基因敲除小鼠的PCR鉴定

基因敲除鼠鉴定英语Identification of Gene Knockout Mice.Gene knockout mice are valuable tools for investigating gene function and understanding the genetic basis of disease. They are created by inactivating a specific genein the mouse genome, typically using homologous recombination. Once a gene knockout mouse has been created, it is important to confirm that the gene has been successfully inactivated and that the mouse does not have any unintended genetic alterations.There are a number of methods that can be used to identify gene knockout mice, including:PCR: PCR (polymerase chain reaction) can be used to amplify a region of DNA that includes the targeted gene. If the gene has been successfully knocked out, the PCR product will be shorter than the product from a wild-type mouse.Southern blotting: Southern blotting can be used to visualize the DNA fragments that contain the targeted gene. If the gene has been successfully knocked out, the Southern blot will show a different pattern of fragments than the blot from a wild-type mouse.Western blotting: Western blotting can be used to detect the protein product of the targeted gene. If the gene has been successfully knocked out, the Western blot will not show a band corresponding to the protein product of the gene.Immunohistochemistry: Immunohistochemistry can be used to visualize the expression of the targeted gene in different tissues. If the gene has been successfully knocked out, the immunohistochemistry will not show any staining for the protein product of the gene.In addition to these methods, it is also important to perform a variety of other tests to ensure that the gene knockout mouse does not have any unintended genetic alterations. These tests may include:Karyotyping: Karyotyping can be used to visualize the chromosomes of the gene knockout mouse. This test can help to identify any gross chromosomal abnormalities that may have been caused by the gene knockout process.DNA sequencing: DNA sequencing can be used to identify any point mutations or other small genetic alterations that may have been caused by the gene knockout process.Behavioral testing: Behavioral testing can be used to assess the behavior of the gene knockout mouse and to identify any behavioral changes that may have been caused by the gene knockout.By performing a variety of tests, it is possible to identify gene knockout mice that have been successfully created and that do not have any unintended genetic alterations. These mice can then be used to investigate gene function and to understand the genetic basis of disease.Here are some additional details about each of the methods described above:PCR: PCR is a technique that is used to amplify a specific region of DNA. The PCR reaction is carried out in a thermocycler, which heats and cools the reaction mixture in a controlled manner. The heating and cooling steps allow the DNA to denature, anneal, and extend, which results in the amplification of the target DNA sequence.Southern blotting: Southern blotting is a technique that is used to visualize DNA fragments that have been separated by gel electrophoresis. The DNA fragments are transferred from the gel to a nitrocellulose membrane, where they are hybridized to a labeled DNA probe. The labeled probe will bind to complementary DNA sequences on the membrane, which can then be visualized using autoradiography or chemiluminescence.Western blotting: Western blotting is a technique that is used to detect the protein product of a specific gene. The protein sample is separated by gel electrophoresis, andthe proteins are transferred to a nitrocellulose membrane. The membrane is then incubated with a labeled antibody that is specific for the target protein. The labeled antibody will bind to the target protein on the membrane, which can then be visualized using autoradiography or chemiluminescence.Immunohistochemistry: Immunohistochemistry is a technique that is used to visualize the expression of a specific protein in a tissue sample. The tissue sample is fixed and sectioned, and the sections are then incubated with a labeled antibody that is specific for the target protein. The labeled antibody will bind to the target protein in the tissue, which can then be visualized using microscopy.Karyotyping: Karyotyping is a technique that is used to visualize the chromosomes of a cell. The chromosomes are stained and then photographed under a microscope. The karyotype can be used to identify any gross chromosomal abnormalities, such as deletions, duplications, or translocations.DNA sequencing: DNA sequencing is a technique that is used to determine the order of the nucleotides in a DNA molecule. The DNA sample is sequenced using a DNA sequencer, which separates the DNA fragments by size. The order of the nucleotides in the DNA sample is then determined by analyzing the sequence of the DNA fragments.Behavioral testing: Behavioral testing is a technique that is used to assess the behavior of an animal. Theanimal is placed in a controlled environment and its behavior is observed. The behavioral testing can be used to identify any behavioral changes that may have been causedby the gene knockout.By performing a variety of tests, it is possible to identify gene knockout mice that have been successfully created and that do not have any unintended genetic alterations. These mice can then be used to investigategene function and to understand the genetic basis of disease.。

小鼠基因型鉴定方法嘿，你有没有想过，在小鼠这个小小的世界里，科学家们是怎么知道它们的基因类型的呢？这就像是在一个神秘的小宇宙里寻找密码一样有趣呢！今天我就来给大家讲讲小鼠基因型鉴定的方法。

先来说说聚合酶链反应（PCR）吧。

这就像是一个超级放大镜，能把小鼠基因里那些我们想看到的片段放大好多好多倍。

想象一下，小鼠的基因就像是一个超级复杂的拼图，PCR就像是能找到特定几块拼图的魔法工具。

我有个朋友在实验室里做这个，他可有趣了。

他说，“你看啊，这个PCR就像是在基因的海洋里钓鱼，我们设计好特定的引物，就像是特制的鱼钩，专门钓我们想要的那段基因。

”做PCR的时候，要先从小鼠的组织里提取DNA，这就像是从一个装满宝贝的小盒子里拿出最珍贵的东西一样小心翼翼。

提取到的DNA就像是建筑的蓝图，虽然我们看不到整个大厦，但是通过这个蓝图能找到我们想要的部分。

然后把提取的DNA、引物、酶还有一些其他的小助手混合在一起，放到PCR仪这个神奇的小盒子里。

这个PCR仪可不得了，它就像一个魔法厨师，在特定的温度下，一会儿加热，一会儿冷却，让这些东西在里面欢快地反应着。

我曾经好奇地看着这个PCR仪，就想啊，这里面正在发生一场微观世界的狂欢呢！反应结束后，我们就能得到很多很多我们想要的基因片段的拷贝啦。

那怎么知道是不是我们想要的呢？这就需要把这些反应产物跑个电泳。

电泳这个东西啊，就像是一场基因片段的赛跑。

把PCR产物放到凝胶里，通上电，那些基因片段就像一群小运动员一样开始跑起来了。

小的片段跑得快，大的片段跑得慢，最后我们就能看到不同的条带。

如果看到了我们预期的条带，那就像是在比赛里看到自己支持的选手第一个冲过终点线一样兴奋，说明这只小鼠可能就是我们想要的基因型呢！还有一种方法叫基因测序。

这就像是要把小鼠基因这个超级长的故事一个字一个字地读出来。

我问过一个测序的专家，我说：“这得多难啊！”他笑着说：“可不是嘛，但是这就像探索一个未知的宝藏，每一个碱基都是一个小秘密。

《锌指核酸酶介导的小鼠MSTN基因敲除的研究》篇一一、引言随着基因编辑技术的发展，锌指核酸酶（ZFNs）作为一种重要的基因编辑工具，在生物医学领域得到了广泛的应用。

本研究以小鼠为研究对象，利用锌指核酸酶技术对肌肉生长抑制素基因（MSTN）进行敲除，旨在探讨其在肌肉生长和发育过程中的作用。

二、材料与方法1. 材料（1）实验动物：选用C57BL/6小鼠作为实验对象。

（2）锌指核酸酶：根据目标基因序列设计并构建的ZFNs。

（3）实验试剂与仪器：包括基因编辑相关试剂、PCR仪、电泳仪等。

2. 方法（1）ZFNs的设计与构建：根据MSTN基因序列设计锌指核酸酶，并构建成对，以便于切割DNA双链。

（2）小鼠基因组DNA的提取与ZFNs的转导：提取小鼠基因组DNA，将其与ZFNs共转导至小鼠受精卵中。

（3）基因敲除小鼠的筛选与鉴定：通过PCR、 Southern Blot 等方法，筛选并鉴定基因敲除小鼠。

（4）表型分析：对基因敲除小鼠的肌肉生长、体重等表型进行分析。

三、实验结果1. ZFNs的设计与构建成功根据MSTN基因序列设计的锌指核酸酶成功构建，并进行了体外活性检测，证实其具有较高的切割活性。

2. 基因敲除小鼠的成功筛选与鉴定通过PCR、Southern Blot等方法，成功筛选并鉴定出MSTN 基因敲除小鼠，证实了ZFNs介导的基因敲除效果。

3. 表型分析结果（1）肌肉生长：与野生型小鼠相比，MSTN基因敲除小鼠的肌肉生长明显加快，肌肉量显著增加。

（2）体重：MSTN基因敲除小鼠的体重也表现出一定的增长趋势，但与肌肉生长速度相比，体重增长较为缓慢。

四、讨论本研究利用锌指核酸酶技术成功介导了小鼠MSTN基因的敲除，并对其表型进行了分析。

结果表明，MSTN基因的敲除能够促进小鼠的肌肉生长和发育，这为进一步研究MSTN基因在肌肉生长和发育过程中的作用提供了重要的依据。

此外，锌指核酸酶技术作为一种重要的基因编辑工具，在生物医学领域具有广泛的应用前景。

基因鉴定实验步骤PCR基因鉴定1.小鼠剪尾a)取1.5ml EP管，标号。

b)剪小鼠后脚趾做标记（从左往右依次1-10,10以上剪2个脚趾或再剪前脚趾）c)取尾尖部2-5mm2.蛋白消化a)消化液体系：20ul/只，19ul组织消化酶+1ul蛋白酶K（4℃保存）b)根据需要鉴定的小鼠数目计算用量，将两种溶液混匀到一个管后再分装到各支管c)EP管置于浮漂上，56℃水浴，至少3hd)从水浴锅中取出，每管加55-80ul（自定）双蒸水，用手弹匀溶液3.蛋白变性a)EP管置于浮漂上，放在沸水上，电磁炉加热煮沸5min，使蛋白质变性b)离心：12000rpm，5minc)取上清液配PCR体系（可长期冻存于-20℃）4.PCRa)PCR体系：（每只）（根据具体数目计算配mix）（仅供参考，根据实际情况修改）Fast taq buffer 2ul引物0.4ul （引物多个分开加）dNTP 0.4ulddH2O 16.6ulTaq E 0.2ul尾巴提取上清液0.4-1ulb)mix混匀后分装到各PCR管，加入上清液后混匀，消除气泡（快速离心一下）c)放入PCR仪中，调好程序，run5.配胶（1.5% 琼脂糖凝胶）a)0.6g 琼脂糖+ 40ml 1×TAE溶液b)微波炉加热1min，冷却2-3minc)加入EB替代4ul，摇晃均匀d)胶槽中插上梳子，倒入胶液，如有气泡，用1ml枪头刺破e)凝胶20-40min6.上样a)loading buffer + PCR产物b)吹打混匀，上样（双手比较稳）7.跑胶a)电极：黑上红下b)电压：90V，20-40min（跑到1/2-2/3比较合适）8.扫胶。

竭诚为您提供优质文档/双击可除小鼠基因型鉴定原理篇一：小鼠表型鉴定小鼠发育阶段特点出生为红色（若要换窝，要带一点周围的木屑，否则鼠妈不认识）→生后4-5天开始长毛→生后7天剪脚趾和剪尾巴做基因型鉴定→生后10天开眼→生后20天断奶→生后40天可以合笼→怀孕20天后产崽。

小鼠性别判断：雌鼠的后腹部左右两侧有明显的乳头。

小鼠发情判断：雌鼠一般出生后40天开始发情，发情时肛门（或阴道口）为红色。

之后一直处于可以生育阶段。

一般繁殖合笼为一雄配二三雌，一般不将两只雄鼠和一只雌鼠放在一起，因为两只雄鼠会打架。

在做完基因型鉴定之后要尽快把不需要的小鼠处死，因为小鼠太多雌鼠会奶水不足，当雌鼠奶水不足时，会吃掉鼠崽。

小鼠基因型鉴定配方：bufferA0.5meDTA(ph8.0)10mol/Lnaoh双蒸水定容到250mL室温储存100uL625uLbufferbTribase浓盐酸调ph到3.0室温储存40mm步骤：1．小鼠出生7天后剪尾巴（一小点就行），若出生30天后剪耳朵；2．75uLbufferA100℃煮40min，每20min摇一次；3．225uLbufferb12000r/min3min，上清为DnA，跑pcR 鉴定。

篇二：转基因小鼠鉴定实验转基因小鼠鉴定实验在刚出生产出的鼠仔中，属转基因小鼠者，约占全部仔小鼠的20％-30％。

因此，对转基因小鼠必须进行鉴定筛选。

1．转基因整合检测鉴定转基因小鼠最简单的方法是从小鼠尾尖提取基因组DnA，检测其基因型。

检测方法包括pcR和shouthern杂交。

（1）基因组DnA的提取：1）将离乳期小鼠（>4周龄）麻醉标记。

2）用一只手抓住小鼠，另一只手持消毒剪剪下约1cm的鼠尾。

（2）pcR检测：转基因的初始筛选通常采用pcR检测技术。

该技术操作简便、快速、费用低而有效，适合大量标本的分析。

由于该技术特别敏感，可能产生假阳性结果。

因此，在操作过程中必须特别小心，避免质粒DnA或其它标本的基因组DnA的污染。

第1篇一、实验背景基因是生物体内控制遗传信息传递的基本单位，基因突变是生物进化的重要驱动力。

为了研究特定基因的功能，我们采用小鼠作为模型生物，通过基因筛选实验，旨在鉴定和验证与特定表型相关的基因。

二、实验目的1. 构建小鼠基因文库。

2. 通过分子生物学技术筛选与特定表型相关的基因。

3. 验证筛选得到的基因的功能。

三、实验材料1. 实验动物：C57BL/6小鼠。

2. 工具酶：限制性内切酶、DNA连接酶、Taq DNA聚合酶等。

3. 试剂：PCR引物、DNA标记物、DNA探针、克隆载体等。

4. 仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、显微镜等。

四、实验方法1. 构建小鼠基因文库（1）提取小鼠基因组DNA。

（2）使用限制性内切酶切割基因组DNA，获得特定长度的DNA片段。

（3）将切割后的DNA片段连接到克隆载体上，构建小鼠基因文库。

2. 基因筛选（1）根据已知表型，设计特异性引物，用于PCR扩增目的基因。

（2）对小鼠基因文库进行PCR扩增，筛选出与特定表型相关的基因片段。

（3）将筛选得到的基因片段进行测序，确定其序列。

3. 基因功能验证（1）将筛选得到的基因片段克隆到表达载体中，构建重组表达载体。

（2）将重组表达载体转化大肠杆菌，获得表达目的蛋白的菌株。

（3）通过免疫印迹、免疫荧光等技术检测目的蛋白的表达和活性。

五、实验结果1. 成功构建了小鼠基因文库，文库容量达到预期目标。

2. 通过PCR扩增，成功筛选出与特定表型相关的基因片段。

3. 对筛选得到的基因片段进行测序，确定其序列。

4. 通过基因功能验证，成功表达了目的蛋白，并验证了其功能。

六、实验讨论1. 基因筛选实验中，PCR扩增和DNA测序是关键步骤，需要严格控制实验条件，确保结果的准确性。

2. 在基因功能验证过程中，需要选择合适的表达系统和检测方法，以确保目的蛋白的正确表达和活性。

3. 本研究筛选得到的基因可能与特定表型相关，但其具体功能还需进一步研究。

基因编辑小鼠鉴定方法
基因编辑小鼠的鉴定方法主要包括PCR鉴定、测序、电泳结果和Southern Blot验证。

PCR鉴定可以通过设计引物，对目的基因进行扩增，然后通过电泳结果判断是否扩增出目的条带。

测序则是对目的基因进行序列测定，以确认基因编辑是否成功。

电泳结果可以直接观察到目的基因的片段大小和数量，是鉴定基因编辑小鼠的重要手段。

Southern Blot验证则是通过特异探针与目的基因杂交，以检测目的基因的存在和位置。

这些方法可以帮助我们准确地鉴定基因编辑小鼠，从而更好地进行科学研究。

基因敲除小鼠研究方案基因敲除小鼠研究方案一、研究目标：通过基因敲除小鼠研究，探究目标基因在小鼠发育、生长、免疫系统等方面的功能和调控机制。

二、实验设计：1. 基因敲除小鼠模型的构建：选择合适的基因敲除技术，如CRISPR/Cas9系统，通过设计合适的sgRNA（single guide RNA）序列，引导Cas9核酸酶定点切割目标基因的DNA序列。

进而引发DNA修复机制，导致目标基因的插入、缺失或突变。

将CRISPR/Cas9系统构建为可表达载体，转染入小鼠胚胎干细胞中，克隆筛选敲除成功的细胞系。

2. 小鼠胚胎干细胞培养及注射：将敲除成功的小鼠胚胎干细胞注射到早期胚胎中，制备敲除小鼠模型。

养育敲除成功的小鼠。

3. 小鼠品系和样本采集：选择合适的小鼠品系，如C57BL/6小鼠品系。

在小鼠发育、生长、免疫等关键时期，如出生后不同天数、特定时间点等，采集合适的器官或细胞样本。

4. 小鼠表型分析：对敲除小鼠与野生型小鼠进行比较，通过外观、体重、行为、生理指标等方面的观察和实验测定，分析目标基因在小鼠生长发育等方面的影响。

5. 组织学和免疫组化分析：采集目标器官样本，进行组织学和免疫组化实验。

通过病理学检测、免疫组织化学染色等方法，观察目标基因在组织结构和免疫功能调控方面的作用机制。

6. 分子生物学实验分析：采集样本进行基因表达、蛋白质表达水平和分子机制等方面的实验分析，如实时定量PCR、Western blot等方法，研究目标基因对其他基因和信号通路的影响。

7. 数据分析：对实验获得的生物学数据进行统计学和生物信息学分析，建立基因敲除小鼠模型的相关数据库，以及通过差异分析、基因功能注释等方法，进一步探究目标基因的功能和相关调控网络。

三、预期结果：通过上述研究方案，可以获得目标基因敲除小鼠模型，并通过多个方面的分析来研究该基因对小鼠生长发育、组织结构、免疫系统等方面的功能和调控机制。

预期结果包括但不限于：敲除小鼠的表型差异和诱导的特异性疾病模型；目标基因调控的重要信号通路；基因与其他相关基因间的调控网络等。

条件性敲除小鼠定义：条件性基因敲除小鼠（也叫Flox小鼠）是指在目的基因中含有成对的loxp位点的小鼠，与Cre工具小鼠交配后可在特定的组织或细胞中敲除目的基因。

CKO如何实现？重组酶系统（如：Cre-loxP）介导的位点特异性重组技术。

Cre是重组酶（38kDa），可识别34bp 长的DNA 序列loxP。

loxP 两侧各13bp 构成回文结构，中间8bp为非回文结构，因此loxp具有方向性。

（当DNA 分子上存在两个同向loxP 序列时，Cre可将两个loxP 序列之间的DNA 片段切出并环化，同时将loxP 两侧的序列进行连接；当DNA 分子上存在两个方向相反的loxP 序列时，Cre 可导致loxP 之间的序列发生反转。

）CKO敲除的是什么？条件性基因敲除的靶基因中必须带有可以被Cre 重组酶识别的loxP 序列，这种基因称为floxed gene。

带有floxed 靶基因的小鼠称为flox 小鼠。

在这种小鼠中，通常采用DNA 同源重组方法，在拟敲除基因片段的两侧分别放置一个同向的loxP 位点。

loxP 位点的存在应不影响该基因的功能，故选择对照为flox/flox小鼠CKO敲除何时何地发生？除了flox 小鼠以外，重组酶系统介导的条件性基因敲除还需要另一类重要的基因工程小鼠的参与——Cre 工具鼠。

Cre 工具鼠中，将Cre 重组酶的编码序列置于特定的基因启动子下，Cre 的表达特性决定了靶基因何时何地发生敲除。

Cre 在哪一种组织细胞中表达，靶基因的敲除就发生在哪种组织细胞；Cre 的表达水平将影响靶基因在此种组织细胞中进行修饰的效率；使用诱导型Cre 重组酶可以通过给予诱导剂，决定在特定的发育时期或疾病发生阶段，定时地进行基因敲除。

（范衡宇老师课件）实验时，将flox 小鼠和Cre 工具鼠进行交配，最后获得flox 纯合且Cre 杂合的小鼠。

在这类小鼠中，凡是表达Cre 的细胞，两个loxP 之间的序列被切除，从而实现组织特异性基因敲除。

基因敲除小鼠的实验流程1.设计基因敲除小鼠实验方案在开始实验之前，需要明确研究目的，确定需要敲除的基因，并设计相应的实验方案。

一般可以使用 CRISPR-Cas9 系统来实现基因敲除，在设计基因敲除实验方案时，需要选择合适的 sgRNA 序列，以及设计恰当的引物用于检测突变。

2.获得基因敲除小鼠的胚胎干细胞为了实现基因敲除，需要获得基因敲除小鼠的胚胎干细胞。

一种常用的方法是利用胚胎干细胞对外源DNA的高度易感性，将敲除基因的质粒DNA转染到小鼠胚胎干细胞中。

3.筛选敲除基因的胚胎干细胞株系将转染了敲除基因的胚胎干细胞以悬浮培养的方式进行培养，培养一段时间后，利用一定的筛选条件来筛选出含有敲除基因的胚胎干细胞株系。

筛选条件可包括对抗生素的使用或筛选标记基因的表达。

4.制备敲除基因小鼠的固定胚胎干细胞系通过体外培养，将敲除基因的胚胎干细胞系定植在培养皿上，培养数代以后，将其冻存，以备后续的实验使用。

5.实施敲除基因小鼠的胚胎干细胞基因改造将固定的胚胎干细胞系重新激活，转染 Cas9 和 sgRNA，利用CRISPR-Cas9 系统使这些细胞具有敲除基因的突变。

6.识别敲除基因的胚胎干细胞阳性克隆株对转染了 Cas9 和 sgRNA 的胚胎干细胞进行筛选，通过 PCR、Western blot、Southern blot等技术方法识别出敲除了目标基因的阳性克隆株。

7.将敲除基因的胚胎干细胞注入小鼠的早期胚胎取出已受精的小鼠卵母细胞，利用显微操作将敲除基因的胚胎干细胞注入到小鼠的早期胚胎中。

利用体外受精或者通过体内或体外的胚胎移植方式将基因敲除干细胞注入受体小鼠。

8.制备基因敲除小鼠的嵌合小鼠将已注入敲除基因的胚胎干细胞的受体小鼠进行嵌合以产生基因敲除小鼠。

嵌合可以通过体内或体外的胚胎移植方式进行。

9.筛选识别基因敲除小鼠对产生的嵌合小鼠进行筛选，确认敲除基因是否成功。

可以通过 PCR、Western blot、Southern blot等技术方法对小鼠体细胞或组织进行分析。

apcmin小鼠的鉴定方案APCmin小鼠的鉴定方案APCmin小鼠是一种常用的遗传模型，用于研究癌症发生和治疗。

APC基因是调控肠道上皮细胞增殖和分化的关键基因，而APCmin 小鼠则是通过敲除APC基因而产生的小鼠模型。

鉴定APCmin小鼠的方法主要包括基因分型和表型特征分析两个方面。

进行基因分型。

由于敲除APC基因导致小鼠体内发生多种遗传突变，因此需要通过PCR扩增和DNA测序来确认APC基因的缺失情况。

一般可以设计一对特异性引物，扩增包含APC基因缺失位点的DNA片段，然后将扩增产物进行测序分析，确认APC基因的缺失。

进行表型特征分析。

APCmin小鼠在肠道肿瘤的形成上具有明显的表型特征，主要包括多发的肠道腺瘤和结肠腺癌。

因此，可以通过解剖学检查和组织病理学分析来鉴定APCmin小鼠是否具有肠道肿瘤。

一般可以观察小鼠的肠道形态，如肠道长度、肠道腺瘤的数量和大小等，然后取相应的组织样本进行组织切片和染色，进一步确认肠道腺瘤和癌变的程度。

除了基因分型和表型特征分析，还可以结合其他辅助方法来鉴定APCmin小鼠。

例如，可以通过免疫组化染色来检测APCmin小鼠肠道中关键信号通路的活性，如Wnt信号通路的活性，进一步揭示肠道肿瘤的发生机制。

此外，还可以进行遗传连锁分析，确定APCmin小鼠是否具有其他遗传突变，如肿瘤抑制基因p53的突变等。

在鉴定APCmin小鼠时，需要注意一些技术细节。

首先，要保证实验动物的纯合性，即确保APC基因的双等位突变。

其次，要选择合适的对照组，通常选择野生型小鼠作为对照组，以比较肠道肿瘤的发生率和表型特征。

此外，要注意标本的处理和保存，以保证实验结果的准确性和可重复性。

总结起来，APCmin小鼠的鉴定方案主要包括基因分型和表型特征分析两个方面。

通过PCR扩增和DNA测序可以确定APC基因的缺失情况，而通过解剖学检查和组织病理学分析可以确认肠道肿瘤的发生。

此外，还可以结合其他辅助方法来进一步揭示肿瘤的发生机制。

基因敲除小鼠的实验流程
基因敲除是一种常用的功能基因研究方法，通过使特定基因失去功能，从而研究该基因在生物体发育、生理功能、疾病机理等方面的作用。

在此，我将详细介绍基因敲除小鼠的实验流程。

1.设计敲除基因的策略：
2.构建敲除载体：
根据设计好的敲除策略，研究者需要构建敲除载体。

敲除载体一般包
括两个主要部分：敲除目标基因的DNA序列和荧光蛋白报告基因的DNA序列。

为了实现高效的基因敲除，敲除目标基因的DNA序列应当与目标细胞
染色体上的同源序列高度相似。

荧光蛋白报告基因的DNA序列可以用来监
测基因敲除的效果。

研究者可以使用聚合酶链式反应(PCR)等技术来合成
敲除载体的DNA序列。

3.DNA传递和胚胎干细胞培养：
4.敲除载体导入胚胎干细胞并筛选：
将构建好的敲除载体导入胚胎干细胞，可以使用电穿孔、转染等方法
将外源DNA转入胚胎干细胞。

导入后，筛选出带有敲除载体的胚胎干细胞。

研究者可以利用荧光蛋白报告基因来筛选出携带敲除基因的胚胎干细胞。

5.胚胎干细胞的胚胎注射和小鼠的获取：
将携带了敲除载体的胚胎干细胞通过微注射的方式注入小鼠早期胚胎
的内腔。

这些胚胎随后继续发育，最终产生带有敲除基因的小鼠。

6.培养和分析经过敲除的小鼠：
获得敲除基因的小鼠之后，研究者可以将其培养至成年，然后对其进行各种生理、行为等方面的分析。

通过与野生型小鼠进行比较，可以了解基因敲除对小鼠的影响和功能。

条件性基因敲除⼩⿏的繁育策略
要获得条件性基因敲除⼩⿏⾄少需要两步遗传杂交。

第⼀步，将GeneX-Cre杂合⼦⼩⿏与GeneY-flox杂合或纯合⼦⼩⿏交配，获得的Cre与flox双阳性（GeneX Cre/wt; GeneY lox/wt）⼦代⼩⿏。

第⼆步，将Cre与flox双阳性（GeneX Cre/wt;GeneY lox/wt）⼦代⼩⿏再与GeneY-flox 杂合或纯合⼦⼩⿏交配，获得所需的GeneX Cre/wt; GeneY lox/lox⼩⿏为实验组。

⼀般对照组为同窝GeneX wt/wt; GeneY lox/lox⼩⿏。

如果Cre的整合破坏内源基因，那么应选择GeneX Cre/wt;GeneY wt/wt⼩⿏作为对照。

条件性基因敲除的常规育种策略。

在进⾏基因型鉴定的时候，不仅要对⼩⿏⿏尾进⾏基因鉴定，对特异性⽬标组织也需要进⾏基因型检测。

这时需要设计PCR引物⽅便区分野⽣型等位基因、flox等位基因和重组后的KO等位基因。

在⿏尾鉴定时，如果发现重组后的KO产物，那么需要考虑该组织特异性Cre⼩⿏的⽣殖系表达问题。

条件性基因敲除的基因型鉴定引物设计⽰意图。

之后需要检测重组后靶基因的mRNA和蛋⽩表达，来验证Cre-lox系统的⼯作效果。

根据靶基因与lox位点的位置，可以设计qPCR模板或者探针来检测重组后的靶基因转录情况。

进⼀步可以通过免疫组化检测条件性基因敲除后靶基因蛋⽩翻译是否缺失或异常。

不过这很⼤程度上依赖于探针或抗体的灵敏度和特异性。