulas and nonbovine milk[J].Ann Allergy Asthma Immunol,2002,89(1):97-101.[9] Soria Guerra R E,Nieto Gomez R,Govea Alonso D O,et al.An overview of bioinformatics tools for epitope prediction: Implications on vaccine development[J].Journal of Biomedical Informatics,2015,53:405-414.[10] El Manzalawy Y,Dobbs D,Honavar V.Predicting linear B-cell epitopes using string kernels[J].Journal of Molecular Recognition,2008,21(4):243-255.[11] Gao J,Kurgan putational prediction of B cell epitopes from antigen sequences[J].Methods in Molecular Biology,2014,1184(5):197-215.[12] Yang X,Yu X.An introduction to epitope prediction methods and software[J].Reviews in Medical Virology,2009,19(2):77-96.[13] Burland T G.Dnastar′s lasergene sequence analysis software[J].Methods in Molecular Biology,2000,132(3):71-91.[14] 单晓红.大豆和牛奶致敏原表位预测及加工对其抗原性和结构的影响[D].无锡: 江南大学,2013.[15] 吴序栎.牛乳β-乳球蛋白的检测及茶多酚对其免疫反应性影响的研究[D].广州: 华南理工大学,2012.[16] Maeda K,Mizukoshi F,Hamano M,et al.Development of an equine herpesvirus type 4-specific enzyme-linked immunosorbent assay ssing a B-cell epitope as anantigen[J].Journal of Clinical Microbiology,2004,42(3):1 095-1 098.[17] 刘银萍,王全立,张俊仙,等.结核分枝杆菌Rv1419蛋白抗原表位的预测[J].中国防痨杂志,2015,37(1):52-55.[18] 严小玲,何颖,陶爱林,等.猫主要过敏原Fel d1的二级结构及B细胞抗原表位预测[J].国际医药卫生导报,2011,17(9):1 025-1 028.[19] 朱倩倩,吴序栎,肖杰,等.腰果过敏原Ana o 2结构及抗原表位预测[J].食品与生物技术学报,2012,31(2):35-39.[20] 何颖,刘雪婷,王珊,等.乳胶过敏原Hev b 1二级结构及抗原表位的预测[J].国际医药卫生导报,2013,19(11):1 553-1 555.[21] 胡纯秋,高金燕,罗春萍,等.花生过敏原Ara h2.02二级结构和B细胞抗原表位预测[J].食品科学,2009,30(21):13-15.[22] 马凡舒,张蕾,王洋,等.B细胞抗原表位预测方法的研究进展[J].中国畜牧兽医,2016,43(1):63-67.[23] B Ruiter,V Trégoat,M Rabet L,et al.Characterization of T cell epitopes in αs1-casein in cow′s milk allergic,atopic and non-atopic children[J].Clinical & ExperimentalAllergy,2006,36(3):303-310.[24] Picariello G,Iacomino G,Mamone G,et al.Transport across Caco-2 monolayers of peptides arising from in vitro,digestion of bovine milk proteins[J].FoodChemistry,2013,139(4):203-212.[25] Sanz C L,Sanz Sampelayo M R,Gil E F,et al.Evaluation of the allergenicity of goat milk,cow milk,and their lactosera in a guinea pig model[J].Journal of DairyScience,2009,92(3):837-846.。

THP-1细胞系白血病干细胞的检测、分选及鉴定王颖超;冯磊;殷楚云;魏永纬;马丽娜;王春美;盛光耀【摘要】Aim:To explore whether the human acute monocytic leukemia THP-1 cell line contains leukemia stemrncells ( LSCs ) or not,and to compare the biological properties between LSCs and non-LSCs. Methods:Flow cytometry was used to detect the percentage of LSCs( CD34+ CD38- cell ) in THP-1 , and then the cell cycle of LSCs and non-LSCs was compared. The mRNA expressions of multidrug resistance proteins ( ABCG2, ABCB1 ) and apoptosis gene ( Bcl-2, Bax ) were examined by real time quantitative PCR in two subpopulations. NOD/SCID mice were injected with different subpopu-lations of THP-1 ,and the incidence of leukemia was compared. Results:LSCs almost accounted for ( 0.12 ±0. 06 )% of viable cells in T HP-1, most of which were in rest stage, and the G0/G1 phase cells accounted for ( 94. 03 ± 1. 61 )% . While theS/G2/M phase cells in non-LSCs accounted for ( 56. 58 ± 1. 59 )% . The mRNA expressions of ABCG2, ABCB1 and Bcl-2 in LSCs were higher than those in the non-LSCs ( t = 20.725 ,22. 179 ,13. 707 ,P <0. 001 ). Although there were no differences between these two subpopulations in Bax expression( t = 1. 635 ,P = 0. 071 ); Bcl-2/Bax value in LSCs was significantly higher than that in the non-LSCs ( t = 10. 781 ,P < 0.001 ). The systemic disseminated leukemia model was established successfully by injecting 1 × 103 LSCs in 4 weeks after injection. Non-LSCs requires at least 1 × 106 to establish tumor model. Conclusions:The THP-1 cell line containsLSCs, and the proportion of LSCs is low. Most LSCs stay quiescent and have biological property of stem cells as well as strong tumorigenic property, and they may be associated with tumor resistance and recurrence.%目的:探讨人急性单核细胞白血病THP-1细胞株中是否存在白血病干细胞(LSCs),并比较该LSCs与非LSCs亚群的生物学特性.方法:应用流式细胞术测定THP-1细胞中LSCs(CD34+CD38-细胞)的比例并分析LSCs与非LSCs的细胞周期.实时荧光定量PCR检测2种细胞中ABCG2、ABCB1耐药基因和Bcl-2、Bax凋亡基因的表达.将分选的LSCs移植到NOD/SCID小鼠,观察其致瘤能力.结果:THP-1细胞中存在CD34+CD38-的LSCs,比例为(0.12±0.06)%.大部分的LSCs 处于细胞静止期,G0/G1期比例达(94.03±1.61)%; 非LSCs增殖期细胞比例相对较高,S/G2/M期细胞比例为(56.58±1.59)%.实时荧光定量PCR结果显示:LSCs中ABCG2、ABCB1及Bcl-2的表达水平高于非LSCs (t=20.725、22.179、13.707,P<0.001),Bax在两亚群的表达无差异(t=1.635,P=0.071),但是LSCs Bcl-2/Bax比值高于非LSCs (t=10.781,P<0.001).1×103 数量的LSCs可在4周后形成典型的NOD/SCID小鼠白血病浸润模型,未分选的THP-1细胞至少需要1×106才能成瘤.结论:THP-1细胞株中存在LSCs,这群细胞比例低,大部分处于静止期,具有干细胞生物学活性及体内致瘤性,可能与白血病的耐药和复发有关.【期刊名称】《郑州大学学报（医学版）》【年(卷),期】2013(048)002【总页数】4页(P210-213)【关键词】THP-1细胞;白血病干细胞;ABC转运体;NOD/SCID小鼠【作者】王颖超;冯磊;殷楚云;魏永纬;马丽娜;王春美;盛光耀【作者单位】郑州大学第一附属医院儿科,河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室,郑州,450052【正文语种】中文【中图分类】R733急性白血病(acute leukemia，AL)是起源于造血干细胞的恶性克隆性疾病，发病率较高，在儿童和青少年恶性肿瘤中发病率居首位[1]，其中儿童急性髓细胞白血病(acute myelocytic leukemia，AML)治疗难度较大(除隐性早幼粒细胞白血病外)，虽然目前完全缓解率显著提高[2]，但耐药和复发仍然非常普遍，长期生存率更低[3]。

b细胞抗原递呈的试验方法
B细胞的抗原递呈功能可以通过多种实验方法进行研究和验证，以下是一些常见的试验方法：
1.混合淋巴细胞反应（MLR）：
可以通过体外混合B细胞与带有特定受体的CD4+ T细胞，如果B细胞表面提呈了T细胞识别的抗原肽-MHCⅡ类分子复合物，则会激活相应
的T细胞增殖。

通过检测T细胞增殖或细胞因子释放（如IFN-γ、IL-2
等）来评估B细胞的抗原递呈能力。

2.荧光激活细胞分选（FACS）分析：
用已知抗原处理B细胞后，可以使用荧光标记的特异性抗体来检测B细胞表面MHCⅡ类分子与其结合的抗原肽复合物表达水平，或者检测共
刺激分子如CD80、CD86的变化。

3.抗原肽加载实验：
人工合成含有特定抗原表位的短肽，将这些短肽与纯化的MHCⅡ类分
子体外结合后，再将其加载到B细胞上，随后观察这些加载有抗原肽的B细胞是否能够有效活化对应的CD4+ T细胞。

4.报告基因系统：
利用转基因技术构建报告基因小鼠模型，其中CD4+ T细胞携带报告基因，在与抗原提呈B细胞相互作用时可启动报告基因表达，从而间接证明B细胞的抗原递呈活性。

5.共培养及功能性实验：
将抗原预先刺激的B细胞与T细胞共培养，并监测T细胞分化为效应子细胞（如Th1、Th2、Th17或Treg细胞）的能力，或者其分泌的细胞因子类型和数量。

6.单细胞测序技术：
近年来，单细胞转录组测序等高通量技术也用于解析B细胞在抗原递呈过程中的转录变化，揭示不同亚群B细胞在抗原加工和递呈方面的异质性。

每种方法都有其适用范围和局限性，选择哪种方法取决于研究的具体目标和条件。

禽冠状病毒M蛋白B细胞抗原表位的预测扬帆;邓保国;李淑梅;邹鹏;李进芬【期刊名称】《新乡医学院学报》【年(卷),期】2008(25)6【摘要】目的预测禽冠状病毒(IBV)M蛋白B细胞抗原表位.方法采用SOPMA软件预测IBV M蛋白的二级结构,采用SOSUI软件预测M蛋白的跨膜区,应用Hopp&Woods方案、Janin方案、Zimmerman方案预测IBV M蛋白B细胞表位抗原.结果 IBV M蛋白二级结构主要包括a-螺旋和无规卷曲,含量分别为32.89%、31.11%;M蛋白具有3个跨膜区,位于18～40、48～70、77～99位氨基酸;B细胞识别的表位可能位于第186-196位氨基酸区域内或附近,预测的表位均含有β-转角和无规卷曲结构.结论 IBV M蛋白的二级结构和抗原表位比较稳定,可利用地方毒株的M蛋白制备基因工程疫苗和单克隆抗体,应用于该病的诊断和防治.【总页数】3页(P561-563)【作者】扬帆;邓保国;李淑梅;邹鹏;李进芬【作者单位】新乡医学院微生物学教研室,河南,新乡,453003;新乡医学院微生物学教研室,河南,新乡,453003;河南科技学院化工学院,河南,新乡,453003;新乡医学院基础医学院2005级本科,河南,新乡,453003;新乡医学院形态学实验室,河南,新乡,453003【正文语种】中文【中图分类】S858.315【相关文献】1.SARS冠状病毒M蛋白二级结构和B细胞抗原表位的稳定性分析 [J], 胡族琼;赵卫;龙北国;江丽芳;郭新雄2.SARS冠状病毒M蛋白B细胞抗原表位的原核表达与抗原活性检测 [J], 邹永东;胡章立;王朝岗;张仁利;张闻3.应用因特网对SARS病毒M蛋白B细胞抗原表位的预测 [J], 王新军;吴海玮;张兆松;季旻珺;王勇;吴观陵4.禽呼肠孤病毒σB和σC蛋白二级结构及其细胞抗原表位预测 [J], 黄莉;谢芝勋;谢丽基;邓显文;谢志勤;范晴;罗思思;黄娇玲;曾婷婷5.SARS冠状病毒S基因序列及细胞抗原表位预测 [J], 何凡;郭新雄;赵卫;龙北国;江丽芳;张文炳;晏辉钧;胡族琼因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。